将扩增产物1.5 kb的5126片段连入pEASY-T5载体中，获得载体命名pT5126。
[0063]以pCUMsl为模板扩增Msl片段，所用引物如下: oligol3:5， - atgaccggcggcggccgcgg
oligol4 - ctggcatgccggatcctcacctgcaggcgctgctcttg 以pCAMBIA2300-Ub1-0cs为模板扩增Ocs片段，所用引物如下: oligol5:5， - ctgcaggtgaggatccggcatgccagggctctcaatg oligol6:5’ - ccggcggccgctagcgtctagatcaatcagtaaattg aacggagaata
将得到的PCR产物各取I比I混合做模板，以引物oligol3和oligol6进行overlapPCR扩增，得到Msl和Ocs融合的片段Ms1-Ocs，将该片段用NotI酶切和胶回收。
[0064]将质粒ΡΤ5126用NotI酶切和去磷酸化处理，然后进行胶回收。将以上两个片段进行连接，得到pT5126Ms0cs。
[0065]) pT5126Ms0csDam载体的构建(含有Dam基因表达盒)
以pMD18-Zml3-Dam-Pin II为模板扩增Dam表达盒片段，所用引物如下:oligol7:5’ - ccgtctagagctgccatttaatgattctatat (下划线为 XbaI 酶切位点)oligol8:5，- ggcgctagcgaattcggccgcattcgcaaaacacac (下划线为 NheI 酶切位点)将以上扩增产物Dam基因表达盒片段用XbaI和NheI酶切，质粒pT5126Ms0cs同样XbaI和NheI酶切，以上酶切产物胶回收后连接得到pT5126Ms0csDam。
[0066])构建pMCSO 104载体
用EcoRI酶切步骤2得到的质粒pCLCAA，酶切产物再经去磷酸化处理；将步骤4得到的PT5126Ms0csDam用EcoRI酶切。以上两种产物分别胶回收，连接获得重组载体pMCS0104。PMCS0104包含5个表达盒，如图9所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Msl的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒(α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒)，以及颜色标记基因mCherry的表达盒。pMCS0104载体图谱见图10。pMCSO 104载体的专利保藏号为CGMCC N0.10444，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，100101 ;生物保藏的分类命名:大肠埃希氏菌(fccAericAia coW);保藏日期:2015年I月27日。
[0067]实施例2:多控不育载体pMCSO 101、pMCSO 103和pMCS0104的应用 1、多控不育载体转化农杆菌参照AN(Methods in Enzymology (1987) 153:292-305)方法，将本发明所构建的多控不育载体 pMCS0101、pMCS0103 和 pMCS0104 转化到农杆菌 EHA105(Hood et al., TransgenicRes(1993)2:208-218)中。
[0068]取1~2 μ g质粒，加到100 μ L于冰上溶化的农杆菌ΕΗΑ105感受态细胞中，冰浴30 Hiin0置于液氮中迅速冷冻I分钟，移入37°C水浴中5 min ;迅速冰浴2 min后将加入100yL YEB液体培养基，于28°C，转速为200 rpm条件下培养2~4 hr，涂于含50 mg/L的利福平(Rifampicin)和100 mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的固体YEB平板上培养2~3天。长出单菌落后，挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒。将以上质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到单菌落后接种LB培养基培养，然后提取质粒。用限制性内切酶酶切质粒验证，如图4、7和图11所示，酶切结果表明多控不育载体pMCSOlOl、pMCSO 103和pMCS0104构建正确。
[0069]、多控不育载体的玉米转化流程和植株的再生
将insl突变体纯合的雄性不育植株与来自玉米Hi II植株的花粉杂交、回交数代之后，该/^7等位基因渐渐渗入易于转化的Hi II玉米种质。
[0070]按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的上述具有玉米杂合等位基因的玉米Hi II的幼胚与本实施例所述的农杆菌共培养，以将本实施例构建的多控不育载体pMCSOlOl中的T-DNA (包含4个表达盒)、pMCSO 103中的T-DNA (包含5个表达盒)或pMCSO 104中的T-DNA (包含5个表达盒)转入到玉米基因组中，获得了转基因玉米植株。
[0071]对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离幼胚(见图12-1)，用农杆菌悬浮液侵染幼胚(见图12-2)，其中农杆菌能够将所述介导植物雄性育性的构建体传递至幼胚的细胞(步骤1:侵染步骤)。在此步骤中，幼胚浸入农杆菌悬浮液(OD6m=0.4~0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、鹿糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L，ρΗ5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养(见图12-3) —段时期(3天)(步骤2:共培养步骤)。幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)中至少存在一种已知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)(步骤3:恢复步骤)。幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养(见图12-4)，导致转化的细胞选择性生长(步骤4:选择步骤)(见图12-5)。然后，愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物再生成植物(步骤5:再生步骤)(见图 12-6)0
[0072]筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养至约1cm高，移至温室培养至结实(见图12-7和12-8)。在温室中，每天于28°C下培养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0073]、转基因玉米植株的PCR阳性鉴定
取温室培养的转化阳性候选玉米植株的叶片，用PlantGen DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用质粒载体特异引物Bar基因引物进行PCR鉴定，同时以非转基因玉米DNA作为阴性对照，以多控不育载体质粒作为阳性对照。
[0074]Bar基因引物序列如下:
01igol9 (Bar-F):5’ - ctcgagtctaccatgagcccagaac01igo20 (Bar-R):5’ - ctcgagtcaaatctcggtgacgggca
图13为部分转基因植株的PCR鉴定。从图13可以看出，在检测的转多控不育载体的21株转基因候选株中，有10株是转化阳性植株。
[0075]、转基因植株在RNA水平的鉴定
将以上基因组DNA检测为阳性和阴性的转基因玉米植株分别随机挑取7株(编号1- 7)和3株(编号8 - 10)进行RNA水平的检测。首先提取上述10棵玉米植株的叶片RNA，并反转录成cDNA。分别以RNA和cDNA为模板，用上述Bar基因引物进行PCR扩增，抗除草剂基因表达盒的表达水平和玉米Actin基因作为内标参照基因表达示意图见图14，引物序列如下:
01igo21 (Actin-F): 5’ - AAATGACGCAGATTATGTTTGA01igo22 (Actin-R): 5’ - GCTCGTAGTGAGGGAGTACC
图14表明检测的10株植株的RNA均没有基因组的污染；编号1- 7的植株检测到Bar基因的表达，这和基因组DNA的PCR阳性检测结果一致，表明在DNA水平检测阳性的植株都有除草剂抗性基因的表达。
[0076]、Real time PCR验证转基因玉米植株
取上述DNA水平和RNA水平检测为阳性的转基因玉米植株MsI(Tq)的叶片约10mg作为样品，用PlantGen DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Bar基因和IVR基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0077]检测BAR基因和IVR基因拷贝数的具体方法如下:
取转基因玉米植株Msl和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
使用PlantGen DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定上述样品的基因组DNA浓度；调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80_100ng/μ I ；
采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是:
以下引物和探针用来检测BAR基因序列:
01igo21:5’ - TCACTCGGGATGACGATGG ；01igo22:5’ - TGCCACCAGACAGTGTCCG ；
Probel:5，- ccgagccgcaggaaccgcaggag (焚光基团 5，6_FAM;3，TAMRA)；
以下引物和探针用来检测IVR基因序列:
01igo23:5’ - TGGCGGACGACGACTTGT ；
01igo24:5’ - AAAGTTTGGAGGCTGCCGT ；
Probe2:5’ - CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC (荧光基团 5’ CY5;淬灭基团 3’ BHQ-2)。
[0078]PCR 反应体系为:50