冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒的制作方法

专利名称：冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒的制作方法
冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒优先权声明本申请要求提交于2008年2月29日的美国临时申请号61/067，596，提交于2008 年10月9日的美国临时申请号61/195,747，以及提交于2008年5月16日的日本申请号 2008-129745的优先权，这些公开的内容在此处全部并入本文作为参考。序列列表随本文一并提交书写形式的及计算机可读形式的序列列表。计算机可读形式记录 的信息与书写形式的序列列表是相同的。
背景技术：
在研究领域，将DNA的合成用于多种目的。其中，除了化学合成短链DNA如寡聚核 苷酸之外，通过使用了 DNA聚合酶的酶促方法进行DNA合成中的大部分。PCR可在体外容易 地扩增所需要的核酸片段，有极高的价值，并已经成为生物学、医学、农业和其他领域中不 可缺少的工具。在由PCR扩增DNA的过程中，许多情况下都要求反应的高特异性。尽管开 发了新型DNA聚合酶，也优化了反应混合物的组成以减少非-特异性扩增，但是仍然需要对 PCR扩增特异性的改进。除了使用DNA作为模板材料的传统PCR方法之外，还可使用RNA-依赖的DNA聚合 酶逆转录酶实现DNA的合成。在研究领域中，常常有必要分析衍生自多种基因的mRNA分子。 逆转录酶使得用RNA作为模板合成cDNA的逆转录反应成为可能，并且因此，已经在对mRNA 分子的分析上实现了卓越的进步。通过在克隆技术和PCR技术的应用，其中使用了逆转录 酶的mRNA分子的分析现在在遗传学研究中是不可缺少的实验技术，并且已经成为多种领 域如生物学、医学、农业中绝对必要的技术。迄今已经产生了一些手段以改进逆转录反应的反应性，例如，已经研究了在高温 下进行的逆转录反应过程；在其中使用了逆转录酶以及具有3’ -5’外切核酸酶活性的酶的 cDNA合成过程(JP专利号3910015)；其中使用了核酸-结合蛋白质如Ncp7、recA、SSB及 T4gp32的过程(WO 00/55307)；等等。尽管有一些对逆转录反应的反应性的改进，然而可能 无法合成全长的cDNA，并且甚至在如今，有些情况下所合成的cDNA的量可能不足。因此，对 逆转录反应的反应性的改进仍然是正进行的大事，必须要进一步改进。除了对上文描述的两种DNA合成方法的改进之外，在科学领域还需要可以确定内 切核糖核酸酶的切割位点特异性的技术。例如，mRNA干扰酶为存在于广泛的细菌基因组中 的毒素-抗毒素系统编码的序列-特异性内切核糖核酸酶。这些内切核糖核酸酶通常具有 单链RNA内的特异性切割位点大肠杆菌(E. Coli)MaZF在ACA序列处特异性切割，ChpBK 在ACY序列处(Y为U、A或G)特异性切割，来自质粒R100的PemK在UAH序列处(其中H 为C、A或U)特异性切割，来自结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的MazF-mtl和MazF_mt6 分别在UAC和U富含区域特异性切割。最近，有发现来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的MazF同源物在VUUV’处进行切割(其中V和V’为A、C或G，且可以相同或不相 同)。然而确定分支结核杆菌的一些MazF同源物的切割特异性的之前尝试却失败了。尤其 是对于确定其中识别长于三个碱基的特异性序列的切割特异性，使用足够长以覆盖所有可能的靶标序列的RNA底物是至关重要的。使用长RNA作为底物的一个主要问题在于尽管其 为单链RNA，却形成非常稳定的二级结构。为了使用这种或任何其他长RNA作为内切核糖核 酸酶的底物，必须解折叠其二级结构。因此，还有对开发用以确定内切核糖核酸酶如mRNA 干扰酶的切割-位点特异性的新技术的需要。在多种微生物体内发现有冷休克蛋白质，人们认为其在对生长温度下移的适 应中起到一些作用。其中，已经鉴定CspA为一种主要的冷休克蛋白质。从大肠杆菌 (Escherichia coli)中分离出编码CspA的基因，并使用其基因产生了重组CspA(见TO 90/09444)。然而，冷休克蛋白质的常规提出的应用限于其作为冷冻保护蛋白质的用途，其 保护农田中不受冷冻或霜冻损害。本发明提供了用于改进的DNA合成反应(具有改进的反应性)的包含冷休克蛋白 质的组合物，使用这些组合物用于合成DNA的方法，在这些方法中使用的试剂盒，以及通过 这些方法产生的组合物。本发明进一步提供用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的包含冷休 克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法，以及在这 些方法中使用的试剂盒。发明概述根据本发明，提供了使用DNA聚合酶用于DNA合成的组合物，使用这种组合物用于 合成DNA的方法，用于这种DNA合成方法的试剂盒，以及根据所提供这种方法合成的DNA组 合物。本发明的一个目标是使得使用DNA聚合酶进行DNA合成成为可能，其中反应的反应 性得到改进。本发明的一个实施方式涉及用于DNA合成的组合物，其包含冷休克蛋白质和DNA 聚合酶。在本发明的特定实施方式中，作为此冷休克蛋白质的示例为CspA或其同源物，优 选地，为衍生自大肠杆菌的CspA或其同源物。组合物可包含超过0. 5 y g的CspA每25 y L 组合物。根据这种实施方式的组合物可包含两种或多种DNA聚合酶。进一步地，根据这种 实施方式的组合物可包含至少一种引物和至少一种脱氧核苷酸。这种组合物可进一步包括 液体媒介物，如反应缓冲溶液。本发明的一个进一步的实施方式包含A)冷休克蛋白质；B)至少一种选自DNA聚 合酶、引物、脱氧核苷酸、和DNA的组分；以及C)液体媒介物。本发明的一个进一步的实施方式涉及合成DNA的方法，其包括步骤:A)制备包含 冷休克蛋白质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷三磷酸、和DNA的混合物；以 及B)孵育步骤A)中制备的混合物。本发明的另一个实施方式涉及用于DNA合成的试剂盒，其包含冷休克蛋白质和 DNA聚合酶。根据这种实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物或关于如何使用试剂盒 的纸质或电子形式的说明书。这种试剂盒的组分可单独地或分开地存在。本发明还涉及由包括以下步骤的方法合成的DNA组合物A)制备包含冷休克蛋白 质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷的混合物、和DNA;以及B)孵育步骤A)中 制备的混合物。本发明还涉及有利地用于逆转录反应的组合物，使用所述组合物的cDNA合成方 法，有利地用于逆转录反应的试剂盒，以及由此方法合成的cDNA组合物。根据本发明，可实 现这种令人满意的逆转录反应，其在特异性、合成链的长度、合成量等等方面是出众的。
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本发明的一个实施方式涉及用于逆转录反应的组合物，其包含冷休克蛋白质或其 同源物；和逆转录酶。在根据本发明的这种实施方式中，冷休克蛋白质的实例是CspA或其 同源物，CspA的一个实例为衍生自大肠杆菌的CspA。在一些实施方式中，CspA可以从大约 0.5ug-大约20 y g CspA每20 y L的组合物的量存在。逆转录酶的实例为衍生自莫洛尼鼠 类白血病病毒的逆转录酶和/或衍生自禽成髓细胞瘤病毒的逆转录病毒的逆转录酶和/或 其组合。进一步地，根据本发明的此实施方式中的组合物可进一步包含至少一种引物和至 少一种脱氧核苷酸。组合物的进一步的实施方式包含液体媒介物，如反应缓冲溶液。其他 实施方式包含寡聚(dT)引物或具有随机序列的寡聚核苷酸引物或其组合。本发明的一个进一步的实施方式包含用于逆转录反应的组合物，其包含A)冷休 克蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、脱氧核苷酸、和RNA的组分；以及C)液体媒介 物。本发明的一个进一步的实施方式涉及用于合成cDNA的方法，包括:A)制备包含冷 休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷、和RNA的混合物；以及B)孵育步 骤A)中制备的混合物。本发明的一个进一步的实施方式包含用于逆转录反应的试剂盒，包含A)冷休克 蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、脱氧核苷酸、和RNA的组分；以及C)液体媒介物。 根据这个实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物或关于如何使用试剂盒的纸质或电 子形式的说明书。这种试剂盒的组分可单独地或分开地存在。这个实施方式的试剂盒可进 一步包含用于进行基因扩增反应的试剂。本发明进一步涉及由包括以下步骤的方法合成的cDNA组合物A)制备包含冷休 克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷、和RNA的溶液；以及B)孵育步骤 A)中制备的溶液。本发明进一步涉及用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的组合物，使用这些组合物 用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法以及用于这些方法的试剂盒。本发明的一个实施方式涉及用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的组合物，A)冷休 克蛋白质；以及B)至少一种选自RNA底物和内切核糖核酸酶的组分。在根据本发明的这种 实施方式中，冷休克蛋白质的实例为CspA或其同源物，CspA的一个实例是衍生自大肠杆菌 的CspA。在优选的实施方式中，RNA底物长于1024个碱基并含有大约相等数量的每种碱 基。这种RNA底物的一个实例为细菌噬菌体MS2RNA。这种实施方式的组合物可进一步包含 液体媒介物。本发明的另一个实施方式涉及用于确定内切核糖核酸酶切割位点的方法，其包括 步骤A)制备包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内切核糖核酸酶的混合物；以及B)孵育步骤 A)中制备的混合物。这种方法可进一步包括通过电泳分析混合物。本发明的一个进一步的实施方式涉及用于确定内切核糖核酸酶切割位点的试剂 盒，其包含冷休克蛋白质和RNA底物。此实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物，如反 应缓冲溶液。此实施方式可进一步包含关于如何使用试剂盒的纸质或电子形式的说明书。在这 种实施方式中，冷休克蛋白质和RNA底物可单独或组合存在。如本文使用的，冷休克蛋白质为那些在暴露于生长温度下移引起的冷休克时在生物体，尤其是微生物体中表达的蛋白质的集体名称。当大肠杆菌的孵育温度从37°C降低到 15°C时，会高水平地瞬时表达叫做CspA的冷休克蛋白质。已知大肠杆菌有八种不同的蛋 白质，CspB-CspI，其与CspA具有高的氨基酸序列同一性。在这些蛋白质中，CspB、CspG和 Cspl为冷休克蛋白质。进一步地，通常已知这些冷休克蛋白质的同源物存在于其他微生物 如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) (CspB)、热溶芽孢杆菌(Bacillus caldolyticus) (CspB)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima) (CspB, CspL)禾口胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum) (CspL)。在本发明中，CspA的同源物指的是具有显示与衍生自大肠杆菌的CspA 的氨基酸序列至少50%的序列同一性的氨基酸序列的冷休克蛋白质。在本发明中，可使用 这些冷休克蛋白质。在本发明中使用的冷休克蛋白质的实例优选地为CspA，更优选地是衍 生自革兰氏_阴性细菌的CspA，甚至更优选地是衍生自大肠杆菌的CspA。可通过重组DNA 技术或从微生物体中分离而制备本发明中使用的CspA。同源物指的是与目标蛋白质具有序列同源性的实体，优选地显示与另一种多肽的 氨基酸序列有至少50%的序列同一性，并且在结构特征或生物学功能上具有相似性。如本文使用的，脱氧核苷酸指的是通过磷酯键键合于脱氧核糖的磷酸基团，所述 脱氧核糖键合于有机碱基。天然DNA包括四种不同的核苷酸。这些核苷酸分别由可在天 然DNA中找到的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基构成。腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸 腺嘧啶碱基分别缩写为A、G、C和T。脱氧核苷酸包括游离的单磷酸、二磷酸和三磷酸(更 具体地，磷酸基团的每种包含一个、两个或三个磷酸部分)。因此，脱氧核苷酸包括脱氧核 苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dITP、dGTP和dTTP)及其衍生物。脱氧核苷酸衍生物包括 [a S]dATP,7-deaza-dGTP,7-deaza-dATP以及显示出针对核酸分解的抗性的脱氧核苷酸衍 生物。脱氧核苷酸衍生物包括例如，以这样的方式标记的脱氧核苷酸，可以通过放射性同位 素如32P或35S、荧光部分、化学发光部分、生物发光部分或酶检测到。如本文使用的，脱氧核苷酸三磷酸指的是这样的核苷酸，其糖部分由脱氧核糖组 成，并具有三磷酸基团。天然DNA包括四种不同核苷酸，其分别具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶 和此胸腺嘧啶作为碱基部分。本发明组合物中包含的脱氧核苷酸三磷酸为四种脱氧核苷酸 三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。在本发明中，还可使用脱氧核苷酸三磷酸的衍 生物。脱氧核苷酸三磷酸衍生物包括[ S]dATP，7-deaza-dGTP、7-deaza_dATP和显示了针 对核酸消化的抗性的脱氧核苷酸衍生物。核苷酸衍生物还包括，例如，以这样的方式标记的 脱氧核苷酸，可以通过放射性同位素如32p或35s、荧光分子、化学发光分子、生物发光分子或 酶检测到。如本文使用的，反应缓冲溶液指的是包括缓冲试剂或缓冲试剂混合物的溶液，可 进一步包括二价阳离子和单价阳离子。在本文使用的术语“或”(例如A或B)的范围内，意指“A或B或二者”。如本文使 用的，术语“一个”或“一种”或“这个”的使用不旨在对量进行限制。例如，详述的说明书中 参考的“一种冷休克蛋白质”不旨在指“单一冷休克蛋白质”，且这种参考可包含任何单一冷 休克蛋白质或多个冷休克蛋白质。附图简述

图1示例说明在CspA存在或不存在时，由Taq DNA聚合酶扩增的DNA片段的琼脂 糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳Hindlll-消化的XDNA。
图2示例说明在CspA存在或不存在时，由用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物扩增 的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳Hindlll-消化的X DNA。图3示例说明在CspA存在或不存在时，由a -型DNA聚合酶扩增的DNA片段的琼 脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳Hindlll-消化的XDNA。图4示例说明在CspA存在或不存在时，从多种靶标序列扩增的DNA片段的琼脂糖 凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳lOObp梯度标记物(ladder marker，由TAKARA BIO INC 制造)。图5示例说明在热_处理的或非热处理的CspA存在时，由用于LA-PCR的DNA聚 合酶混合物扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。在以“M”标记的泳道电泳lOObp梯度 标记物。图6为示例说明CspA发挥的抑制非_特异性延伸产物的作用的附图。图7为示例说明CspA发挥的抑制非_特异性延伸产物的作用的附图。图8为示例说明CspA发挥的抑制非_特异性延伸产物的作用的附图。图9为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。图10为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。图11为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。图12为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。图6-12中M 标注了将2. 5 ii L的\ -Hindlll消化产物(由TAKARABI0 INC.制造)标记物进行电泳的 泳道。图13为示例说明CspA发挥的改进逆转录反应反应性的作用的附图。图13中M 标注了将2. 5 ii L的\ -Hindlll消化产物(由TAKARABI0 INC.制造)标记物进行电泳的 泳道。图14描绘了 MS2RNA的二级结构以及CspA的MazF-mt3的内切核糖核酸酶活 性的增强。图 14A 描绘了由 MF0LD(http://bioweb. pasteur. fr/seqanal/interfaces/ mfold-simple. html)预测的MS2ssRNA的二级结构。37°C下的最小折叠能为-1460. 69kcal/ 摩尔。箭头指示由引物延伸分析鉴定的MazF-mt3的切割位点，蓝点箭头指示引物延伸分析 没有检测到的MazF-mt3的预测切割位点。图14B描绘了通过RNA伴侣分子CspA对内切核 糖核酸酶活性的增强。在37°C下，使用(泳道3、4、5和6)或不使用(泳道1和2)纯化的 N-末端加His-标签的MazF-mt3,使用(泳道2和5，32 y g ；泳道4,16u g ；泳道6,64u g) 或不使用(泳道1和3)纯化的CspA蛋白质，进行部分消化全长MS2 mRNA。消化反应混合 物(10 u 1)由 1. 6 ii g 的 MS2RNA 底物，1. 6 ii g 的 MazF_mt3 (His) 6，16、32 或 64 ii g 的 CspA 及 10mMTris-HCl (pH7. 8)中 0. 5 ii 1 的 RNase 抑制剂(Roche)构成。反应产物在 1. 2% (lx TBE)琼脂糖凝胶上进行电泳。图15A-H描绘了使用(His)6MazF-mt3对MS2 RNA的体外切割，显示MazF_mt3特异 性地在UUC⑶位点处进行切割。泳道1代表了对照反应，其中没有加入蛋白质；泳道2，其中 只加入CspA蛋白质的对照反应；泳道3，MS2RNA只与(His) 6MazF_mt3 ；泳道4，MS2 RNA与 (His)6MazF-mt3和CspA蛋白质一同孵育。在RNA序列上以箭头指示切割位点，并使用右边 显示的RNA梯度(ladder)确定这些位点。在图15H中，将RNA梯度精简到C(碱基3390) 和G(碱基3394)残基之间，但是通过比较上游和下游区域与标准序列阐明了序列。
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图16A-D描绘了使用(His)6MizF-mt3对MS2 RNA的体外切割，显示MazF_mt3特 异性地在⑶C⑶位点处进行切割。泳道1，其中没有加入蛋白质的对照反应；泳道2，其中只 加入CspA蛋白质的对照反应；泳道3，MS2 RNA仅与(His)6MazF_mt3 —同孵育；泳道4，MS2 RNA与(His)6MaZF-mt3和CspA蛋白质一同孵育。在RNA序列上以箭头指示强的和弱的切 割位点，并且使用右边显示的RNA梯度确定这些位点。图17A-0描绘了使用(His)6MaZF-mt7对MS2 RNA的体外切割。泳道1，其中没有 加入酶的对照反应；泳道2，其中只加入了 CspA蛋白质的对照反应；泳道3，MS2 RNA仅与 (His)6MazF-mt3 — 同孵育；泳道 4，MS2 RNA 与(His)6MazF_mt3 和 CspA 蛋白质一同孵育。在 RNA序列上以箭头指示强的和弱的切割位点，并且使用右边显示的RNA梯度确定这些位点。发明详述(1)根据本发明的、用于使用DNA聚合酶的改进的DNA合成的组合物本发明的组合物包含冷休克蛋白质或其同源物和DNA聚合酶。惊人地，与不存在 冷休克蛋白质的DNA合成反应相比较，在使用包含冷休克蛋白质和DNA聚合酶的反应混合 物的情况下，DNA合成反应的反应性有所改进。在本发明中，尽管没有具体的限制，上文的DNA合成方式的反应性改进指的是减 少非_特异性扩增，增加衍生自靶标序列的扩增产物的量，等等。可通过以常规方法分析反 应混合物中合成的产物而对些改进进行定量，所述常规方法如在琼脂糖胶上进行电泳。根据本发明的DNA合成方法，抑制了 DNA的非-特异性合成。常规地，已经知道应 当将DNA合成的反应混合物保持在低温直到反应开始，以防止非_特异性反应的发生。使 用根据本发明的组合物使得可以直接使用置于室温的混合物进行DNA合成反应。没有特别地限制可用于本发明的DNA聚合酶；然而，优选的是热稳定性DNA聚合 酶。作为可用于本发明的DNA聚合酶，示例的是衍生自真细菌如属于栖热菌属(Thermus)或 芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌的DNA聚合酶(衍生自粞热水生菌(Thermus aquaticus), 热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)等等的DNA聚合酶)，衍生自古细菌如属于种属 火球菌属(Pyrococcus)或热球菌属(Thermococcus)的DNA聚合酶(衍生自激烈火球菌 (Pyrococcus fyriosus),Thermococcus litralis,thermococcus kodakaraensis等白勺DNA 聚合酶)。在本发明的DNA合成方法中，优选的是可用于PCR的热稳定DNA聚合酶。在本发明的组合物中可包含两种或更多种DNA聚合酶。例如，可在本发明中使用 具有3’ - > 5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和另一种基本上不具有3’ - > 5’外切核酸 酶活性的DNA聚合酶。使用这种DNA聚合酶组合的技术被称为LA-PCR(长而精确的PCR)。除了冷休克蛋白质和DNA聚合酶之外，根据本发明的组合物可进一步包含至少一 种引物、至少一种脱氧核苷酸三磷酸、和/或反应缓冲溶液。引物是具有与模板DNA互补的核苷酸序列的寡聚核苷酸。只要其能在本发明使用 的反应条件下与模板DNA退火，则关于引物没有特定的限制。由于进行的是特异性退火过程，引物长度优选的为至少六个核苷酸，更优选地至 少10个核苷酸。根据寡聚核苷酸的合成，引物长度优选地为至多100个核苷酸，更优选地 至多30个核苷酸。可通过已知方法化学合成寡聚核苷酸。寡聚核苷酸可为衍生自天然来 源的寡聚核苷酸，例如，可通过以限制性内切酶消化从天然来源制备的DNA而进行制备。本发明的组合物可用于制备由DNA聚合酶进行的DNA合成的混合物。包括冷休克蛋白质的用于DNA合成反应的组合物或包含冷休克蛋白质的DNA合成反应加速剂也是本发 明的实施方式。(2)根据本发明的、用于使用DNA聚合酶的改进的DNA合成的方法本发明的用于合成DNA的方法包括步骤A)制备包含冷休克蛋白质或其同源物、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧 核苷酸三磷酸、和作为模板的DNA的混合物；以及B)孵育步骤A)中制备的混合物。与不存在冷休克蛋白质时的DNA合成反应相比，通过本发明的方法，DNA合成反应 的反应性有所改进。作为模板的DNA指的是在引物与此DNA退火时，DNA可用作DNA延伸的模板。用 于本发明方法的混合物可包含单一模板或具有不同序列的多种模板。分别使用特异性模板 的引物对可同时获得对应于各自模板的产物。这种多种模板可以以相同DNA或不同DNA分 子存在。作为模板的DNA可为双链DNA，单链DNA或DNA-RNA杂合体。没有特别限制本发明使用的冷休克蛋白质的量，其可为每25μ 1的反应混合物超 过0. 5 μ g，优选地为2-15 μ g,更优选地为5-12 μ go没有特别限制本发明使用的DNA聚合酶的量。例如，其可与常规DNA合成中使用 的量相同。用于PCR的DNA聚合酶的优选的量是本领域技术人员已知的。通常地，在使用 衍生自粞热水生菌的DNA聚合酶的PCR情况下，使用每25 μ 1反应混合物0. 125-5U的DNA
聚合酶。在本发明中，根据每种DNA聚合酶产品的说明书提出商业可得的DNA聚合酶的活 性。例如，通过使用具有50 μ 1终体积的混合物(含有25mM TAPS (25°C下为pH9. 3)，50mM氯 化钾，2mM氯化镁，ImM β -巯基乙醇，dATP、dGTP和dTTP各200 μ Μ,以及100 μ M的[α -32Ρ] dCTP)确定DNA聚合酶的活性。将一单位(下文描述为“1U”)的DNA聚合酶活性定义为 “能够在74°C下，30分钟内将IOnmol的dNTP并入酸-不可溶性物质的酶量”。没有特别限制本发明的方法中使用的各引物的量，其可以为0.05-2 μ M。在本发明优选的实施方式中，通过DNA扩增方法，如PCR来进行DNA合成。(3)根据本发明的、用于使用DNA聚合酶的改进的DNA合成的试剂盒根据本发明的试剂盒包含冷休克蛋白质以及DNA聚合酶。只要其可用于上文的 DNA合成方法，则不会特别地限制本发明试剂盒。可以为用于标记核酸的试剂盒，用于PCR 的试剂盒，用于估计核酸的试剂盒，用于定点诱变的试剂盒等等。除了热休克蛋白质和DNA聚合酶之外，本发明的试剂盒可进一步包含至少一种引 物、至少一种脱氧核苷酸三磷酸、和/或反应缓冲溶液。可使用上文项目(1)中所描述的作 为试剂盒的组分(热休克蛋白质、DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸三磷酸、和/或反应缓冲溶 液)。试剂盒可以以各组分作为独立的组分存在的状态或以其中一些组分结合的状态 包含上述组分。在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含上文(1)中描述的本发明的组合 物。(4)根据本发明的、用于使用逆转录酶的改进的cDNA合成的组合物根据本跟发明的组合物包含冷休克蛋白质和逆转录酶。惊人地，与单独使用逆转
11录酶的逆转录反应相比，其中使用含有冷休克蛋白质和逆转录酶的反应组合物的情况下， 逆转录反应的反应性有所改进。没有特别地限制在逆转录反应的反应性上所检测到的改进；然而，其选自反应特 异性的改进、核酸合成的量的增加、和合成链的长度的增加。本发明对于合成长链cDNA的 逆转录反应尤其有利，并使得所合成的cDNA的量增加。进一步地，可以减少非_特异性cDNA 的合成。常规地，认为高温下使用热_抗性逆转录酶的逆转录反应对于长链cDNA的合成有 效(例如，见WO 01/92500)。根据本发明，可以不进行高温的逆转录反应而有效地合成长链 cDNA。本发明还对高温逆转录反应适用，且相应地改进了其中使用多种酶的逆转录反应。在根据本发明的组合物中所期望的CspA的可能作用为改进反应特异性和通过抑 制低温下的错误引发而增加扩增产物的量，以及通过解开RNA 二维结构而获得的延伸的改 进和扩增产物量的增加。只要其具有逆转录活性——即合成与用作模板的RNA互补的DNA的活性，则可在 本发明中使用任何逆转录酶。逆转录酶的实例为衍生自病毒的逆转录酶，如衍生自莫洛尼 鼠类白血病病毒的逆转录酶(衍生自MMLV的逆转录酶)，衍生自禽成髓细胞瘤病毒的逆转 录酶(衍生自AMV的逆转录酶)，以及衍生自真细菌的逆转录酶如衍生自栖热菌属细菌的 DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶，等等)和衍生自芽孢杆菌属的嗜热细菌的DNA聚合酶(Bca DNA聚合酶，等等)。优选地使用衍生自病毒的逆转录酶，在本发明中更优选地使用衍生自MMLV的逆 转录酶。进一步地，只要其具有逆转录活性，本发明还可使用修饰成为天然-衍生氨基酸序 列的逆转录酶。除了热休克蛋白质和逆转录酶之外，根据本发明的组合物可包括至少一种引物、 至少一种脱氧核苷酸、和/或反应缓冲溶液。引物可为具有与模板RNA互补的核苷酸序列的寡聚核苷酸，只要其在所使用的反 应条件下与模板RNA退火，就对其没有特别的限制。引物可为寡聚核苷酸如寡聚(dT)或具 有随机序列的寡聚核苷酸(随机引物)。由于进行的是特异性退火过程，则引物长度优选地为至少6个核苷酸，更优选地 至少10个核苷酸。根据寡聚核苷酸的合成，引物长度优选地为至多100个核苷酸，更优选地 至多30个核苷酸。例如，可根据亚磷酰胺方法由DNA合成仪394(由Applied Biosystems 制造)合成此寡聚核苷酸。可根据任何其他过程，如三酯磷酸方法，H-膦酸方法，或硫代磷 酸盐方法合成寡聚核苷酸。寡聚核苷酸可为衍生自生物学标本的寡聚核苷酸，例如，可从制 备于天然标本的DNA的限制性内切核糖核酸酶消化物中分离而制备。作为本发明的一个实施方式，还涉及到用于逆转录反应的包含冷休克蛋白质的组 合物中的每种，以及用于逆转录反应的包含冷休克蛋白质的反应物加速剂。(5)根据本发明的、用于使用逆转录酶的改进的cDNA合成的过程本发明提供了用于合成cDNA的过程，其中根据本发明的组合物包括步骤A)制备包含冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷酸、和用 作模板的RNA的溶液；以及B)孵育步骤A)中制备的溶液。与其中使用了不包含冷休克蛋白质的组合物的过程相比，根据本发明的此cDNA合成过程，逆转录反应的反应性有所改进。可通过例如检查所合成的cDNA的量的链长度而估计逆转录反应的反应性的改进。可由这样的方式检查通过逆转录反应获得的合成的cDNA的量，在逆转录反应后， 对特定量的反应溶液进行实时PCR以定量所合成的靶标核酸的量。与逆转录反应中使用不 包含冷休克蛋白质的组合物的情况相比，在使用根据本发明的组合物进行逆转录反应的情 况下所合成的cDNA的量有所增加。可通过确定PCR中获得的扩增产物的量而验证由逆转录反应获得的合成cDNA的 长度，所述PCR中使用从逆转录反应中使用的引物引发区域下游附近产生不同扩增链长度 的不同引物对中的一个引物对，以及逆转录反应后一定量的反应溶液。与逆转录反应中使 用不包含冷休克蛋白质的组合物的情况相比，在使用了根据本发明的组合物的情况下，所 合成的长链cDNA的量有所增加。作为模板的RNA是这样的RNA，当引物与其杂交时可用作来自此引物的逆转录反 应的模板。根据本发明的组合物包含一种模板或多种具有不同核苷酸序列的不同模板。当 使用用于具体模板的特异性引物时，可从核酸混合物中多种的不同模板产生引物延伸产 物。多种模板可存在于不同核酸或相同核酸中。RNA是本发明可应用的一种模板，对其没有特别限制。RNA的实例为样本中所 有RNA中的一组RNA分子，如mRNA、tRNA和rRNA的一组RNA分子，或RNA分子的特定组 (例如，具有共同核苷酸序列基序的一组RNA分子，RNA聚合酶的转录物，通过削减方法 (subtraction process)浓缩的一组RNA分子)，以及能够产生在逆转录反应中使用的引物 的任意RNA。在本发明中，用作模板的RNA可包括在衍生自生物体如细胞、组织或血液的样本， 或如可能含有生物体的食物、土壤或废水的样本中。进一步地，RNA可包括在根据常规方法 加工这样的样本或诸如此类而获得的包含核酸的制备物中。制备物的实例为均质化细胞， 均质化细胞分级所获得的标本，样本中的所有RNA，或一组特定的RNA分子，例如，富含mRNA 的标本，等等。没有特别地限制要在根据本发明的方法中使用的冷休克蛋白质的量。在用20 μ L 反应溶液进行逆转录反应的情况下，优选地，其量为0. 5-20 μ g，更优选地1-10 μ g，甚至更 优选地为2-5 μ g。没有特别地限制要在根据本发明的方法中使用的逆转录酶的量。例如，可使用在 常规逆转录反应中使用的量。例如，在其中使用衍生自MMLV的逆转录酶和20 μ L反应溶液 的逆转录反应的情况下，反应溶液中逆转录酶的量在考虑cDNA合成效率时优选地为至少 10U,更优选地至少100U，甚至更优选地为至少200U。在常规方法中，有必要根据模板RNA 的量以及所合成cDNA的长度来调整逆转录酶的量，以避免多余量的逆转录酶产生任何可 能的抑制作用，然而这种调整在根据本发明的方法中是不必要的。本发明的说明书中列举的逆转录酶的活性是基于任何商业可得的逆转录酶的活 性。例如，IU是以多聚(rA) 寡聚(dT)12_18用作引物-模板时在37°C下10分钟之内并入 Inmol 的[3H]dTTP 的活性。没有特别限制根据本发明的方法中所使用的引物浓度。在逆转录反应中使用了特异性引物的情况下，浓度优选地为至少0. 1 μ Μ，在逆转录反应中使用寡聚dT引物的情况 下，浓度优选地为至少2. 5μΜ，在逆转录反应中使用了随机引物的情况下，浓度优选地为至 少5 μ Μ，以使从模板RNA合成cDNA最大化。在常规过程中，有必要根据模板RNA的量以及 所合成cDNA长度来调整引物的量，以避免逆转录反应中由引物过量太大所产生的任何可 能的抑制作用，然而这种调整在根据本发明的方法中是不必要的。合适地，根据本发明的cDNA合成方法包括A)通过将CspA、逆转录酶、至少一种核糖核苷酸、至少一种引物、和用作模板的 RNA混合而制备反应组合物的步骤；以及B)在适宜于合成与模板RNA互补的引物延伸链的条件下孵育步骤A)中制备的反 应组合物。没有特别限制适宜于合成与模板RNA互补的引物延伸链的条件。温度范围的实 例为30°C -65°C，优选地为37-50°C，更优选地为42°C _45°C。优选的反应时间段的实例为 5min-120min，更优选地为15min-60min。根据本发明的cDNA合成方法，可以控制或减少将 反应溶液置于任何不满足前述温度范围的温度而产生的非-特异性引物延伸链的合成。因 此，根据本发明的cDNA合成方法在例如由于处理大量的待检查样品而要求长的时间段以 制备反应溶液的cDNA合成中尤其有利。在进行其中将由根据本发明的方法所获得的cDNA用作模板的核酸扩增反应时， 就能够扩增cDNA。没有特别限制核酸扩增反应。其一个优选的实例为聚合酶链式反应 (PCR)。(6)根据本发明的、用于使用逆转录酶的改进的CDNA合成的试剂盒根据本发明的试剂盒包含冷休克蛋白质和逆转录酶。根据本发明的试剂盒，可以 实现能够达到高反应性的逆转录反应。只要其是为用于逆转录反应而设计的，就不会特别 地限制根据本发明的试剂盒。一个优选的实例为用于进行体外逆转录反应的试剂盒。更特 定的实例为用于核酸标记的试剂盒、用于RT-PCR的试剂盒、用于cDNA合成的试剂盒、用于 引入定点诱变的试剂盒。除了冷休克蛋白质和逆转录酶之外，根据本发明的试剂盒可包含至少一种引物、 至少一种脱氧核糖核苷酸、作为模板的核酸和/或反应缓冲溶液。关于冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸、作为模 板的核酸和/或反应缓冲溶液，其部分或全部可作为混合物包含在试剂盒中，或其各自可 作为单一组分分开包含在试剂盒内。根据本发明的试剂盒可进一步包含用于进行在其中将由逆转录反应所获得的 cDNA用作模板的基因扩增(例如，PCR)的试剂。试剂的实例为热-抗性DNA聚合酶、反应 缓冲溶液、至少一种脱氧核糖核苷酸、和至少一对引物。根据本发明的试剂盒中包含的冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种 脱氧核糖核苷酸、作为模板的核酸和/或反应缓冲溶液的实例为如先前在上文所提到的。(7)根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割-位点的组合物根据本发明的组合物包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内切核糖核酸酶。在确定识 别长于三个碱基的特异性序列的内切核糖核酸酶的切割特异性时，关键的是要使用长足以 覆盖所有可能的靶标序列的RNA底物；例如，假定RNA含有等量的每种碱基，RNA底物应当
14长于1024个碱基(=45)以包含所有可能的五碱基切割位点。优选地，可使用由3569个碱 基构成并具有几乎平均的碱基含量(26% G,23% A、26% C和25% U)的噬菌体MS2RNA作 为用于确定切割特异性的底物。然而，在使用这些长RNA作为底物中的主要问题是，尽管其为单链RNA，却形成了 极其稳定的二级结构(见图14A)，妨碍了切割。因此，为了使用这些长RNA作为内切核糖核 酸酶底物，必须去折叠其二级结构。本发明采用了冷休克蛋白质以去折叠这些长RNA底物的二级结构。通过去折叠这 些二级结构，冷休克蛋白质增加了可切割的RNA的量，因此有助于确定内切核糖核酸酶切 割位点。优选地，冷休克蛋白质的浓度为至少.43mM或否则足以完全饱和RNA底物。mRNA干扰酶为本发明可采用的内切核糖核酸酶的一个实例，但是只要其能够切割 单链RNA，就不会特别限制这些内切核糖核酸酶。(8)根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割-位点的方法根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割-位点的另一个方法包括步骤A)制备包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内切核糖核酸酶的混合物；以及B)孵育步骤A)中制备的混合物。通过本发明的此方法，可确定内切核糖核酸酶的切割特异性。冷休克蛋白质通过 阻止RNA中二级结构的形成而增强内切核糖核酸酶对RNA底物的切割。优选地，将混合物在37°C下孵育15分钟。如实施例17中描述的，可通过引物延伸 分析，对切割位点进行体外分析。(9)根据本发明的、用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的试剂盒根据本发明的试剂盒包含冷休克蛋白质和RNA底物。根据本发明的试剂盒，可通 过将目的内切核糖核酸酶与试剂盒的组分一同孵育而确定内切核糖核酸酶的切割位点。只 要其是为用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点而设计的，则不特别地限制根据本发明的试剂
品.ο
实施例以下实施例更详细地示例说明本发明，但是并不解释为限制本发明的范围。分别 基于各逆转录酶所附的说明书而示出以下实施例中列举的各逆转录酶的活性。制备实施例 制备CspA溶液和酶储存缓冲液根据“S. Chatterj ee 等人，Journal of Biochemistry (J. Biochem.), 1993,114, 663-669”中描述的方法表达并纯化CspA，然后制备2 μ g/μ L CspA溶液(2 μ g/ μ L CspA, 20mM 的 Tris-HCl (pH7. 8(4°C )，IOOmM 的 NaCl，ImM 的 EDTA，ImM 的 DTT，以及 50% 甘油)， 5 μ g/ μ L CspA 溶液(5 μ g/ μ L CspA, 20mM 的 Tris-HCl (pH 7. 8 (4°C )，IOOmM 的 NaCl，ImM 的 EDTA，lmM 的 DTT，以及 50% 甘油)，以及 14. 8μ g/μ L CspA 溶液(14. 8 μ g/μ L CspA, 20mM 的 Tris-HCl (4°C 时 pH 7. 8)，IOOmM 的 NaCl，ImM 的 EDTA，ImM 的 0ΤΤ，以及 50% 甘油)。进一步地，制备不包括CspA的酶储存缓冲液(20mM的Tris-HCl (pH 7. 8 (4°C )， IOOmM 的 NaCl，ImM 的 EDTA，ImM 的 DTT，以及 50%甘油)。使用前述制备实施例中制备的酶储存缓冲液，作为以下实施例中提到的酶储存缓
15冲液。使用前述制备实施例中制备的2 μ g/μ L CspA溶液作为实施例6-11中使用的CspA 溶液，使用前述制备实施例中制备的5 μ g/ μ L CspA溶液作为实施例12-13中使用的CspA 溶液，并使用前述制备实施例中制备的14.8yg/yL CspA溶液作为实施例1-5中使用的 CspA溶液。菌株和质粒使用大肠杆菌BL21(DE3)进行重组蛋白质表达。从pET_28a(Novagen)构建质粒 pET-28a-MazF-mt3 和 _mt7 以分别表达(His)6MazF_mt3 和 _mt7。在大肠杆菌中纯化加(His)6标签的MazF_mt3和MazF_mt7使用Ni-NTA 树脂(Qiagen)从携带 pET-28a-MazF_mt3 和 MazF_mt7 的菌株 BL21(DE3)中纯化在 N-末端加(His) 6 标签的 MazF_mt3 和 MazF_mt7。实施例1使用TaKaRa Taq所附的反应缓冲溶液，根据TaKaRa Taq的说明书在冰上制 备终体积为25微升的PCR混合物，其含有5ng或50ng的人基因组DNA (由Clontech Laboratories, Inc.制造)、用于扩增p53基因的2kb DNA片断的正向引物(SEQ ID NO 1) 和反向引物(SEQ ID NO 2)各 lOpmol.O. 625U 的 TaKaRa Taq(Taq DNA 聚合酶；由 TAKARA BIO INC.制造)。分别向上述混合物中加入2、4、6、8、10、12或14yg的CspA。此外，制备 不包含CspA的混合物作为对照。将这样制备的每种混合物在25°C下孵育30min。然后进行30个循环的PCR，其中 的一个循环包括由98°C，10秒-55°C，30秒_72°C，2分钟构成的过程。在反应终止后，在
的琼脂糖凝胶上电泳3μ 1的每种样品，并测定每种混合物中扩增产物的长度和量。如图1中显示的，在不包含CspA的混合物中没有发现长度为2kb的产物，并且观 察到了由于非-特异性扩增产生的多种长度的产物。相反，分别在含有4-14 μ g CspA的混 合物中清楚地观察到2kb产物。在含有6-14 μ g CspA的混合物中产物的量比其他混合物 中大。结果证明了 CspA减少了由在PCR前将混合物置于室温产生的非-特异性扩增。实施例2进一步地，进行与实施例1中所描述的相同的实验，除了 DNA聚合酶由TaKaRa Taq 换成了 TaKaRa Ex Taq (用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物由TAKARA BIO INC.制造)。使 用用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物得到基本上相同的结果。在含有6 μ g CspA或更多的 混合物中观察到产物的量有所增加(见图2)。实施例3使用Pyrobest DNA聚合酶所附的反应缓冲溶液，根据PyrobestDNA聚合酶的说 明书在冰上制备终体积为25 μ 1的PCR混合物，其含有5ng或50ng的人基因组DNA(由 Clontech Laboratories, Inc.制造)、用于扩增p53基因的2kb DNA片断的正向引物(SEQ ID NO 1)和反向引物(SEQ ID NO 2)各 IOpmol、0. 625U 的 Pyrobest DNA 聚合酶(α-型 DNA聚合酶；由TAKARA BIO INC.制造)。分别向上述混合物中加入0. 5、1、2、4、6、8、10、12 或14 μ g的CspA。此外，制备不包含CspA的混合物作为对照。将这样制备的每种混合物在25°C下孵育30min。然后进行30个循环的PCR，其中 的一个循环包括由98°C，10秒-60°C，30秒_72°C，2分钟构成的过程。在反应终止后，在
的琼脂糖凝胶上电泳3μ g的每种样品，并测定每种混合物中扩增产物的长度和量。结果显示于图3。在不包含CspA的混合物中，除了长度为2kb的产物之外还观察到显著量的多种长 度的产物。在含有2yg CspA或更多的混合物中，观察到的无CspA时的非-特异性扩增有 所减少，2kb产物的量有所增加。结果显示，CspA还减少了使用α -型DNA聚合酶的PCR中的非-特异性扩增。实施例4使用TaKaRa ExTaq所附的反应缓冲溶液，根据TaKaRa ExTaq的说明书在冰上 制备终体积为25 μ g的PCR混合物，其分别含有50ng的人基因组DNA，0. 625U的TaKaRa ExTaq, IOyg的CspA以及用于扩增TP53基因的575bp片断的引物对(SEQ ID NO 3和 4)、用于扩增Bcl2基因的591bp片断的引物对(SEQ ID NO :5和6)、用于扩增EGFR基因的 52Ibp片断的引物对(SEQ ID NO 7和8)、用于扩增CDK9基因的380bp片断的引物对(SEQ ID N0:9和10)、用于扩增FFAR2基因的IOlObp片断的引物对(SEQ ID N0:11和12)、用于 扩增IRSl基因的520bp片断的引物对(SEQ ID N0:13和14)或用于扩增GAP基因的460bp 片断的引物对(SEQ ID NO :15和16)的引物对。此外，制备不包含CspA的混合物作为对 照。将这样制备的每种混合物在两种不同条件下进行30个循环的PCR。在条件1下， 一个循环包括由98°C，10秒-53°C，30秒_72°C，30秒构成的过程。在条件2下，一个循环 包括由98°C，10秒-60°C，30秒-72°C，30秒构成的过程。在反应终止后，在1 %的琼脂糖凝 胶上电泳3 μ g的10种样品的每种，并分析混合物中的扩增产物。以上反应中使用的所有引物具有超过70°C的Tm值，因此，它们倾向于引起非-特 异性扩增。事实上，在没有CspA时，条件1下扩增的特异性显著低。然而，在有CspA存在 时，在条件1和2下扩增的各种混合物中只观察到所期待的产物(见图4)。结果显示，CspA具有增加PCR扩增的特异性的能力，并可扩大用于核酸特异性扩 增的退火温度的范围。实施例5制备两等份含有10μ g/mlCspA的溶液，其中一份在98°C下处理5分钟。制备具有 与实施例4中显示的相同组成，但含有10 μ g如此制备的热-处理或非热_处理的CspA的 PCR混合物。在条件1下将每种如此制备的混合物进行30个循环的PCR。在反应终止后检 查各种混合物中扩增产物时，在热_处理和非热_处理CspA之间没有观察到差异。结果显 示于图5。此结果表示CspA的高的热稳定性。实施例6证实使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，来自PolyA以外的非-特异性延伸产 物(背景)的量。在冰上使用PrimeScript (注册商标)RTase (由TAKARA BIO INC.制造)制备用于 合成cDNA的20 μ L逆转录反应溶液，其中使用1 μ g的人心脏总RNA (由Clontech制造)作 为模板，以及寡聚dT (终浓度2. 5 μ M)。除了 PrimeScript (注册商标)RTase所附的说明书 中列举的逆转录反应溶液组成之外，然后在所制备的逆转录反应组合物中包括2yg CspA0 作为对照，还制备了不包含CspA的逆转录反应溶液，其中加入了 1 μ L的酶储存缓冲液以代 替CspA。下一步，将这些这样制备的逆转录反应溶液置于冰上0-20分钟，此后加热到95°C以灭活逆转录酶。然后，为确定置于冰上0-20分钟的每种溶液产生的cDNA的量，用2μ L 各反应溶液进行实时PCR，靶标是距离肌营养不良蛋白基因(GenBank登记号ΝΜ_004006)的 PolyA大约7kb远的区域的139个碱基(6529-6667)的链，以及PolyA附近长度为6，930个 碱基(6529-13458)的链。使用SYBR (注册商标)Premix Ex Taq (由TAKARABIO INC.制造)，根据其附的 说明书中推荐的条件进行靶向139个碱基的实时PCR，其中使用具有SEQ ID NO :17中 所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :18中所示核苷酸序列的引物作为引物。使用 PrimeSTAR(注册商标)GXL(由 TAKARABIO INC.制造)和 SYBR(注册商标)Green I (由 TAKARABIO INC.制造)，进行靶向6，930个碱基的长链实时PCR，其中使用具有SEQ ID NO: 17中所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO :19中所示核苷酸序列的引物作为引物。根 据PrimeSTAR(注册商标)GXL所附说明书中列举的高速PCR操作流程的反应溶液组成来制 备实时PCR的反应溶液，除了加入SYBR(注册商标)Green I使得终浓度为χ 0.33。进一 步地，在98°C下孵育10秒之后进行实时PCR，条件为40个循环，其中98°C 5秒_68°C 2分 钟组成一个循环。在此说明书的任何逆转录实施例中，使用Thermal Cycler Dice (注册商 标)Real time system TP 800 (由 TAKARABIO INC.制造)进行实时 PCR。进一步地，通过 序列稀释质粒的方式产生标准曲线，其中将包含前述区域的13，542个碱基(173-13714)的 cDNA克隆于pUC118的HincII位点。因此，不管CspA在逆转录反应中的存在或不存在，都没有检测到来自PolyA附近 的6，930个碱基的长链cDNA产物。当将溶液置于冰上更久时，在不包含CspA的溶液中距 离PolyA大约7kb远的区域中139bp cDNA的量有所增加。在包含CspA的逆转录溶液的情 况下，相同区域中cDNA的量几乎没有增加，并且置于冰上20分钟的溶液中合成的cDNA的 量为不包含CspA的反应溶液的1/40 (图6)。由于未发现来自PolyA附近的6，930个碱基 的长链cDNA产物，表示在冰上制备并放置逆转录反应溶液时，距离PolyA大约7kb远的区 域中139bp的cDNA产物不是延伸自PolyA的产物，而是来自PolyA以外的非-特异性延伸 产物。这种非-特异性衍生产物可为获得具有全长的cDNA中的背景。非-特异性延伸产 物抑制从RNA的PolyA到5’末端的延伸反应，并且增加不具有全长的cDNA合成产物。在本实施例中，证实了在冰上制备并放置逆转录反应溶液时，逆转录反应溶液中 的CspA可几乎完全抑制来自不同于PolyA的非-特异性延伸产物(背景)的合成。实施例7证实使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，来自PolyA以外的非-特异性延伸产 物(背景)的量根据类似于实施例6的方法确定CspA的作用，除了使用superscript 111 RTase (由Invitrogen Corporation制造)根据其所附的说明书代替了 PrimeScript (注册 商标)RTase，制备包含2 μ g CspA的20 μ L逆转录反应溶液和不包含CspA的20 μ L逆转录 反应溶液。superscript III RTase为衍生自MMLV的逆转录酶的变体。结果是，在SuperScript III RTase用作逆转录酶的情况下，不管CspA存在或不 存在，都未检测到来自PolyA附近的6，930个碱基的长链cDNA产物。当将溶液置于冰上更 久时，距离PolyA大约7kb远的区域中139bp的合成cDNA的量在不包含CspA的溶液中有 所增加。在包含CspA的逆转录溶液的情况下，相同区域中的cDNA的量几乎没有增加，并且置于冰上20分钟的溶液中合成的cDNA的量为不包含CspA的反应溶液的1/87 (图7)。因 此，证实了在冰上制备并放置逆转录反应溶液时，尽管使用了 superscript III RTase作为 逆转录酶，逆转录反应溶液中的CspA可几乎完全抑制来自不同于PolyA的非-特异性延伸 产物(背景)的合成。实施例8证实在使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，来自PolyA以外的非-特异性延伸 产物(背景)的量根据类似于实施例6的方法确定CspA的作用，除了使用Reverse Transcriptase XL (AMV)(由 TAKARABIO INC.制造)代替了 PrimeScript (注册商标)RTase 制备包含 1 μ L 的 1 μ g/ μ L 人心脏总 RNA (由 Clontech 制造)、1 μ L 的 50 μ M 寡聚 dT、1. 6 μ L 各 2. 5mM 的 dNTP 混合物、2 μ L 的 Reverse Transcriptase XL (AMV)缓冲液、0. 5 μ L 的 40U/ μ L 核酸酶 抑制剂、0. 8 μ L 的 25U/ μ L Reverse Transcriptase XL (AMV)以及 1 μ L 的 2 μ g/ μ L CspA 的20 μ L逆转录反应溶液和不包含CspA的20 μ L逆转录反应溶液。逆转录酶XL(AMV)为 衍生自AMV的逆转录酶。结果是，在Reverse Transcriptase XL(AMV)用作逆转录酶的情况下，不管反应溶 液中CspA存在或不存在，都未检测到来自PolyA附近的6，930个碱基的长链cDNA产物。 当将溶液置于冰上更久时，距离PolyA大约7kb远的区域中139bp的cDNA的量在不包含 CspA的溶液中有所增加。在包含CspA的逆转录溶液的情况下，相同区域内中的cDNA的量 几乎没有增加，并且置于冰上20分钟的溶液中合成的cDNA的量为不包含CspA的反应溶液 的1/84(图8)。因此，证实了在冰上制备并放置逆转录反应溶液时，尽管使用了衍生自AMV 的逆转录酶，逆转录反应溶液中的CspA可几乎完全抑制来自PolyA以外的非-特异性延伸 产物(背景)的合成。实施例9在使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，对长链cDNA合成反应的抑制根据类似于实施例1的方法，使用PrimeScript (注册商标)RTase (由TAKARABIO INC.制造)制备包含2 μ g CspA的20 μ L逆转录反应溶液以及不包含CspA的20 μ L逆转 录反应溶液。将所制备的溶液置于冰上0-20分钟，并在42 °C下进行逆转录反应30分钟，然 后在95°C加热5分钟，然后停止反应。根据类似于实施例6的方法，将2μ L的分别的反应 溶液进行靶向来自肌营养不良蛋白基因的PolyA附近的6，930个碱基的长链的实时PCR，这 样对从逆转录反应合成的cDNA的量进行定量。结果是，在不包含CspA的反应溶液中，与完全没有将溶液置于冰上相比，在溶液 置于冰上20分钟的情况下来自PolyA附近的6，930个碱基的长链延伸产物的量减少到 52%。在包含CspA的反应溶液中，尽管将其置于冰上20分钟，所合成的cDNA的量却完全没 有减少(图9)。看起来是因为反应溶液中CspA几乎完全抑制了来自PolyA以外的非-特 异性延伸反应，所以获得了 CspA的作用，而且PolyA没有抑制延伸反应。从获得的结果中证实了反应溶液中CspA使得对反应溶液制备后对逆转录反应必 要的时间量的关注变得不必要，并可实现达到了高质量的cDNA合成反应，其中来自PolyA 的cDNA合成的背景很少，而且非常可能具有全长。实施例10
19
在其中使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，对长链cDNA合成反应的抑制2根据类似于实施例9的方法进行测试，除了根据superscript I IIRTase所 附的说明书使用 superscript III RTase (由 Invitrogen Corporation 制造)代替 PrimeScript (注册商标)RTase，制备包括2 μ gCspA的20 μ L逆转录反应溶液和不包括 CspA的20 μ L逆转录反应溶液，在50°C下进行30分钟的逆转录反应，在70°C下对溶液加热 15分钟，然后停止反应。对由逆转录反应合成的cDNA的量进行定量以证实CspA的作用。结果是，在不包含CspA的反应溶液中，与完全没有将溶液置于冰上相比，在溶液 置于冰上20分钟的情况下来自PolyA附近的长链延伸产物的量减少到11 %。在包含CspA 的反应溶液中，尽管将其置于冰上20分钟，但与完全没有将溶液置于冰上相比，所合成的 cDNA的量是80% (图10)。尽管使用superscript III RTase作为逆转录酶，证实了 CspA 可抑制对由在冰上制备并放置逆转录反应溶液产生的来自PolyA的长链cDNA合成反应的 抑制。实施例11在其中使用寡聚dT作为引物的逆转录反应中，对长链cDNA合成反应的抑制根据类似于实施例9的方法进行测试，除了使用Reverse Transcriptase XL(AMV) (由TAKARABIO INC.制造)代替了 PrimeScript (注册商标)RTase制备包含1 μ L的1 μ g/ μ L 人心脏总 RNA (由 Clontech 制造)、1 μ L 的 50 μ M 寡聚 dT、1. 6 μ L 各 2. 5mM 的 dNTP 混 合物、2 μ L 的 Reverse Transcriptase XL (AMV)缓7中液、0· 5 μ L 的 40U/ μ L Ribonuclease Inhibitor^. 8 μ L ^ 25U/ μ L Reverse Transcriptase XL (AMV)以及 IyL 的
CspA的20 μ L逆转录反应溶液和不包含CspA的20 μ L逆转录反应溶液。对逆转录反应合 成的cDNA的量进行定量以证实CspA的作用。结果是，在不包含CspA的反应溶液中，与完全没有将溶液置于冰上相比，在溶液 置于冰上20分钟的情况下来自PolyA附近的长链延伸产物的量减少到33%。在包含CspA 的反应溶液中，尽管将其置于冰上20分钟，与完全没有将溶液置于冰上相比，所合成的 cDNA的量为75% (图11)。尽管使用衍生自AMV的逆转录酶作为逆转录酶，证实了 CspA可 抑制对由制备逆转录反应溶液产生的来自PolyA的长链cDNA合成反应的抑制。实施例12CspA对使用天然RNA作为模板的逆转录反应发挥的作用用酶储存缓冲液稀释制备实施例中所制备的L的CspA溶液以制备 0. 2 μ g/ μ L的CspA溶液、1 μ g/ μ L的CspA溶液和2 μ g/ μ L的CspA溶液。下一步，以这 样的方式分别制备总体积为IOyL的各种混合物将1 μ L的酶储存缓冲液，0. 2 μ g/ μ L的 CspA溶液，1 μ g/ μ L的CspA溶液、2 μ g/ μ L的CspA溶液或5 μ g/ μ L的CspA溶液分别加 至1 μ L的1 μ g/ μ L人心脏总RNA (由Clontech制造)，1 μ L的50 μ M寡聚dT，1 μ L的各 IOmM的dNTP混合物，以及6 μ L的灭菌蒸馏水。关于不包含CspA并使用酶储存缓冲液制备 的混合物，制备两种不同的混合物。这样的混合物之一进行RNA变性步骤，在65°C下五分 钟，另一种不进行此步骤。对于包含CspA的混合物不进行RNA变性步骤。将4 μ L包含于PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒(由TAKARABIO INC.制造) 中的 5x PrimeScript Buffer>0. 5μ L ^ 40U/μ L Ribonuclease Inhibitor、0. 5 μ L 的 200U/ μ L PrimeScriptRTasejn 5 μ L的灭菌蒸馏水加至10 μ L的这些混合物中，以制备总共为20 μ L的反应溶液。然后将反应溶液进行逆转录反应，在42°C下30分钟，并在95°C下 加热五分钟以停止反应。下一步，将2. 5 μ L的这些反应溶液进行靶向肌营养不良蛋白基因 中大约8kb的区域的PCR。将TaKaRa LA Taq (注册商标)热启动版本(由TAKARABIO INC. 制造)用作PCR，并且以其所附的说明书中列举的反应组合物进行反应。作为引物使用的是 具有SEQ ID NO :20中所示核苷酸序列的引物以及具有SEQ ID NO :21中所示核苷酸序列的 引物。在PCR反应溶液中各种引物的浓度为200nM。进一步地，PCR由TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (注册商标)(由TAKARABIO INC.制造)在这样的条件下进行30个循环，其 中98°C 10秒-68°C 8分钟构成一个循环。在PCR反应完成后，将3 μ L的反应溶液进行琼 脂糖凝胶电泳，以证实扩增产物的链长度和量。根据证实的结果，估计所合成的cDNA的量 以及每个逆转录反应中反应的特异性(图12)。结果是，PCR后进行的分析显示在其中天然RNA用作模板的逆转录反应的反应溶 液中包括CspA的情况下，扩增的大约8kb的长链cDNA的量有极大提高，而靶标以外的所扩 增的DNA量有所减少(图12)。由结果显示，当将CspA加入反应溶液中时，可以以高效力及 高特异性进行cDNA合成，这使得RNA变性步骤不必要了。实施例13CspA对1-步RT-PCR发挥的作用靶向肌营养不良蛋白质基因中大约2kb的区域的1-步RT-PCR，其中将5ng或50ng 的人心脏总RNA(由Clontech制造)用作模板，使用PrimeScript (注册商标)One Step RT-PCR试剂盒(由TAKARABIO INC.制造)进行反应。使用具有SEQ ID NO 21中所示核苷 酸序列的引物和具有SEQ ID NO :22中所示核苷酸序列的引物作为引物。关于1-步RT-PCR 中使用的溶液组成，将5 μ g CspA加至25 μ L的反应溶液，在PrimeScript (注册商标)One Step RT-PCR试剂盒所附的说明书中列举了此溶液的组成。进一步地，还制备了向其中加入 了 1 μ L酶储存缓冲液代替5 μ g CspA的不包含CspA的反应溶液，以及向其中加入了 1 μ L 单链DNA结合蛋白质(SSB)溶液(由USB公司制造)(5 μ g/μ L SSB、50mM Tris-HCl (pH 7. 5)、200mM NaCl,0. ImM EDTAUmM DTT、50%甘油)代替 5 μ g CspA 的反应溶液。对这些 反应溶液进行逆转录反应，在42°C下30分钟，并在94°C下加热两分钟，然后使用TaKaRa PCR Thermal Cycler dice (注册商标)对其进行PCR反应，条件为30个循环，其中94°C 30 秒-55°C 30秒-72°C 2分钟构成一个循环。在反应完成后，对3 μ L的反应溶液进行琼脂糖 凝胶电泳以分析反应产物(图13)。结果是，在含有CspA的溶液中除大约2kb的靶标大小以外的任何大小的非-特异 性扩增产物有明显的减少。在加入SSB时，没有获得靶标大小的扩增产物。实施例14CspA在RT-PCR反应中改进反应的产量和特异性的作用使用人心脏RNA作为用于反应的模板，RT-PCR靶标为肌营养不良蛋白2。 PrimeScript RTase、RNase抑制剂、ExTaq HS或PrimeStar Max、寡聚核苷酸的存在下进行 反应。在有CspA或没有CspA时进行复制反应。还测试了不同温度如42°C或50°C。观察 到在CspA存在下，非-特异性产物有所减少，而且随着CspA量的提高(多至2. 5 μ g CspA 每10μ 1反应)产物的产量有所改进。在更高的温度如42°C和50°C下CspA也是有活性的。 发现有CspA的结果可与其中用热处理对RNA中二级结构去稳定化的反应相比较。
实施例15使用Ni-氨三乙酸树脂纯化从pET-28a-MazF_mt3表达的(His)6MazF_mt3蛋白 质。当在不存在CspA时将纯化的MazF-mt3与MS2RNA —同孵育时，观察到RNA的部分切割 (泳道3)(图14B)。随着增加量的CspA蛋白质加入反应混合物中，MS2RNA底物的切割有 所增强(泳道4-6)。在最高浓度的CspA下，没有检测到全长的MS2RNA (泳道6)。该浓度 (0. 86mM)是RNA结合的CspA的Kd值32倍高，表示CspA几乎完全饱和了 MS2RNA，CspA结 合RNA的每六个碱基。这些结果还证明了 MazF-mt3是能够切割单链RNA的mRNA干扰酶， 所述是单链RNA在CspA去折叠MS2 二级结构时产生的。实施例15MazF-mt3 在 CUCCU 和 UUCCU 处特异性切割 RNA在0. 43mM CspA的存在下，使用反应混合物进行引物延伸实验以确定MazF-mt3在 MS2RNA中的切割位点。为了覆盖整个MS2RNA序列，合成了总共22条引物用于引物延伸实 验。如图15A-H所示，在大多数情况下加入CspA显著地增强了 RNA的切割。值得注意地， 只有在CspA存在下才可检测到对于图15F中所示切割位点的RNA切割。看上去在CspA存 在下，碱基1028 (图15B)处的RNA的切割有所减少，这是由于碱基1028的切割位点紧邻的 下游的碱基1078位点切割的增强，所述切割位点位于引物结合位点和上游切割位点之间。 在图15C中显示了在CspA存在下碱基1078处的该高度增强的切割位点。通过这些实验， 鉴定了八个切割位点，如表2中列出的。这些切割位点的共有序列为⑶(XU，其中MazF-mt3 在二号位置的U残基与三号位置的C残基之间进行切割。尽管我们鉴定了八个MazF-mt3 切割位点，根据发表的MS2序列(NCBI网站)的MS2 RNA中有九个⑶CXU序列。我们因此 重新测序含有第九个⑶CXU序列的区域，发现此区域中没有⑶CXU序列。这些实验中使用 的 MS2RNA (Roche)含有 CCUCU (碱基 2158-碱基 2162)代替了 CUCCU。因此，MazF_mt3 切割 了 MS2RNA中所有的CUCXU序列。如图16A-D中显示的，检测到了与图15中发现的那些不同的四种其他的切割位 点。来自这些引物延伸实验的共有序列为UUCXU，其中MazF-mt3在二号位置的U残基与三 号位置的C残基之间进行切割。在MS2RNA中有五个UUCXU序列，这些都由RNA序列证实。 图IA中用箭头显示了所有MazF-mt3的切割位点。实施例16MazF-mt7还是一种序列-特异性mRNA干扰酶用本文描述的MS2RNA_CspA系统鉴定MazF-mt7的特异性切割位点。使用纯化的 N-端加His标签的MazF-mt7进行引物延伸实验，结果显示于图17A-R，并且总结于表3中。 大多数切割位点含有序列UCGCU (图17A-K)，其中MazF-mt7在第一个U和第二个C之间进 行切割。切割位点中有一些具有共有UCGCU的一碱基错配(图17C、D、H和L-P)，少数切割 位点有二 _碱基错配(图17G、N、Q、R)。然而，所有这些切割位点共享中央的G残基，并且 其中大多数还具有紧跟着中央G残基的C残基。因此发现MazF-mt7为mRNA干扰酶，其识 别五_碱基的U · CG⑶序列；然而其似乎不如MazF-mt3严格。实施例17体外引物延伸分析为进行体外的mRNA切割位点的引物延伸分析，使用或不使用纯化的毒素蛋白质(MazF-mt3或MazF-mt7)，并且使用或不使用纯化的CspA蛋白质，在37°C下部分消化全长 的MS2mRNA以15min。消化反应混合物(10 μ 1)由0. 8 μ g的MS2 RNA底物、0. 0625 μ g的 MazF-mt3 (His)6 或 MazF-mt7 (His)6、321 μ g CspA 和 IOmM Tris-HCl (pH 7.8)中 0. 5 μ 1 的 RNase抑制剂(Roche)构成。在20 μ 1反应混合物中，在47°C进行引物延伸1小时。通过 加入12μ 1的序列加样缓冲液(95%甲酰胺、20mM EDTA、0. 05%溴酚蓝、和0. 05%的二甲 苯蓝EF)停止反应。在6%聚丙烯酰胺和36%尿素胶上进行电泳之前，将样品在90°C下孵 育5min。用于MS2mRNA的引物延伸分析的引物列于表1中。使用T4多聚核苷酸激酶，用 [ -32P]ATP对引物进行5’标记。
表1 引物延伸中使用的引物
权利要求
用于DNA合成的组合物，其包含冷休克蛋白质或其同源物；以及DNA聚合酶。
2.根据权利要求1的组合物，其中冷休克蛋白质包含CspA或其同源物。
3.根据权利要求1的组合物，其中CspA或其同源物衍生自大肠杆菌。
4.根据权利要求1的组合物，进一步包含至少一种另外的DNA聚合酶。
5.根据权利要求4的组合物，其中至少一种DNA聚合酶具有3’- > 5’外切核酸酶活 性，并且至少一种DNA聚合酶几乎没有3’ - > 5’外切核酸酶活性。
6.根据权利要求1的组合物，其进一步包含至少一种引物和至少一种脱氧核糖核苷酸。
7.根据权利要求6的组合物，其中脱氧核糖核苷酸包括脱氧核糖核苷酸三磷酸。
8.根据权利要求6的组合物，其进一步包含液体媒介物。
9.根据权利要求8的组合物，其中液体媒介物包括反应缓冲溶液。
10.权利要求2的组合物，其中组合物包含超过0.5 μ g的CspA每25 μ L的组合物。
11.用于DNA合成的组合物，其包含 Α)冷休克蛋白质；B)至少一种选自DNA聚合酶、引物、脱氧核糖核苷酸、和DNA的组分；以及C)液体媒介物。
12.用于合成DNA的方法，其包括步骤Α)制备包含冷休克蛋白质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸三磷 酸、和DNA的混合物；以及B)孵育步骤Α)中制备的混合物。
13.权利要求12的方法，其中通过PCR进行DNA的合成。
14.权利要求13的方法，其中将处于室温的混合物直接进行步骤B)。
15.用于DNA合成的试剂盒，其包含 Α)冷休克蛋白质；B)至少一种选自DNA聚合酶、引物、和脱氧核糖核苷酸的组分；以及C)液体媒介物。
16.权利要求15的试剂盒，其中液体媒介物包括反应缓冲溶液。
17.权利要求15的试剂盒，进一步包含使用试剂盒用于DNA合成的说明书。
18.权利要求17的试剂盒，其中说明书是纸质或电子形式。
19.权利要求15的试剂盒，其中各组分是单独存在的。
20.权利要求15的试剂盒，其中组合了至少两种组分。
21.DNA组合物，其通过包括以下步骤的方法合成Α)制备包含冷休克蛋白质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸、和 DNA的混合物；以及B)孵育步骤Α)中制备的混合物。
22.用于逆转录反应的组合物，其包含冷休克蛋白质或其同源物；以及逆转录酶。
23.根据权利要求22的组合物，其中冷休克蛋白质是CspA或其同源物。
24.根据权利要求23的组合物，其中CspA或其同源物是衍生自大肠杆菌的CspA。
25.根据权利要求22的组合物，其中逆转录酶是衍生自莫洛尼鼠类白血病病毒的逆转录酶或衍生自禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶或其组合。
26.根据权利要求22的组合物，其进一步包含至少一种引物以及至少一种脱氧核糖核苷酸。
27.权利要求26的组合物，其进一步包含液体媒介物。
28.权利要求27的组合物，其中液体媒介物包括反应缓冲溶液。
29.权利要求23的组合物，其中所述组合物包含大约0.5 μ g-大约20 μ g的CspA每 20 μ L的组合物。
30.权利要求26的组合物，其进一步包含寡聚(dT)引物或具有随机序列的寡聚核苷酸 引物或其组合。
31.用于逆转录反应的组合物，其包含A)冷休克蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、脱氧核糖核苷酸、和RNA的组分；以及C)液体媒介物。
32.用于合成cDNA的方法，其包括步骤A)制备包含冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸、和 RNA的混合物；以及B)孵育步骤A)中制备的混合物。
33.权利要求32的方法，其中将混合物在30°C-65°C孵育5-120分钟。
34.权利要求32的方法，其中将混合物在37°C-50°C孵育。
35.用于逆转录反应的试剂盒，其包含A)冷休克蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、和脱氧核糖核苷酸的组分；以及C)液体媒介物。
36.权利要求35的试剂盒，其中液体媒介物包括反应缓冲溶液。
37.权利要求35的试剂盒，其进一步包含用于进行基因扩增反应的试剂。
38.权利要求37的试剂盒，其中试剂包含热-抗性的DNA聚合酶、反应缓冲溶液、至少 一种脱氧核糖核苷酸、以及至少一对引物。
39.权利要求35的试剂盒，其进一步包含使用试剂盒用于逆转录反应的说明书。
40.权利要求39的试剂盒，其中说明书为纸质或者电子形式。
41.权利要求35的试剂盒，其中各组分是单独存在的。
42.权利要求35的试剂盒，其中组合了至少两种组分。
43.cDNA组合物，其通过包括以下步骤的方法合成A)制备包含冷休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核糖核苷酸、和 RNA的混合物；以及B)孵育步骤A)中制备的溶液。
44.权利要求43的cDNA组合物，其中将混合物在30°C_65°C孵育5-120分钟。
45.权利要求44的cDNA组合物，其中将混合物在37°C_50°C孵育。
46.用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的组合物，其包含 A)冷休克蛋白质；和B)至少一种选自RNA底物和内切核糖核酸酶的组分。
47.权利要求46的组合物，其中组合物包含冷休克蛋白质和RNA底物。
48.权利要求46的组合物，其进一步包含液体媒介物。
49.用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法，其包括步骤A)制备包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内切核糖核酸酶的混合物；以及B)孵育步骤A)中的混合物。
50.权利要求49的方法，其进一步包括通过电泳分析混合物的步骤。
51.用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的试剂盒，其包含冷休克蛋白质和RNA底物。
52.权利要求51的试剂盒，其进一步包含液体媒介物。
53.权利要求52的试剂盒，其中液体媒介物包括反应缓冲溶液。
54.权利要求51的试剂盒，其进一步包含使用试剂盒用于鉴定内切核糖核酸酶切割位 点的说明书。
55.权利要求54的试剂盒，其中说明书是纸质或电子形式。
56.权利要求51的试剂盒，其中冷休克蛋白质和RNA底物是单独存在的。
57.权利要求51的试剂盒，其中冷休克蛋白质和RNA底物是组合的。
全文摘要
本发明提供了包含用于改进的DNA合成反应(具有改进的反应性)的冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于合成DNA的方法，在这些方法中使用的试剂盒，以及通过这些方法产生的DNA组合物。本发明进一步提供用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的包含冷休克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法，以及在这些方法中使用的试剂盒。
文档编号C12P19/34GK101960018SQ200980106857
公开日2011年1月26日 申请日期2009年3月2日 优先权日2008年2月29日
发明者L·朱, S·费德塔里, 上森隆司, 井上正顺, 加藤郁之进, 向井博之, 西胁一惠 申请人:新泽西内科与牙科大学