专利名称：具有脂肪酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明 涉及相对气味产生具有改进的洗涤效果的脂肪酶变体，及制备它们的方 法。其特别涉及细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的变体。
背景技术：
脂肪酶是有用的，例如，作为洗涤剂酶用于从衣物和其它纺织品去除脂质或脂 肪污渍，及作为用于面包和其它烘焙产品的生面团的添加剂。因此，源自细毛嗜热霉 (Thermomyces lanuginosus)(同物异名疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)，EP 258068 和EP 305216)的脂肪酶以商品名Lipolase (Novozymes A/S的产品)出售用于洗涤剂用 途。WO 0060063描述了细毛嗜热霉脂肪酶的变体，其在洗涤剂溶液中具有特别好的初次洗 涤性能(first-wash performance)。WO 9704079、WO 9707202 和 WO 0032758 也公开了细 毛嗜热霉脂肪酶的变体。在一些应用中，感兴趣的是将产生气味的短链脂肪酸的形成降至最低。因此，已 知的是含有脂肪酶的洗衣洗涤剂有时可能留下残留的气味沾在受到牛奶污染的衣物上(EP 430315)。WO 02062973公开了脂肪酶变体，其中通过附接(attaching) C末端延伸减少了气 味的产生。最近公开的WO 07087508公开了脂肪酶变体，其中通过在亲本脂肪酶中鉴定的 一个或多个区域中引入突变而减少了气味产生。WO 07087503描述了具有脂肪酶活性的多 肽，且其在该说明书中给定的测试条件下进一步具有至少0.8的RP和至少1. 1的BR。
发明内容
在第一方面，本发明涉及具有脂肪酶活性的第一多肽，其中所述多肽是具有下列 中的至少一项的多肽(a)相对于280nm处的吸光度(A280)的脂肪酶活性(LU)少于500LU/ A280，其中一单位的LU(ILU)定义为能够在30°C，pH7每分钟释放1 μ mol的丁酸的的酶 量，且所述多肽的吸光度在280nm测定；(b)风险性能气味(Risk performance odor,R)低 于0. 5，其中R计算为自多肽洗涤样本释放的丁酸量和自参照多肽洗涤样本释放的丁酸量 的比例，计算比例之前两个值均相对于自非多肽洗涤样本释放的丁酸量进行了校正；或者 (c)效益风险因子(Benefit Risk factor, BR)至少为1. 8，其中BR定义为平均洗涤性能 (average wash performance, RPavg)除以风险性能气味(R)。在第二方面，本发明涉及具有脂肪酶活性的第二多肽，其包含在下述位置的氨基 酸的改变:T231R+N233R+I255A+P256K 及下列中的至少一种(a) S58A+V60S+A150G+L227G ； 或(b)E210V/G，所述位置对应于SEQ ID NO :2。在进一步的方面，本发明涉及编码具有脂肪酶活性的多肽的分离的多核苷酸、包 含该多核苷酸的核酸构建体、包含所述核酸构建体的重组表达载体以及包含所述核酸构建 体或所述重组表达载体的转化的宿主细胞。在进一步的方面，本发明涉及制备所述多肽的方法，包括下述步骤(a)在有益于 所述多肽产生的条件下培养包含所述核酸构建体或重组表达载体的转化宿主细胞，所述核酸构建体或重组表达载体包含所述多肽；以及(b)回收该多肽。在进一步的方面，本发明涉及包含所述多肽的配制物。在进一步的方面，本发明涉及通过使用所述多肽在脂质水解过程中减少产生气味的短链脂肪酸形成的方法。附图简述
图1显示脂肪酶的比对。序列列表SEQ ID NO 1显示编码来自细毛嗜热霉的脂肪酶的DNA序列。SEQ ID NO :2显示来自细毛嗜热霉的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO :3显示来自反射犁头霉(Absidia reflexa)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO :4显示来自伞枝犁头霉(Absidia corymb if era)的脂肪酶的氨基酸序 列。SEQ ID NO :5显示来自曼赫根毛霉(Rhizmucor miehei)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO :6显示来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO :7显示来自黑曲霉(Aspergillus niger)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO :8显示来自塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的脂肪酶的氨基酸 序列。SEQ ID NO :9显示来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO 10显示来自异孢镰孢(Fusarium heterosporum)的脂肪酶的氨基酸 序列。SEQ ID NO :11显示来自米曲霉(Aspergillus oryzea)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO :12显示来自沙门柏干酪青霉(Penicilium camembertii)的脂肪酶的
氨基酸序列。SEQ ID NO 13显示来自臭曲霉(Aspergillus foetidus)的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO 14显示来自黑曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO :15显示来自米曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。SEQ ID NO 16显示来自Landerina penisapora的脂肪酶的氨基酸序列。发明详述使用脂肪酶去除脂质和脂肪污渍(fatty stain)在本领域是已知的，其中导致游 离短链脂质(如丁酸)的释放的脂肪酶活性与令人不快的(undesirable)气味相关。底物 三丁酸甘油酯的水解导致丁酸的释放。令人惊讶地发现本发明的多肽在中性PH针对三丁 酸甘油酯具有低比活性(作为LU/A280测定)，参见实施例2和表3。效益风险因子(BR)通过相对(洗涤)性能(效益，RP)除以风险性能气味(风 险，R)来计算。所述洗涤性能可通过自动机械应力试验(automated mechanical stress assay, AMSA)来测定，参见实施例3，而气味产生可直接通过气相层析来测定，参见实施例4 和表3。气味减少影响BR，且可导致BR增加。另外还发现本发明的多肽与本领域已知的脂 肪酶相比较具有减少的气味产生和增加的BR，参见实施例5和表3。脂肪酶活性(LU)如本文所使用的术语“脂肪酶活性”指催化在二酰基甘油和羧 酸的形成下三酰基甘油的水解的羧酸酯水解酶活性。就本发明而言，脂肪酶活性通过下述过程来确定脂肪酶的底物通过使用阿拉伯胶作为乳化剂对三丁酸甘油酯(甘油三丁酸) 进行乳化来制备。接着在30°C，pH 7或9在pH恒定的滴定实验中水解三丁酸甘油酯。一 个单位的脂肪酶活性(ILU)定义为能够在30°C，pH7每分钟释放1 μ mol 丁酸的酶量。风险性能气味(R)如本文所使用的术语“风险性能气味”指自多肽洗涤样本释放 的丁酸量和自参照多肽洗涤样本释放的丁酸量之间的比例，之前两个值均相对于自非多肽 洗涤样本释放的丁酸量进行了校正。相对性能(RP)如本文所使用的术语“相对性能”指与参照多肽的洗涤性能相比 较的所述多肽的洗涤性能。就本发明而言，相对性能根据在实施例3中所描述的过程来确 定。参照多肽如本文所使用的术语“参照多肽”、“参照酶”或“参照脂肪酶”指具有取 代T231R+N233R的SEQ ID NO 2的成熟部分。效益风险因子(BR)如本文所使用的术语“效益风险因子”指与气味产生风险(R) 相比较的平均相对性能(RPavg)，且具有下列公式BR = RPavg/R。氨基酸修饰的命名法为了易于参考，在描述本发明的脂肪酶变体时，采用了以下命名法原始氨基酸位置取代氨基酸根据这种命名法，例如，在位置195中用谷氨酸取代甘氨酸表示为G195E。在相同 的位置中缺失甘氨酸表示为G195*，而插入额外的氨基酸残基例如赖氨酸表示为G195GK。 与其它脂肪酶相比，当特定脂肪酶含有“缺失”并且在该位置进行插入的情况，就在位置36 插入天冬氨酸而言，将这种情况表示为*36D。用加号分隔多个突变，即R170Y+G195E，分别表示在位置170用酪氨酸取代精氨 酸，和在位置195用谷氨酸取代甘氨酸。当应用所述排列方法时，X231表示在亲本多肽中对应于位置231的氨基酸。X231R 表示用R置换所述氨基酸。就SEQ ID N0:2而言，X是T，因此X231R表示用R取代位置231 的T。当某个位置(例如231)中的氨基酸可以由选自一组氨基酸的另一个氨基酸取代的情 况，例如由R和P和Y组成的组，将这种情况表示为X231R/P/Y。在所有的情况下，采用公认的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。同一性如本文所使用的术语“同一性”指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列 之间的相关性，由参数“同一性”来描述。就本发明而言，通过使用来自EMBOSS软件包(http//emboss, org)版本2. 8. 0的 Needle程序来测定两个氨基酸序列之间的比对。Needle程序执行总体比对算法(global alignment algorithm),其在 Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453中描述。使用的取代矩阵是BL0SUM62，缺口开启罚分(gap opening penalty)是 10，并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是 0· 5。本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO 2的氨基酸1至269)和不 同氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度如下计算用两个序列比对中的精确匹配 数除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度中最短的一个。将结果表示为百分比同一 性。当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置中具有相同的氨基酸残基时，发生精确匹配。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO :2的长度是269)。可以使用上述方法计算同一性和同源性，并用于比对。在本发明的上下文中，同源性和比对如下所述计算。同源性和比对就本发明而言，可以通过本领域已知的计算机程序的手段合适地测定同源性的程 度，所述程序例如 GCG程序包中提供的 GAP (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group,575Science Drive, Madison, Wisconsin,USA 53711)(Needleman, S. B. and ffunsch,C. D. ,(1970),Journal of Molecular Biology，48，443-45)，按照用于多肽序列比较的以下设定来使用GAP :GAP产生罚分(GAP creation penalty)为 3· 0，和 GAP 延伸罚分(GAP extension penalty)为 0· 1。在本发明中，通过图1所示的比对定义反射犁头霉、伞枝犁头霉(Absidia corymbefera)、曼赫根毛霉、德氏根霉、黑曲霉、塔宾曲霉、尖镰孢、异孢镰孢、米曲霉、沙 门柏干酪青霉、臭曲霉、黑曲霉、细毛嗜热霉(同物异名疏棉状腐质霉)和Landerina penisapora的脂肪酶序列中相应(或同源)的位置。为了发现所述比对中未显示的脂肪酶序列中的同源位置，将感兴趣的序列与图1 中显示的序列进行比对。通过使用GAP比对将新序列与GAP程序发现的最同源的序列进 行比对，将所述新序列排入图1中的现有比对。GAP在GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package,Version 8,August1994,Genetics Computer Group,575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711) (Needleman, S. B. and ffunsch, C. D. , (1970), Journal ofMolecular Biology，48，443-45)中提供。使用以下设置用于多肽序列比较GAP 产生罚分为3.0，且GAP延伸罚分为0. 1。具有脂肪酶活性多肽的来源可以使用任何合适的多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以是真菌多肽。所述多肽可为源自下列属的酵母多肽如，念珠菌属(Candida)、克鲁维酵 母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母 属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选是源自下列属 的丝状真菌多肽如，枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergi 1 Ius)、短梗霉属 (Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filobasidium、键抱属(Fusarium)、腐质霉 属(Humicola)(Magnaporthe) ,^MM (Mucor) > ^M (Myceliophthora) > 新考玛月旨霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、 青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌 属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属 (Tolypocladium)、嗜热霉属(Thermomyces)或木霉属(Trichoderma)0另外，所述多肽可为具有脂肪酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多月太。或者，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉、曰本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulms)、黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉、杆孢状镰 抱(Fusarium bactridioides)、禾谷德抱(Fusarium cerealis)、库威德抱(Fusarium crookwellense)、大刀德抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、 禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰 ？包、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢 (Fusarium sambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆德抱(Fusarium torulosum)、 拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐 质霉(Humicolainsolens)、细毛嗜热霉(同物异名疏棉状腐质霉)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、 产紫青毒(Penicillium purpurogenum)、哈茨木毒(Trichoderma harzianum)、康宁木 霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多月太。
在一些实施方案中，本发明涉及是嗜热霉属脂肪酶的多肽。在一些实施方案中，本发明涉及是细毛嗜热霉脂肪酶的多肽。在一些实施方案中，本发明涉及下述多肽，其中所述多肽与SEQ ID N0:2至少 50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少 97%，至少98%，至少99%或100%相同。鉴定具有脂肪酶活性的多肽中的改变下面提及的位置是SEQ ID NO :2中氨基酸残基的位置。将在“同源性和比对”段 落所描述的过程用于在不同脂肪酶中寻找氨基酸残基的对应或同源位置。在一些实施方案中，本发明涉及具有脂肪酶活性的第一多肽，其中所述多肽是具 有下列中的至少一项的多肽(a)相对于280nm处的吸光度(A280)的脂肪酶活性(LU)少 于500，少于450，少于400，少于350，少于300，少于250，少于200，少于150，少于150或少 于50LU/A280，其中一单位的LU(ILU)定义为能够在30°C，pH 7每分钟释放1 μ mol的丁酸 的酶量，且所述多肽的吸光度在280nm测定；(b)风险性能气味(Risk performance odor, R)低于0.5，低于0.4，低于0.3，低于0.2，低于0. 1或低于0. 05，其中将R计算为自多肽 洗涤样本释放的丁酸量和自参照多肽洗涤样本释放的丁酸量之间的比例，计算比例之前两 个值均相对于自非多肽洗涤样本释放的丁酸量进行了校正；或(c)效益风险因子(Benefit Risk factor, BR)为至少1. 8，至少1. 9，至少2. 0，至少2. 5，至少3. 0，至少4. 0，至少5. O或 至少6.0，其中BR定义为平均洗涤性能(average wash performance, RPavg)除以风险性能 气味(R)。在一些实施方案中，本发明涉及第一多肽，其中所述多肽包含在下述位置的氨基 酸的改变:T231R+N233R+I255A+P256K 和下列中的至少一项(a) S58A+V60S+A150G+L227G ； 或(b)E210V/G ；所述位置对应于SEQ ID NO :2。在一些实施方案中，本发明涉及进一步包含在位置I86V或T143S的氨基酸改变中 的至少一种的第一多肽。在一些实施方案中，本发明涉及第一多肽，其中所述多肽包含至少一个选自下列的进一步改变在对应于 SEQ ID NO 2 的位置E1、D27、N33、S83、G91、N94、K98、E99、D102、 D111、G163、I202、E210、S216、L259或L269的位置取代、缺失或添加至少一个氨基酸。在一些实施方案中，本发明涉及第一多肽，其中所述至少一个改变选自下组SEQ ID NO 2 的 E1N/*、D27N、N33Q、S83T、G91N、N94R、K98I、E99K、D102A、D111N、G163K、I202L、 E210A、S216P、L259F 或 L269APIA。
在一些实施方案中，本发明涉及第二多肽，其包含在下列位置的氨基酸的改变 T231R+N233R+I255A+P256K 和下列中的至少一种(a) S58A+V60S+A150G+L227G ；或(b) E210V/G ；所述位置对应于SEQ ID NO :2。在一些实施方案中，本发明涉及进一步包含在位置I86V或T143S的氨基酸改变中 的至少一种的第二多肽。在一些实施方案中，本发明涉及第二多肽，其中所述多肽包含至少一个选自下列 的进一步改变在对应于 SEQ ID NO 2 的位置E1、D27、N33、S83、G91、N94、K98、E99、D102、 D111、G163、I202、E210、S216、L259或L269位置的位置取代、缺失或添加至少一个氨基酸。在一些实施方案中，本发明涉及第二多肽，其中所述至少一个改变选自下组SEQ ID NO 2 的 E1N/*、D27N、N33Q、S83T、G91N、N94R、K98I、E99K、D102A、D111N、G163K、I202L、 E210A、S216P、L259F 或 L269APIA。在一些实施方案中，本发明涉及第一多肽，其中所述多肽包含选自下组的改变 (a)T231R+N233R+L269APIA ； (b)S58T+V60K+A150G+T231R+N233I+D234G ； (c)S58T+V60K+I 86V+D102A+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K ； (d)S58N+V60S+I86P+T231R+N233R+P256S ； (e)S58N+V60S+I86S+L227G+T231R+N233R+P256S ；以及(f) S58N+V60S+I86T+L227G+T231R+ N233R+P256L。在一些实施方案中，本发明涉及第一或第二多肽，其中所述多肽包含选自下组的 改变(a)S58A+V60S+S83T+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (b)S58A+V60S+I86V +A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (c)S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+L227G+T231 R+N233R+I255A+P256K ； (d)S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+G163K+S216P+L227G+T231R+N23 3R+I255A+P256K ； (e)E1*+S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P25 6K ；(f)S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (g) E1N+S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K+L259F ；
(h)S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+D102A+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ；
(i)N33Q+S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K； (j)El*+S58A +V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (k)E1N+S58A+V6 0S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+S216P+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (1)D27N+S58 A+V60S+I86V+G91N+N94R+D111N+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (m)ElN+ S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+E210A+S216P+L227G+T231R+N233R+I255A+P256 K ； (n)A150G+E210V+T231R+N233R+I255A+P256K ； (o)I202L+E210G+T231R+N233R+I255A+P25 6Κ ； (p)ElN+A18K+V60K+I86V+A150G+E210A+L227G+T231R+N233R+P256K ； (q)E1L+D27K+V60K +I86V+A150G+S219P+L227G+T231R+N233R+P256K ； (r)E1N+S58A+V60S+S83T+A150G+L227G+T 231R+N233R+I255A+P256K ； (s)E1N+S58T+V60K+I86V+D102A+T143S+A150G+L227G+T231R+N2 33R+I255A+P256K ； (t)E1N+S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+D102A+T143S+A150G+S216P+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ；和(u) S58A+V60S+S83T+A150A+L227G+T231R+N233R+I255A+P2 56K。表1 在所述多肽中可能包含的改变
权利要求
一种具有脂肪酶活性的多肽，其中所述多肽是具有下列中的至少一项的多肽(a)相对于280nm处的吸光度(A280)的脂肪酶活性(LU)少于500LU/A280，其中一单位的LU(1LU)定义为能够在30℃，pH7每分钟释放1μmol的丁酸的酶量，且所述多肽的吸光度在280nm处测定；(b)风险性能气味(R)低于0.5，其中R计算为自多肽洗涤样本释放的丁酸量和自参照多肽洗涤样本释放的丁酸量的比例，计算比例之前两个值均相对于自非多肽洗涤样本释放的丁酸量进行了校正；或(c)效益风险因子(BR)至少为1.8，其中BR定义为平均洗涤性能(RPavg)除以风险性能气味(R)。
2.权利要求1的多肽，其包含在下述位置的氨基酸改变T231R+N233R+I255A+P256K和 下列中的至少一种(a)S58A+V60S+A150G+L227G ；或(b)E210V/G；所述位置对应于SEQ ID NO :2。
3.权利要求2的多肽，进一步在位置I86V或T143S处包含至少一个氨基酸改变。
4.权利要求2-3任一所述的多肽，其中所述多肽包含至少一个选自下列的进一步改 变在对应于 SEQ ID NO 2 的位置 E1、D27、N33、S83、G91、N94、K98、E99、D102、D111、G163、 1202、E210、S216、L259或L269的位置取代、缺失或添加至少一个氨基酸。
5.权利要求4的多肽，其中所述至少一个改变选自下组SEQID NO :2的E1N/*、D27N、 N33Q、S83T、G91N、N94R、K98I、E99K、D102A、D111N、G163K、I202L、E210A、S216P、L259F 或 L269APIA。
6.一种多肽，其包含在下述位置的氨基酸改变T231R+N233R+I255A+P256K和下列中 的至少一种(a)S58A+V60S+A150G+L227G ；或(b)E210V/G；其中所述位置对应于SEQ ID NO :2。
7.权利要求6的多肽，其进一步在位置I86V或T143S处包含至少一个氨基酸改变。
8.权利要求6-7任一所述的多肽，其中所述多肽包含至少一个选自下列的进一步改 变在对应于 SEQ ID NO 2 中位置 E1、D27、N33、S83、G91、N94、K98、E99、D102、D111、G163、 1202、E210、S216、L259或L269的位置取代、缺失或添加至少一个氨基酸。
9.权利要求8的多肽，其中所述至少一个改变选自下组SEQID NO :2的E1N/*、D27N、 N33Q、S83T、G91N、N94R、K98I、E99K、D102A、D111N、G163K、I202L、E210A、S216P、L259F 或 L269APIA。
10.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含选自下组的改变(a)T231R+N233R+L269APIA；(b)S58T+V60K+A150G+T231R+N233I+D234G；(c)S58T+V60K+I86V+D102A+A150G+L227G+T231R+N233R+P256K；(d)S58N+V60S+I86P+T231R+N233R+P256S；(e)S58N+V60S+I86S+L227G+T231R+N233R+P256S；禾口(f)S58N+V60S+I86T+L227G+T231R+N233R+P256L。
11.权利要求1或6的多肽，其中所述多肽包含选自下组的改变(a)S58A+V60S+I83T+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K；(b)S58A+V60S+I86V+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K；(c)S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K；(d)S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K；(e)El*+S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K；(f)S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K；(g)ElN+S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K +L259F ；(h)S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+D102A+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ；(i)N33Q+S58A+V60S+I86V+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K； (j)El*+S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ；(k)ElN+S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+S216P+L227G+T231R+N233R+I255A +P256K ；(DD27N+S58A+V60S+I86V+G91N+N94R+D111N+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255 A+P256K ；(m)ElN+S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+T143S+A150G+E210A+S216P+L227G+T231R+N233R +I255A+P256K ；(n)A150G+E210V+T231R+N233R+I255A+P256K ； (ο)I202L+E210G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (p)ElN+A18K+V60K+I86V+A150G+E210A+L227G+T231R+N233R+P256K ； (q)ElL+D27K+V60K+I86V+A150G+S219P+L227G+T231R+N233R+P256K ； (r)ElN+S58A+V60S+S83T+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (s)E1N+S58T+V60K+I86V+D102A+T143S+A150G+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K ； (t)ElN+S58A+V60S+I86V+K98I+E99K+D102A+T143S+A150G+S216P+L227G+T231R+N233R +I255A+P256K ；和(u)S58A+V60S+S83T+A150A+L227G+T231R+N233R+I255A+P256K。
12.前述权利要求中任一所述的多肽，其中所述多肽与SEQID NO :2是至少50%，至 少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%，至少99%或100%相同的。
13.—种编码权利要求1-12任一所述的多肽的分离的多核苷酸。
14.一种包含权利要求13的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作连接于至少 一个在表达宿主中指导所述多肽产生的调控序列。
15.一种包含权利要求14的核酸构建体的重组表达载体。
16.一种包含权利要求14的核酸构建体或权利要求15的重组表达载体的转化的宿主 细胞。
17.一种制备权利要求1-12任一所述的多肽的方法，包括下述步骤(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养转化的宿主细胞，所述宿主细胞包含含有所 述多肽的重组表达载体或核酸构建体；和(b)回收该多肽。
18.—种包含权利要求1-12任一所述的多肽的配制物。
19.权利要求18的配制物，其中所述配制物可为固体或液体配制物。
20.一种通过使用权利要求1-12任一所述的多肽在脂质水解过程中减少产生气味的 短链脂肪酸形成的方法。
全文摘要
本发明提供通过将突变引入在亲本脂肪酶中鉴定的一个或多个区域而获取的多肽。令人惊奇的发现本发明的多肽针对短链脂肪酸具有低比活性，导致与本领域已知的脂肪酶相比减少的气味产生和增加的BR。
文档编号C12N9/20GK101960008SQ200980106985
公开日2011年1月26日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年2月29日
发明者于尔根·C·F·克诺策尔, 彼得·K·汉森, 德比·耶弗, 托马斯·H·卡里森, 杰斯珀·文德, 金·博施, 阿伦·斯文德森, 马兹·E·布乔尔恩瓦德 申请人:诺维信公司