专利名称：一种植物耐盐基因的制作方法
技术领域：
本发明是空心莲子草的一种植物耐盐基因，属于基因工程技术领域。
背景技术：
目前，应用转基因技术提高植物的耐盐性已经成为共识，但已分离的植物耐盐基因种类及数量还很有限，且多是从盐敏感植物中克隆获得。空心莲子草耐盐能力很强(参见David J.Longstreth.等人，植物细胞、组织和器官培养，78225-230(2004)。)，其体内应该有一系列耐盐能力强的基因，是进行耐盐基因研究的良好材料。
由于水稻和空心莲子草均可正常生长于淡水环境中，与来自于盐敏感植物尤其是陆生植物的耐盐基因相比，将来自空心莲子草的耐盐基因转入水稻可能会更有效。因此分离空心莲子草的耐盐基因，为运用基因工程技术提高植物尤其是水稻耐盐性，提供了更加丰富的优良候选基因。
发明内容
本发明克隆了空心莲子草的一种植物耐盐基因。该基因长度为725bp，开放阅读框从核苷酸第26-526位，编码166个氨基酸。
具体实施例方式
采用砂培法通过浇灌Hoagland营养液在室内培养空心莲子草，白天30℃晚上25℃，空气相对湿度70％，光照12h，光强是400umol/m2/s1。当空心莲子草的茎节上长出约5cm长的须根时，施加分析纯氯化钠使其终浓度达到1.7％，24小时后剪取须根，按照INVITR0GEN Trizol说明书提取须根RNA，再按照TAKARA DNaseI说明书去除RNA中残存的DNA。用5μg总RNA按照Promega公司的M-MLV Reverse Transcriptase说明书进行逆转录得到cDNA。根据本发明公开的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，设计上游引物5′-GATCAAGTCCCCCACCTA-3′和下游引物5′-CGGCAATGATTCAAATATATT-3′进行PCR扩增。PCR反应体系如下5ul10×buffer，4 ul dNTP(2.5mmol.L-1)，1ul上游引物(10μmol.L-1)，1ul下游引物(10μmol.L-1)，0.25ul(5U.ul-1)Taq酶，2ulcDNA，补充无菌ddH20至50ul。PCR反应条件如下，94℃预变性1min，94℃30sec，54℃30sec，72℃1min，35个循环，72℃10min。在对PCR产物进行胶回收纯化后，连接T载体转化测序。
通过半定量PCR技术检测其在1.7％氯化钠处理后表达情况。植物材料培养同上，只是材料分为两部分，分别用于对照和盐处理。为了消除cDNA浓度的影响，选用看家基因actin作为内参对照。Actin的扩增方法是以盐处理前后的cDNA为模板，用上游引物5′TGAACTTCGTGTTGCTCCAGA-3′和下游引物5′-AACCCTCGTAGATTGGCACAG-3′进行PCR扩增。PCR反应体系如下5ul10×buffer，4ul dNTP(2.5mmol.L-1)，1ul上游引物(10μmol.L-1)，1ul下游引物(10μmol.L-1)，0.25ul(5U.ul-1)Taq酶，2ulcDNA，补充无菌ddH20至50ul。PCR反应程序94℃3min；94℃20sec，55℃20sec，72℃ 20sec，72℃10min，扩增产物大小为230bp。再根据本发明公开的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，设计上游引物5′-TCGCCCTCATCCCACCAT-3′和下游引物5′-GCAGTCACCTGGGTTCTTCG-3′，以盐处理前后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如下5ul10×buffer，4ul dNTP(2.5mmol.L-1)，1ul上游引物(10μmol.L-1)，1ul下游引物(10μmol.L-1)，0.25ul(5U.ul-1)Taq酶，2ulcDNA，补充无菌ddH20至50ul。PCR反应程序94℃3min，94℃10sec，59℃10sec，72℃10sec，72℃10min。扩增产物大小为102bp。为使PCR扩增在指数期进行，actin和上述耐盐基因均进行25，30，35，40个循环的扩增。对指数扩增期PCR产物进行电泳，而后用凝胶成像系统观察分析1.7％氯化钠处理须根前后actin和上述耐盐基因PCR产物条带亮度。在盐处理后，耐盐基因表达增强5倍以上。
将得到的耐盐基因序列提交Genbank，经Blast比对表明，该基因与腐霉菌分泌蛋白基因同源性高达95％，与其他物种没有同源性。此类基因功能未见报道。我们的上述试验证明该耐盐基因在盐胁迫后表达量增加5倍以上，是一种新的耐盐基因。该基因的克隆扩大了植物耐盐研究的基因资源，为运用基因工程技术提高植物尤其是水稻耐盐性，提供了更加丰富的优良候选基因。
<110>华中科技大学<120>一种植物耐盐基因<140>2006101249835<141>2006-11-09<160>1<170>PatentIn Version 3.3<210>1<211>725<212>DNA<213>空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)<400>1gatcaagtcc cccacctaca gcacaatgta cgccaagacc ctcctcgtcg ccgccgtggc 60cgccctcgct gccgtcaacg ccgccccatg tgacatgctc actgaggtca ccaagctgac 120ccctctcatc tcggacccaa acgttgctaa gtgcagcacc caggaggagt cgggcggctt 180cgccctcatc ccaccatcgg gcctgccaac ccctgaccag tacaagaaga tgtgtgtcag 240cgacgcctgt aagaaggtca ttgaggctgt tgcctcgaag aacccaggtg actgcgacct 300caccgtcggc tcggtcaccc tcaacgtgaa gcagcttgtg tcgaacttcc caacggagtg 360cgccaagtac acgacgccag ccaccacggc tccagcccca accacgactg cgccagctcc 420atcgtcgggc ccagccccat cgtcgtcggc tccagcccca accggtcaga ccaccccagc 480cccaactggc cagagcaccc ctgccccaac caaggctcag tgctaagtta tttcgcatct 540gactcgcggt cgatggttac tgctgctcac tgagtagtgg tgtcggccca gtactctcat 600cgccttcagc gttttgtcag tgtccgcgaa tcaggagctc atgagcgtcg ggaggtggtc 660tatttccctt cggtcctgct gaaccgtggt cgtgtgctgg aatatatttg aatcattgcc 720
gtcac 72权利要求
一种植物耐盐基因序列，其特征在于具有下述核苷酸序列之一1)一种分离的多核苷酸、其具有SEQ IDN0.1所示核苷酸序列。2)一种分离的多核苷酸，其具有与SEQ ID N0.1中从核苷酸第26-526位的核苷酸序列有至少70％的同源性。
全文摘要
本发明涉及一种植物耐盐基因序列，属于基因工程技术领域。其特征在于该基因长度为725bp，开放阅读框从核苷酸第26－526位，编码166个氨基酸。应用半定量PCR技术研究该基因在1.7％氯化钠胁迫24小时后的表达，发现盐胁迫后该基因表达量增加5倍以上，为植物耐盐基因。该基因的克隆扩大了植物耐盐研究的基因资源，为运用基因工程技术提高植物尤其是水稻耐盐性，提供了更加丰富的优良候选基因。
文档编号C12N15/29GK101058811SQ20061012498
公开日2007年10月24日 申请日期2006年11月9日 优先权日2006年11月9日
发明者高建明, 何光源, 肖强 申请人:华中科技大学