一种新的植物强耐盐基因AtNHXS1及其编码蛋白和应用的制作方法

专利名称：一种新的植物强耐盐基因AtNHXS1及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到植物基因工程领域，具体的说是利用DNA改组技术获得功能显 著提高的植物Na+AT逆向转运蛋白的基因，本发明还涉及到利用此基因培育转基 因耐盐植物。
背景技术：
土壤盐渍化是影响农作物生产和生态环境的一个重要的非生物胁迫因素。目 前，世界上大约有20%的耕地和接近50%的灌溉用地受到盐渍的严重危害 (Flowler T J , Yeo A R. Breeding for salinity resistance in crop plants. Where next Aust. J. /7朋t1995， 22:875 884)。我国大约有5亿亩 盐碱地，并且其面积有不断增加的趋势。培育抗盐植物是促进盐碱地开发利用、 改良土壤和生态治理的有效途径。因此，利用现代生物学技术，通过对植物耐盐 生理和分子生物学的深入研究，克隆和改造植物重要的耐盐基因，进而将这些基 因转化到植物中以培育转基因耐盐植物新品种，对于农业生产、环境保护和生态 治理等都具有重要的意义。高浓度的盐分对植物造成严重的伤害，主要表现在渗透胁迫和离子毒害两方 面(Blumwald E, Aharon G S， Apse M P. Sodium transport in plant cells. SiocZ/eyz "/0/7力/Jcta. 2000， 1465: 140 151)。 一方面，土壤中高浓度的盐 分使土壤水势低于植物细胞的水势从而引起植物细胞水分亏缺即渗透胁迫；另一 方面，过量渗入植物细胞的各种盐离子又会对细胞造成离子毒害，主要是Na+毒 害。遭受渗透胁迫和离子毒害的植物细胞的质膜的通透性增加，导致过氧化胁迫、 营养亏缺及一系列生理代谢反应的紊乱等次生伤害作用，从而对植物正常的生长 发育造成严重危害。自然界中植物为了适应高浓度的盐，形成了一系列的防御机制(Bohnert H J,Nelson D E , Jensen R G. Adaptation to environmental stress, f7朋t CeW. 1995,7 :1099 11U)，主要包括渗透调节和重建细胞的离子均衡两种策 略。前者指植物细胞利用一些无机离子或者合成一些小分子有机化合物作为渗透 调节剂，以降低细胞水势，抵御渗透胁迫。后者主要指植物细胞通过将细胞质中 过量的Na+转运出细胞或者区隔化到液泡中，实现离子均衡、消除Na+毒害的目的。 植物细胞的一个显著特征就是拥有体积很大的膜隔离的液泡，盐胁迫条件下，植 物细胞保持细胞质低浓度Na+的最直接方式就是将Na+隔离到液泡中。这样既可以 使胞质酶免受离子毒害，又能提高细胞整体的渗透压起到促进细胞吸水的作用， 是自然界中耐盐植物主要的耐盐机制(Flower T J ， Troke P F ， Yeo A R. The mechanisms of salt tolerance in halophytes. AW尸7s"t尸/7ysj'oJ .1977 ,28 :89 12L)。植物Na7H+逆向转运蛋白是一种Na+的逆向转运体，在植物质膜和液泡膜上 都有分布，其中液泡膜Na7H+逆向转运蛋白是负责将Na+区隔化到液泡的主要蛋 白。植物Na7H+转运蛋白最先在大麦质膜上发现，之后在多种植物质膜和液泡膜 上普遍检测到NaVH+转运的活性。自世界上首个植物Na7H+逆向转运蛋白基因 爿tyWil被克隆后(Gaxiola R A， Rao R， Sherman A' Grisafi P， Alper S， and Fink G R. The /1raZ^'c/oAS7'51 t力si7朋s proton transporters ， AtNhxl and Avpl ， can function in cation detoxify cation in yeast . 尸rac 〃at7 /fcad 5bi 1999 ，96 :1480 1485)，水稻、北滨黎、碱蓬等高等植物的液泡膜Na7H+逆向转 运蛋白基因相继得到克隆，分别为&A^n( Fukuda A , Nakamura A , Tanaka Y. Molecular cloning and expression of the Na+/H+ exchanger gene in 。_r/^3 5\s"ra.肠c/w."/0;7/ 75爿cta. 1999 , 1446 :149 155) 、 4§tW1 (Hamada A, Shono M, Xia T, 0hta M, Hayashi Y, Tanaka A, Hayakawa T. Isolation and characterization of a Na+/H+ antiporter gene from the halophyte Jtrj';xZe;f 《历e厶'/7丄/^朋z^ifo乃c"Jar5j-Wo《乂2001, 46:35 42) 、 (Ma XL, ZhangQ， Shi H Z, Zhu J K， Zhao Y X， Ma C L, Zhang H. Molecular cloning and different expression of a vacuolar Na+/H+ antiporter gene in 5""aecfe ssJsa under salt stress . ^Zo7o《j'ca7 /^a/7tsrw瓜2004, 48(2) :219 225)等。在 液泡膜质子泵提供的能量下，位于液泡膜的Na7H+逆向转运蛋白将Na+区隔化进入液泡中从而降低细胞质中Na+的浓度，使过多的Na+离开代谢位点，减轻其对酶和 膜系统的伤害，还可降低细胞水势，抵抗盐分造成的渗透胁迫。所以，Na7H+逆 向转运蛋白对植物的抗盐性起着重要的作用。将Na7H+逆向转运蛋白(Na7H+antiporter)基因转化到目标植物中进行过 量表达是培育转基因耐盐植物的有效方式。Apse等对转JtyV〃Z/基因的拟南芥植 株进行了分析，过量表达Na7FT逆向转运蛋白的转基因拟南芥植株在200mmo1/ L NaCl中能正常生长发育。免疫印迹表明，在转化植株叶片提纯液泡中含有比 从野生型叶片提纯液泡中更多的JtyWZ/产物，液泡上Na7H+逆向转运蛋白活力 显著增强(Apse M P ， Aharon G S , Snedden W A ， Bl隨ard E. Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiporter in 5b/e/7ce. 1999,285 :1256 1258)。同样，将拟南芥力tyWZ/基 因转入西红柿中，转基因西红柿在200 mmol/LNaCl胁迫下能够正常生长、开花 和结实。尽管叶片中Na+浓度高，但西红柿果实中Na+浓度很低(Zhang H X， Blumward E. Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit . ^/otec/wo/c^ . 2001, 19 : 765 768)。这些研究都表明了 Na7H+逆向转运蛋白基因及其蛋白在植物对于高盐反应中的 重要性，被认为是目前最有希望利用其特性培养转基因耐盐品种的基因。然而，在实际生产应用上，目前在植物中已克隆的Na+AT逆向转运蛋白基因 仍然存在着活性不高、耐盐性不强的问题，很大程度上限制了该基因的生产应用 和推广。如何利用特定的现代生物学技术，克隆新的强耐盐基因或对该基因进行 分子进化和改造，进而将这些新基因转化到植物中以培育转基因耐盐植物新品 种，对于农业生产、环境保护和生态治理等都具有重要的意义。DNA改组(DNA Shuffling)技术是目前蛋白质、酶和单克隆抗体等体外定向 进化的快速高效方法,在提高酶活性、蛋白质产量和改善蛋白质(酶)的性能等方 面具有广泛的应用前景。其原理是将一组紧密相关的核酸序列随机片段化，然后 利用无引物PCR将这些随机片段进行重新组装而得到全长的核酸序列，在这个过 程中引入突变并对不同的突变进行广泛的重组，从而完成对目的核酸序列的迅速 进化，以提高核酸序列或其编码的蛋白的功能(Stemmer W P. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecularevolution.尸潔淑"ca""'股1994, 91:10747-10751)。DNA改组技术自诞生以来，己成功地对多种基因如工业用酶、抗体及一些重 要的蛋白等进行了定向进化，使酶的活性、底物特异性及抗体的特异性、蛋白功 能、热稳定性等得到了显著的提高(Crameri A， RaillardS, Bermudez E， Stemmer W P. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution . 〃st"_re. 1998， 391:288 )。如Stemmer等应用该技术取得 了一系列研究成果，获得了酶活提高了 32000倍的e-内酰胺酶(Stemmer WP. R邻id evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. A^"化 1994， 370: 389 391)、荧光强度超过野生型45倍的绿色荧光蛋白(Crameri A， Whitehorn E A, Tate E, Stemmer W P. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling.淑肠^ c/ / o丄1996, 14: 315 319)。通 过DNA改组方法，Crameri等成功得到了砷酸盐抗性提高40倍的菌株(Crameri A, Dawes G, Rodriguez E _J, Silver S, Stemmer W P. Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling. /Vat j9iotecAr o/. 1997， 15: 436 438)。但是，应用该技术在改进Na7H+逆向转运蛋白基因及其蛋白 质的性能方面，国内外均未见报导。发明内容本发明目的在于获得一种新的植物强耐盐基因AtNHXSl，此基因能编码具有离子转运活性的Na7H+逆向转运蛋白。 -本发明的另一个目的在于提供此基因编码的Na7H+逆向转运蛋白，其离子转运活性比野生型的Na7H+逆向转运蛋白更强。 本发明还提供了含有上述基因的重组载体。 本发明的另一方面，还提供了含有上述重组质粒的宿主细胞。 本发明的另一方面，还提供了重组载体的构建、转基因植物等方法，以应用上述基因和编码蛋白培育耐盐性更强的转基因植物新品种。Na7H+逆向转运蛋白(Na7H+antiporter)在植物耐盐中起重要作用，其活 性大小影响着植物的耐盐性。本发明通过DNA改组技术，对编码Na7H+逆向转运蛋白的野生型耐盐基因AtNHXl进行体外分子进化，以获得编码离子转运活性更 高的化+/『逆向转运蛋白新基因。这种新基因所编码的NaVH+逆向转运蛋白能将 更多的Na+从细胞质中区隔化到液泡中，因而将得到的新基因转化到目标植物中， 能够培育出耐盐能力更强的转基因植物新品种。具体来说，通过体外DNA改组技术对野生型的Na7H+逆向转运蛋白基因进行 突变重组，通过功能互补法，在Na7H+逆向转运蛋白基因缺失的酵母突变株中定 向筛选离子转运活性显著增强的Na7H+逆向转运蛋白突变新基因。本发明涉及到能够提高植物抗盐能力的一种新基因AtNHXSl，其核苷酸序列 如SEQ ID N0:1，也包括与SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列同源性在70-100%之间 的基因，也包括编码SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明涉及到能够提高植物抗盐能力的一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2，也包括与SEQ ID N0:2所示氨基酸序列同源性在70-100%之间的蛋白质， 也包括在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列中增加、减少或替换一个或几个氨基酸的 蛋白质。本发明的技术方案如下Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆可以采用PCR扩增法、重组法或人工合成 法等多种方法来获得Na7H+逆向转运蛋白核苷酸全长序列或其片段。比如，基 于Na7lT逆向转运蛋白基因序列设计多核苷酸探针来从cDNA文库或基因组文库 中筛选目的基因，也可以用PCR扩增方法直接从cDNA或基因组中扩增出有关序 列。Na7H+逆向转运蛋白基因的DNA改组用于DNA改组的底物可以是生物体 不同个体、株系或种类的化+"+逆向转运蛋白基因，也可以是通过易错PCR、定 点突变等常规方法制取的不同突变形式的Na+/H+逆向转运蛋白基因。对Na7H+逆向转运蛋白基因进行DNA改组的主要步骤为首先用DNase I 或限制酶对Na7H+逆向转运蛋白基因进行随机片段化，回收其中的小片段即重 叠片段。然后在不加引物的情况下，用DNA聚合酶进行Primerless PCR使小片 段互为引物和模板进行扩增，从而使不同的突变得到广泛的重组。最后经Primer PCR扩增得到含有重组NaVPT逆向转运蛋白基因片段的重组基因库。含有重组Na+/H+逆向转运蛋白基因片段的重组基因库可以转入到一种细胞或生物体内如细菌、酵母或植物细胞进行筛选。例如，可以将本发明得到的重组 基因库连接到任何酵母表达载体如pYPGE15中，利用本领域公知的方法如乙酸锂 技术、电转法等转化酵母Na7fT逆向转运蛋白突变体如W303Aenal-4厶nhxl中， 构建表达重组基因库。将酵母转化子涂布在含高浓度NaCl的APG选择性平板中 以高盐为选择压力进行高通量筛选，得到盐耐受性显著提高的突变株。从筛选到的盐耐受性显著提高的酵母突变株中提取质粒，通过测序来获取其 中的新的耐高盐Na7H+逆向转运蛋白基因的核苷酸序列，运用常规的生物软件 如DNA Star、 Clustalx和TMpred等对耐高盐Na+/H+逆向转运蛋白基因和野生 型Na7H+逆向转运蛋白基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对以及亲水性 疏水性分析等生物信息学分析。结果表明，Na7H+逆向转运蛋白AtNHXSl比未改 组Na+AT逆向转运蛋白基因具有更强的离子转运活性，可以将更多Na+的从胞质 中区隔化到液泡中，使导入该基因的宿主细胞具有更好的耐盐性。耐高盐Na7H+逆向转运蛋白新基因AtNHXSl作为目的基因，可以构建在任 何植物表达的Ti-质粒双元载体中比如pBISNl上，其中有LB和RB的T-DNA 25bp 重复序列，甘露氨酸合成酶启动子(Pmas)， polyA nos终止子，还有在真核生 物中作为选择标记使用的新霉素磷酸转移酶II(叩tII)，用于选择的抗生素是卡 那霉素。植物表达载体中的启动子可以是任何一种组成型启动子、组织特异性启 动子或环境诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，Ubiqutin启动 子。载体中的增强子既可以是转录增强子，也可以是翻译增强子。为了便于对转 基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，载体中还应有植物可选择性标记(GUS基 因、荧光素酶基因等)或具有抗生素等抗性的标记物(如卡那霉素、除草剂等)。通过本领域公知的研究方法如冻融法、电击法等将上述重组载体导入农杆菌 中，进行农杆菌转化。可通过微注射、基因枪、农杆菌介导、花粉管通道方法等 常规生物技术方法将耐高盐Na+/H+逆向转运蛋白新基因AtNHXSl转入植物 中，培育出抗盐品质优良及生物学性状得到改善的植物新的品种。被转化的植物 宿主既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥，烟草，番茄，油菜，水稻，小麦，玉米，大豆，蔬菜，树木，花卉，牧草和草坪草等。本发明的基因 对于培育抗盐植物品种，提高农作物产量、改善生态环境等具有重要的意义。本发明的转基因重组载体可作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生 产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物的抗盐性。


图1为改组获得的AtNHXSl基因与未改组AtNHXl基因在酵母双突变菌株 W303-IBAenal-4Anhxl中功能互补实验比较，即以下细胞在pH5.5、含有0、 50mM、 75mM、 100mM和125mM NaCl的APG平板上生长情况其中I为含有PYPGE15质粒的野生型1B， II为含有PYPGE15质粒的 W303-1B Aenal-4: :HIS3， III为含有PYPGE15质粒的W303-1B厶enal-4: :HIS3 △nhxl: :TRP1， IV为含有At歸l-PYPGE15重组质粒的W303-IB Aenal-4: :HIS3 △nhxl: :TRP1， V为AtNHXSl-PYPGE15重组质粒的W303-IB Aenal-4: :HIS3 △ nhxl::TRP1。
具体实施方式
实施例1.拟南芥NaYlT逆向转运蛋白基因的克隆用TRizol试剂从拟南芥幼叶中抽提拟南芥总RNA，以总RNA为模版进行反 转录，合成cDNA第一链。以合成的cDNA为模版，参照AtNHXl的cDNA序列，设 计以下两段引物(5'端分别包含SmaI和Sal I酶切位点)AtR (5' -GCGTCGACTCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGG-3')AtF (5' -TCCCCCGGGATGTTGGA TTCTCTAGTG-3')通过PCR扩增获得拟南芥，+/^+逆向转运蛋白基因AtNHXl，将其连接到 PGM-T载体中，并转入大肠杆菌DH5a,克隆到的AtNHXl的序列通过测序来确定。实施例2. AtNHXl基因的DNA改组1) 起始材料的制备 以pGM-T-AtNHXl为模版，用Taq DNA聚合酶对AtNHXl 进行PCR扩增，纯化后作为DNA改组的起始材料。2) DNase I随机酶切 取lO^g纯化的AtNHXl，加入到50W酶切反应体系 中(lOmM Tris-HC1, pH7. 4， 50mM MnCl2)， 15。C下反应lOmin。加入 DNase I 0. 15U，混匀，15°C， 2min,9(TC， lOmin.产物通过2. 5%琼脂糖凝胶电泳，切下 含100-200bp的片段的凝胶并回收。3) 无引物PCR取回收的小片段，加入到5CH4反应体系中(lOXPfubuffer, dNTP各0. 2mM, 0. 6UA4 Pfu聚合酶)。PCR程序为反应条件:9化预 变性60s， 94。C变性30s， 50°C退火30s， 72。C延伸30s，共40cycles，最后 72°C延伸5min。4)有引物PCR 取无引物PCR的产物作为模板，用AtR和AtF两个 引物对重组的AtNHXl基因全长序列进行PCR扩增。PCR反应体系为(lOXPfu 缓冲液，dNTP各O. 2mM，每种引物各30刚，0. 6U Pfu聚合酶)，PCR反应程序为 94。C预变性60s， 94。C变性30s， 58°C退火30s， 72。C延伸30s，共30cycles, 最后72。C延伸5min。通过DNA改组，获得了含有重组Na7H+逆向转运蛋白基因片段的重组基因库。实施例3.表达改组文库的构建及耐高盐化+川+逆向转运蛋白基因的筛选用Sal I和Sma I对实施例2得到的重组产物进行酶切，纯化后连接到同 样酶切的酵母表达载体pYPGE15中，用乙酸锂方法将构建的表达改组文库导入 酵母突变株W303-lBAenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl中，涂布到含100mM NaCl (不含尿嘧啶)的APG选择培养基上，3(TC，培养2d，进行耐高盐Na+AT逆向 转运蛋白基因的高通量筛选。最终得到了一个正常生长的酵母突变子，含有新的 植物强耐盐基因AtNHXSl。实施例4. 耐高盐基因AtNHXSl的序列分析用酵母质粒提取试剂盒提取耐高盐的酵母突变子中的质粒进行DNA测序。用 DNA Star、 Clustalx和TMpred等软件对耐高盐N&7H+逆向转运蛋白基因和野 生型Na7H+逆向转运蛋白基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对以及亲水 性疏水性分析。结果显示，AtNHXSl基因与野生型Na7H+逆向转运蛋白基因AtNHXl之间有 7个核苷酸的突变，并且有34个核苷酸的缺失，此缺失造成AtNHXSl基因翻译 的提前终止。AtNHXSl编码蛋白与野生型^+/矿逆向转运蛋白之间有4个氨基酸 的改变，并在C末端有296个氨基酸的缺失。如序列表SEQID N0:1和SEQ ID N0:2。实施例5. 重组载体和宿主细胞的构建用Sal I和Sma I对实施例3中得到的重组质粒pGM-T-AtNHXSl进行酶切， 回收之后连接到经同样酶切的酵母表达载体PYPGE15中，用乙酸锂方法将构建的 AtNHXSl-PYPGE15重组质粒导入到酵母双突变株W303-IB Aenal-4: :HIS3 △ nhxl::TRPl中，在不含尿嘧啶的APG选择性培养基中进行筛选，得到阳性转化 子。实施例6. 酵母功能互补比较实验野生型酵母W303-1B是一种具有耐盐性的酵母，其突变株W303-1B △ enal-4: :HIS3 Anhxl: :TRP1耐盐性很低，将含有AtNHXSl基因的重组载体导入 该酵母突变株，可进行功能互补比较实验。用Sal I和Sma I对重组质粒pGM-T-AtNHXl进行酶切，回收之后连接到经 同样酶切的酵母表达载体PYPGE15中，用乙酸锂方法将构建的重组质粒导入到酵 母双突变株W303-IB Aenal-4::HIS3 Anhxl::TRPl中，同时将空的酵母表达载 体PYPGE15分别导入到野生型酵母W303-1B、酵母突变株W303-IB △ enal-4: :HIS3和W303-1B Aenal-4: :HIS3 Anhxl::TRPl中，在不含尿嘧啶的 APG选择性培养基中进行筛选。将筛选到的阳性转化子和筛选到的耐高盐酵母菌 株分别接种到APG液体培养基中培养，将ODe。。都调整到0. 5，分别进行5倍稀释， 各取5Pl点种到pH5. 5不同盐浓度(0、 50mM、 75 mM、 100 mM、 125 mM NaCl) 的APG平板上，3CTC，培养2d，观察生长情况。结果如图l所示，缺失Na+AT逆向转运蛋白基因的酵母突变株W303-1B △ enal-4::HIS3 Anhxl::TRPl (III)比野生型的酵母菌株W303-1B (I)对盐敏 感的多，表达AtNHXl的酵母突变株W303-IB Aenal-4: :HIS3 Anhxl: :TRP1(IV) 能够部分互补酵母的耐盐性，而AtNHXSl基因能够赋予酵母突变株更强的耐盐性 (V)，这表明此改组获得的Na7H+逆向转运蛋白AtNHXSl比未改组Na+/H+逆向 转运蛋白具有更强的离子转运活性，可以将更多Na+的从胞质中区隔化到液泡中。序列表〈110〉华东师范大学〈120〉 一种新的植物强耐盐基因At图XSl及其编码蛋白和应用〈160〉 2〈210〉 1〈211〉 1583〈212〉 腿〈213〉人工序列〈400〉 1atgttggattctctagtgtcg已aactgccttcgttatcgacgcttxtgtg60gUgcgUgeteLtctctttgttgcacctctttgtgcttgtattgUcUggtcatcttttg120gaBgagaateigatggatg肌cgaatccatcaccgccttgttgattgggct￡lggC￡LCtggt180gttaccattttgttgattagagctcgcatcttctcgtctttagtgaagat240cttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttca300aagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattatt360tcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttcttta卿agttggacattggaacc420tttgacttgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaaca.gatccagtatgt■ac己ctgc3ggttctg犯tcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcgg卿g540ggtgttgtgsatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctc600actcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctc660ctaagtaccttgcttggtgctgc幼ccggtatgataagtgcgtatgttatc犯g^gctg720cccttatgatgcttatggcgtatctttcttatstgcttgctgagcttttcgacttgagcg780gtatcctcactgtgtttttctgtggtattgtgatgccccattacacatggC3C幼tgt犯840cgg卿gctc^g犯taac3cctttgcaactttgtcatttcttgcgg卿900catttattttcttgtatgttgg犯tggatgccttggacsttgac鄉tggagatccgtga960gtgacacaccggg咖atcgatcgcsgtgagctcaatcct犯tgggtctggtC3tggttg1020ga鄉gcagcgttxgtctttccgttatcgtttctatct犯1080gcgag犯犯tcaactttaacatgcaggttgtgatttggtggtctggtctcatg卿ggtg1140ctgtatctatggctcttgcatac犯ca已gtttscaagggccgggcacacagatgtacgcg1200gg犯tgcaatcatgatcacgagtacgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttg1260gtatgctgactattaccgcaCC￡lga￡LCgCC1320tgttatctgatgacaacacctacatatccctttgttggaccaagactcgt菌tcattgagccttcagggaaccacaatgtgcctcggcctgacagtatacgtggcttcttga1440cacggcccactcg犯ccgtgcatcactacttgatgactccttcatgcgac1500ccgtctttggaggtcgtggccttgtaccctttgttccaggttctccaact1560ctcctgatcttagt幼ggct1583〈210〉 2〈211〉 242<212〉 PRT <213〉人工序列〈400〉 2Met Leu Asp Ser Leu 1 5His Ala Ser Val Val 20Val Ser Lys LeuAla Leu AsnLeu 25Cys lieSer lie50 Leu lie 65Val Leu Gly 35Thr Ala Leu Ser Lys GlyHis Leu Leu Glu 40Pro Ser Leu Ser Thr Ser Asp 10 15Phe Val Ala Pro Uu Cys Ala 30Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu 45LeuLys 70lie55SerGly SerLeu HisLeu Phe Phe lie Tyr Leu Leu Pro Pro 85Gly Thr Gly 60Leu Leu Veil 75lie lie Phe 90Val 丁hr lie Leu Phe SerAsn AlaGlu Asp 80Gly Phe 95Gin ValPhe GlyVal Thr 130Asp Tyr 145Lys Lys 100Ala Val 115ThrPhe lieArg 105lie 110Lys Gin Phe Phe Arg Asn Phe Val Thr lie Met Leu GlyGin Phe Phe Lys Lys Leulie 120Ser Cys Thr lie lie Ser 125Lys 135AspLeu Ala lie Gly Ala lie Phe 150Thr Leu Gin Val Leu Asn Gin Asp Glu 165lie Gly 丁hr 140Ala Ala Thr 155Thr Pro Leu 170Phe Asp LeuAspProTyrLeu Gly Leu GlyVal Cys 160Ser Leu 175Val PheAsn AlaPhe His 210Leu Gly 225Gly Glu 180lie Gin 195Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Val Phe 1Ser Phe Asp Leu Thr His Leu Asn His Glu Ala Ala 200Leu Leu Gly Asn Phe Leu Tyr 215Ala Ala Thr Gly Met lie SerLeu Phe Leu 220Val 190His 205Leu Ser Thr LeuGly 230Ala Tyr Val 235lie LysLys Leu 240Pro leu
权利要求
1、一种新的植物强耐盐基因AtNHXS1，其特征在于，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)与序列表中SEQ ID NO1限定的核苷酸序列同源性在70-100％、且编码相同功能蛋白质的DNA序列；3)编码序列表中SEQ ID NO2所示蛋白质序列的多核苷酸。
2、 一种新的植物强耐盐基因AtNHXSl的编码蛋白，为具有离子转运活性的 Na7H+逆向转运蛋白，其特征在于，是下列氨基酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO:2;2) 与序列表中SEQ ID NO :2限定的氨基酸序列同源性在70-100%之间 的蛋白质；3) 在SEQ ID N0:2限定的氨基酸序列中增加、减少或替换一个或几个 氨基酸且具有相同活性的蛋白质。
3、 含有权利要求l所述基因的重组载体。
4、 含有权利要求l所述基因的宿主细胞。
5、 权利要求1所述一种新的植物强耐盐基因AtNHXSl在培育抗盐植物方面 的应用，其特征在于，所述植物强耐盐基因AtNHXSl可通过微注射、基因枪、 农杆菌介导、花粉管通道的方法转入植物中，培育出耐盐性及生物学性状得 到改善的植物新品种。
全文摘要
本发明提供了通过DNA改组技术获得的新的植物强耐盐基因AtNHXS1，此基因编码的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白比野生型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白ATNHX1具有更强的离子转运活性的。此基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，也包括与序列表中序列1核苷酸序列同源性在70～100％之间的基因，或编码序列表中序列2氨基酸序列的核苷酸序列。这种新的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸序列的蛋白质或与序列2氨基酸序列同源性在70～100％之间的蛋白质或将序列2氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同活性的蛋白质。本发明还提供了重组载体的构建、转基因植物等方法以应用上述基因和蛋白质，可培育耐盐性更强或其他生物学性状得到改善的转基因植物新品种。
文档编号C12N15/29GK101260403SQ20081003344
公开日2008年9月10日 申请日期2008年2月2日 优先权日2008年2月2日
发明者涛 夏, 凯 徐, 平 洪 申请人:华东师范大学