专利名称：耐辐射异常球菌R1 lea-like基因培育抗干旱植物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐福射异常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) lea-like基因的新功能，具体涉及该基因在增强植物对干旱胁迫抗性方面的应用。
背景技术：
农作物最常遭受的非生物环境胁迫是缺水，干旱对农作物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位(Dracup et al. , 1998)。耐福射异常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株，也可作为一个研究高等植物抗干旱的模式物种(Battista et al. ,2001)。 D. radiodurans Rl含有4个与植物干旱抗性相关的蛋白，其中Iea-Iike基因DR1172编码的蛋白属于LEA 3家族成员，与植物耐脱水性密切相关(Makarova, et al. ,2001)。尽管耐辐射菌株与干旱胁迫抗性在进化上可能具有协同性，但目前未见耐辐射异球菌 Deinococcus radiodurans Rl 中的 lea-like 基因(DR1172,GeneID :1797273)在增强植物干旱抗性方面的功能的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D. radiodurans Rl基因组中发现能够增强植物对干旱的抗性基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得抗干旱的能力。本发明通过如下研究发现，Deinococcus radiodurans Rl的lea-like基因 (DRl 172)具有抗干旱胁迫的功能，可用于培育抗旱性状的植物I、获得含有D. radiodurans Rllea-Iike基因(DR1172)的重组工程菌株I)通过 PCR 从 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因组扩增出 D. radiodurans Rllea-Iike基因(DR1172)，基因序列号为GeneID :1797273。其大小为897bp，该基因编码一个27. SkDa的蛋白(为类胚胎发育晚期丰富蛋白)，含298个氨基酸，，将其克隆于载体 pGEMT-easy上，构建了含有完整lea-like基因的重组质粒pGEMT_lea ；2)将基因(DR1172)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整I ea_l ike基因 (DRl 172)重组质粒 pRADZ3-lea G ；3)将导入lea-like基因(DRl 172)的重组质粒pRADZ3_lea G转入受体大肠杆菌 JM109中，获得工程菌株JM-Iea (详见实施例I)；2、含有D. radiodurans Rllea-like基因工程菌株的干旱抗性实验实验证实，经3M 山梨醇(Sorbitol)冲击后，含有 D. radiodurans Rllea-Iike 基因(DRl 172)的JM-Iea重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受3M山梨醇冲击的能力(因Sorbitol具有吸湿性， 高浓度的Sorbitol溶液可以模拟干旱的环境)。此实验表明D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)具有增强原核生物抗干
3旱的能力。3、lea-like基因(DR1172)在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定I)将 D. radiodurans Rllea-like 基因(DRl 172)连接到植物表达载体pBI121 中， 构建具有lea-like基因(DRl 172)的重组质粒pBI121_lea ;2)将pBI121_lea重组质粒转化油菜中，获得了能够抗干旱胁迫的转基因油菜植株;此实验表明D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)具有培育抗干旱植物的用途(见实施例3及图5-8)。
图I是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)序列的PCR产物验证电泳图谱；图2 是含有 D. radiodurans Rllea-like 基因(DR1172)及 groEL 启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；图3是在高浓度(3M)山梨醇冲击前的含有空载体和含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)表达载体的大肠杆菌重组菌株;图4是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E. coli)在含3M山梨醇培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)表达载体的大肠杆菌重组菌株。图5是干早胁迫16天时转lea-like基因(DR1172)油菜的生长状态照片。图6是干早胁迫16天时非转基因油菜的生长状态照片。图7是非转基因油菜和转lea-like基因(DR1172)油菜干旱处理28天复水前的生长情况的照片；盆中左边是转lea-like基因(DR1172)油菜植株；右边是非转基因油菜植株。图8是非转基因油菜和转lea-like基因(DR1172)油菜干旱处理28天复水后的生长情况的照片；盆中左边是转lea-like基因(DR1172)油菜植株；右边是非转基因油菜植株。
具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如 Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下
克隆载体pGEMT-easy :为Promrga公司市售产品；穿梭质粒pRADZ3 :为本实验室保存；植物表达载体pBI121 :为Clontech公司市售产品；大肠杆菌JM 109 :为北京全式金公司市售产品。根癌农杆菌EHA 105由本实验室保存。实施例ID. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)序列在大肠杆菌中的表达根据已公布的D. radiodurans Rl基因组中的lea-like基因(DR1172)序列设计 I对PCR特异性引物Up 5' ATTAACTAGT CGCAGCGTAGGCTCCTGACA 3Down 5' ACGCCATATG ACTCAGTTCTTGCGGGTGTT 3通过PCR方法从D. radiodurans Rl基因组DNA中扩增出目的基因序列。反应条件94°C IOmin, [94°C 60sec,55°C 30sec,72°C 60sec] 30 个循环，72°C IOmin0 PCR 产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT_lea，并测序验证；然后通过Spel/Ndel 双酶切获得含有粘性末端的lea-like基因(DR1172)及含有启动子groEL的pRADZ3载体， 将lea-like基因(DR1172)连接于pRAD Z3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3_lea G， 将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该菌株命名为JM-Iea。将含有pRADZ3空质粒的E. coli JM109命名为JM-Z3。实施例2含D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)重组菌株的干旱抗性实验一、实验方法I、将实施例I中获得的2个重组的大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含 Amp抗生素)中，摇瓶过夜培养后(37°C )，再转接于IOOmL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至0D600约0. 5左右(尽量保持0D600值一致)。2、取IOmL的菌液离心后，在等体积的3M山梨醇溶液中冲击此，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10_4，取IOii L点在LB固体培养基表面，经37°C培养16h，观察菌落形成情况并照相(3M山梨醇为高渗溶液，可模拟干旱胁迫)。二、实验结果图3显示，3M山梨醇溶液冲击前，含有D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172) 的JM-Iea菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；3M山梨醇溶液冲击后，含有
D.radiodurans Rllea-like基因(DR1172)的JM-Iea重组菌株生长状况良好，菌落数多于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图4)。三、实验结论D. radiodurans Rllea-like基因(DR1172)增强了原核生物抗干旱的能力。实施例31ea_like基因(DR1172)在油菜中表达及转基因植株的干旱抗性鉴定(一 )农杆菌介导转化油菜实验I.根癌农杆菌EHA105感受态的制备I)挑取单菌落，接种于5mL YEB液体培养基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250rpm 振荡培养过夜；2)取 2mL 菌液，加入 50mL YEB 液体培养基(含 Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm 振荡培养至OD6tltl约0. 6左右；3)将菌液转至50mL无菌离心管中，冰浴30min,5000Xg离心5min ；4)弃上清，沉淀用2mL 20mM CaCl2重悬，每份100 y L分装到I. 5mL离心管中，液
氣中保存备用。2.重组质粒DNA转入农杆菌I)将约I ii g的pBI 121-lea质粒DNA分别加入到100 U LEHA105感受态细胞中，混勻，冰浴5min ；2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37°C水浴中温浴5min ；3)加入ImL YEB液体培养基，在28°C摇床上250rpm复苏4 5h ;4)取适量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固体培养基上，置28 °C培养24 48h。3.农杆菌质粒DNA的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液体培养基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0. 5g/L)，28°C，250rpm振荡培养20h ；2)取 I. 5mL 菌液离心后，弃上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM pH8. 0，NaCl IOmM, EDTA IOmM pH 8. 0)洗涤2次，弃上清，加入预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. 0, IOmM EDTA pH 8.0，RNase A 100 y g/mL) 300 y L，用移液器反复抽吸混匀， 室温静置IOmin ；3)加入新鲜配置的溶液II (0. 2M NaOH, I % SDS) 600 U L，上下颠倒几次混匀；4)加入预冷的溶液III (5M乙酸钾pH 5. 2，冰醋酸11. 5mL，加水至IOOmL) 450 y L， 充分混匀，冰浴5min，4°C 12000 Xg离心5min，上清加入0. 6倍体积的异丙醇沉淀；5)沉淀加 50 ii L TE (Tris-HCI 10mmol/L, lmmol/L EDTA，pH 8.0)溶解后，经 PCR、 Bam HI、Sac I双酶切验证。4.油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的lea-like基因(DR1172)遗传转化I)油菜无菌苗的培养甘蓝型油菜(Brassica napus L. ) (84100-18)种子在超净工作台上用灭菌水浸泡 IOmin, 10 %的NaClO灭菌12min，再用0. I %的升汞溶液消毒7_8min，用灭菌水洗3_5遍，并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上(7.5%琼脂)。光照培养，4-5d龄油菜幼苗最适于遗传转化。2)预培养用75%的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长点下约0. 5cm长的下胚轴，置于预培养基(MS+6-BA 2mg/L+2,4_D lmg/L+AgN032. 5mg/ L+AS 19. 62mg/L)上，光照预培养2d。3)农杆菌的培养在50mL LB液体培养基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入0. ImL Iea-EHA 105菌液，28°C下220rpm振荡培养16h左右，室温下4000 Xg离心lOmin，弃上清液，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100 u mol/L)悬浮，稀释到原体积的5_20倍，在 28°C下220rpm振荡培养lh，使菌液的OD6tltl达0. 5左右。
4)共培养把预培养2d的下胚轴放入菌液中浸染lmin，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，用封口膜封好培养皿，25 °C左右，于暗处共培养约2d(暗培养)。5)诱导培养把共培养2d的下胚轴放到诱导培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25°C左右光照培养，每2周继代I次，直至长出膨大的愈伤组织。6)选择培养 把膨大的愈伤组织转移到筛选培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25°C左右光照培养，每2周继代I次，直至长出苗。7)生根培养当幼芽长到l-2cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养基上 (1/2MS+NAA 0. 5mg/L+Kan 25mg/L)进行生根培养。在抗生素筛选条件下，约87%的芽在2 周后形成根。8)炼苗和移栽生根后的幼苗长到5-6cm高时，半敞开培养瓶盖子，进行炼苗；待幼苗适应外界环境以后，转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养，并用1/2MS培养液浇灌。当幼苗生长至7-9cm 时，将幼苗移植到泥土中生长，然后再进行下一步实验。(二)含lea-like基因(DR1172)序列转基因油菜的抗旱性鉴定I、实验目的鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对干旱胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行抗旱性鉴定。2、实验方法对苗期的转基因油菜植株和非转基因油菜植株均分别一次性浇足营养液后不再浇水，并进行以下实验对比I)观察油菜植株的生长情况从浇足营养液后的当天开始起算，28天内不再浇水及营养液；第28天起恢复浇水，并在第28天当日浇足营养液，之后仅酌情浇水。2)测定叶片含水量从停止浇水第二天起，每隔一天测定叶片相对含水量 (ReIativewatercontent,)；含水量的测定方法从植株上取下约0. Ig叶片后，立即称取鲜重(FW)，然后将叶片浸入去离子水中4h，取出用滤纸吸去表面水分，称取饱和鲜重(TW)，然后将叶片放入烘箱于70°C烘干至恒重，称取干重(DW)。相对含水量(RWC)按下式计算RffC(% ) = (Fff-Dff) / (Tff-Dff) X 100%。3、实验结果I)油菜植株的生长情况对比结果干早胁迫第4天时，非转基因油菜在叶片已经开始萎蔫；转基因油菜叶片饱满，生长正常；干旱胁迫第10天时，非转基因油菜失水严重，叶片萎蔫；转基因油菜依然正常生长;干旱胁迫第16天时，非转基因油菜叶片萎蔫、变黄(见图5);转基因油菜的叶片才开始萎蔫(见图6);干旱胁迫第28天时，非转基因油菜及转基因油菜叶片均萎蔫(见图7);28天恢复浇水后，非转基因油菜叶片枯黄、萎蔫，不能正常生长；而转lea-like基因(DR1172)的油菜迅速恢复生长，叶片变绿(见图8)。表I转基因油菜和非转基因油菜对干旱胁迫的比较
权利要求
1.Deinococcus radiodurans Rllea-Iike 基因(DR1172，GeneID :1797273)培育抗干旱植物的用途。
2.含Deinococcus radiodurans Rllea-Iike 基因的重组质粒。
3.含Deinococcus radiodurans Rllea-Iike 基因的重组工程菌株。
4.含Deinococcusradiodurans Rllea-Iike基因的重组质粒培育抗干旱植物的用途。
5.权利要求4所述的用途，所述重组质粒是能在大肠杆菌表达的质粒。
6.权利要求4所述的用途，所述重组质粒是能在植物中表达的质粒。
7.权利要求4所述的用途，所述重组质粒转化的宿主细胞培育抗干旱植物的用途。
8.权利要求7所述的用途，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
9.权利要求I或4所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的lea-like基因(DR1172)具有增强原核生物及植物的抗逆能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，lea-like基因(DR1172)在原核宿主细胞和油菜中表达后，均能增强其干旱抗性。
文档编号A01H5/00GK102586282SQ20121004623
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者张维, 林敏 , 江世杰, 王劲, 郝艳华, 陈明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所