专利名称：：MuMADS2在培育果实品质改良的转基因植物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及ー种MUMADS2在培育果实品质改良的转基因植物中的应用。
背景技术：
：MADS-box基因编码的蛋白质是ー类在进化上十分保守的数目庞大的转录因子家族，植物中首先分离出的MADS-box基因是从金鱼草中分离出的DEFICENS(DEF)及从拟南芥中分离出的AGAMSUS(AG)基因，随后通过对这两种模式植物的不断研究，发现MADS-box基因在花的发育过程中起着重要的作用，调控了植株从开花时间、花器官的形成、花粉的发育及育性等等。果实成熟过程是ー个非常复杂的变化过程，包含了一系列生理生化过程的改变，如细胞壁结构变化、淀粉与糖代谢的改变(changesinsugar/starchmetabolism)、色素等次生代谢产物的形成等。这些变化是植物体内多种遗传及生理生化反应的結果。果实根据成熟过程こ烯产生的特点分为跃变型果实和非跃变型果实，跃变型果实模式植物如番茄，通过番茄成熟突变体rin/cnr/nor的获得对果实成熟调控基因的研究得到深入，已经证实こ烯在果实成熟过程中扮演着重要角色，该激素是实现番茄和其它跃变型果实成熟的基本条件。番茄中控制成熟的LeMADS-RIN是MADSboxSEPALLATA(SEP)家族成员，是番茄果实成熟必需的。Vrebalov等发现由于番茄基因组缺失了一段3kb的DNA而得到了rin突变体,导致了两个串联的MADS-box基因的失活，即LeMADS-RIN和LeMADS_MC。LeMADS-RIN的突变使果实不能成熟，转录水平上的表达分析结果表明LeMADS-RIN主要在果实中表达，井随果实成熟而表达增强。同年，Vrebalov等人又从非跃变型果实草莓中分离出了同源基因Fv-MADS-9，该基因呈现果实专ー的表达模式，并证明MADS-box基因是果实成熟的上游调控因子，同时调控跃变型果实和非跃变型果实的成熟。体内证据表明RIN蛋白能与番茄的こ稀生物合成关键酶基因——ACS2的顺式作用元件结合，由此推测RINMADS-box转录因子可能是通过调控ACS2的表达来调控果实的成熟的。ElitzurT等(2010)从香蕉中克隆了6个MADS-box基因MaMADSI-MaMADS6，分别研究了它们在香蕉果实发育采后成熟过程中果皮和果肉及在こ烯诱导下的表达等，结果表明果皮和果肉中发生的是两个相对独立的成熟过程。在果肉中，主要是与MaMADS4，和5以及后期的MaMADSl的激活有关，而在果皮中，主要是与MaMADSl和3的转录激活有夫。因此，这类转录因子可能參与到成熟过程的调控网络控制着果实的成熟。香蕉(Musacuminata)是重要的热带水果，果实是典型的こ烯跃变型果实，随着采后こ稀的形成果实完成后熟过程而迅速成熟裳老。
发明内容本发明的ー个目的是提供MuMADS2蛋白或MuMADS2蛋白的编码基因的新用途。本发明提供了MuMADS2蛋白或MuMADS2蛋白的编码基因在调控植物表型、改良植物果实品质和/或提高与果实成熟相关基因表达量中的应用；所述MUMADS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述应用中，所述调控植物表型体现在降低植物株高、减小植物果实重量和/或减少植物种子数量；所述改良植物果实品质体现在提高植物果实的氨基酸、胡萝卜素、番茄红素、叶黄素和/或抗坏血酸含量；所述氨基酸具体为天门冬氨酸和/或谷氨酸；所述与果实成熟相关基因为ACS2、CNR、E8、PG、PSY1和TAGLl中的至少ー种；所述植物具体为双子叶植物或者单子叶植物；所述双子叶植物进ー步具体为番爺;所述MuMADS2蛋白的编码基因为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸。本发明的另ー个目的是提供ー种培育转基因植物方法。本发明提供的方法，为将MUMADS2蛋白的编码基因导入目的植物，获得具有如下I)-5)中至少ー种特征的转基因植物I)所述转基因植物的株高低于所述目的植物；2)所述转基因植物的果实重量小于所述目的植物；3)所述转基因植物的种子数量小于所述目的植物；4)所述转基因植物果实的品质得到改良；5)所述转基因植物果实中的所述与果实成熟相关基因表达量高于所述目的植物；所述MUMADS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述方法中，所述MuMADS2蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸。上述方法中，所述转基因植物果实的品质得到改良体现在如下A-EA、所述转基因植物果实的氨基酸含量高于所述目的植物；B、所述转基因植物果实的胡萝卜素含量高于所述目的植物；C、所述转基因植物果实的番茄红素含量高于所述目的植物；D、所述转基因植物果实的叶黄素含量高于所述目的植物；E、所述转基因植物果实的抗坏血酸含量高于所述目的植物。上述方法中，所述氨基酸为天门冬氨酸和/或谷氨酸。上述方法中，所述MUMADS2蛋白的编码基因通过表达载体导入所述目的植物。上述方法中，所述表达载体为将所述MuMADS2蛋白的编码基因插入pCAMBIA1302中，得到的表达MuMADS2蛋白的载体；在本发明的实施例中，表达载体具体为将序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸插入pCAMBIA1302的NcoI和SpeI酶切位点间得到的载体。上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物；所述双子叶植物具体为番爺。本发明的第三个目的是提供ー种表达载体。本发明提供的表达载体，为将MuMADS2蛋白的编码基因插入pCAMBIA1302中，得到的表达MuMADS2蛋白的载体；；在本发明的实施例中，表达载体具体为将序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸插入pCAMBIA1302的NcoI和SpeI酶切位点间得到的载体。所述MuMADS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2;所述MuMADS2蛋白的编码基因具体为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸。本发明的实验证明，本发明将MUMADS2导入番茄中，获得35S启动子驱动的转MuMADS2番茄株系，过量表达MuMADS2降低了植株高度、减少果实种子数量，过表达MuMADS2使得番茄果实ACS2、E8、TAGLUPG、CNR、PSYl等基因的表达显著增强；与野生型番茄果实相比，转基因番茄果实的必需氨基酸含量变化不明显，但天门冬氨酸和谷氨酸含量増加，果实胡萝卜素和抗坏血酸、番茄红素和叶黄素的含量増加；糖含量与野生型相比无显著变化。这些结果显示MUMADS2在果实发育及品质形成过程中发挥着重要作用。图I为MuMADS2在香蕉不同组织的RT-PCR表达分析图2为Southern印迹检测图3为转MuMADS2番茄形态学观察图4为MuMADS2对果实形状、大小的调控图5为MuMADS2对育性的调控图6为MUMADS2在果实发育不同时期表达结果图7为转MUMADS2番茄果实成熟相关基因表达具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中香蕉(MusaacuminateL.AAAgroupcv.Brazilian)果实(开花后100-120天)从中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈香蕉种植园购买。采自绿熟期(花后100天)的果实采后不同成熟期的果实、雄花、雌花、花瓣、雄蕊、花柱和柱头、子房、根、茎和叶于液氮中速冻后-80°C保存备用。番爺(LycopersivonesculentumMill.)为AV6纯系，以下简称为野生型番爺，购自中国热带农业科学院品质资源研究所蔬菜中心)。种植在中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验基地，果实发育不同时期(未熟绿果、绿熟果、转色果、红熟果)采集果实及叶片液氮速冻后_80°C保存备用。实施例I、转MUMADS2番茄的获得I、基因MuMADS2的获得构建香蕉果实采后早期抑制缩减文库(SSH)，获得ー个与MADS-box家族基因同源的cDNA片段。根据该cDNA片段序列设计5’和3’端引物，利用RACE技术扩增5’和3’端，拼接获得I个香蕉MADS-box基因，根据拼接结果设计基因5’和3’端引物，以香蕉果实总RNA反转录cDNA作为模板，扩增，得到的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列1，该核昔酸序列所不的基因命名为MuMADS2,其编码的蛋白为MuMADS2,该蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2。2、香蕉MuMADS2表达分析采后香蕉果实(选取采后7个成熟时期的果实)及其它器官进行总RNA提取、cDNA反转录。根据MuMADS2序列在非保守区设计5’端引物5’-GTCCTCTAAGTGTCAAGGAGC-3’，3’端引物5’-CTGAITCTGCTGCATGAAGIT-3’进行RT-PCR、real-timeqRT-PCR分析。以ACTIN为内參，扩增内參的引物序列为A15，:5，-AGGCAGGATTTGCTGGTGA-3’和A23，5’-ACCAGTGGTACGACCGCTA-3’，扩增长度为398bp。结果如图I所示，MuMADS2在香蕉不同组织的RT-PCR表达分析，其中，M:雄花；F雌花；pe:花瓣；st:雄蕊；sty/sti:花柱和柱头；ov子房;f:果实；r:根；s:；1:叶；可以看出，该基因主要在雌花和雄花的子房以及果实中表达，在其它组织中不表达或表达量很少。3、表达载体的扩增提取香蕉叶片DNA,以M2GFP5’CGICCATGdIGAAGGGGTAAG;M2GFP3’GCG^CTAG^'TGCAGCAGAATCAGT为引物，得到约702bp的PCR产物。将得到的PCR产物用NcoI和SpeI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的PCAMBIA1302载体(香蕉MuMADS2基因表达产物的亚细胞定位，2010，热带作物学报，第31卷第9期，777-781，公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得。)连接，得到连接产物，将连接产物转化大肠杆菌，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸插入pCAMBIA1302的NcoI和SpeI酶切位点间得到的载体，命名为pCAMBIA1302-MuMADS2。4、重组菌的获得将pCAMBIA1302_MuMADS2转入AgrobacteriumtumefaciensLBA4404(香蕉MuMADS2基因表达产物的亚细胞定位，2010，热带作物学报，第31卷第9期，777-781，公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得。)中，得到重组菌，提取重组菌的质粒测序，该质粒为pCAMBIA1302-MuMADS2，将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/pCAMBIA1302-MuMADS2o5、转MuMADS2番茄的获得及鉴定I)转MuMADS2番茄获得将上述LBA4404/pCAMBIA1302-MuMADS2侵染野生型番茄的叶片，农杆菌侵染了约700个叶盘。分化出的芽经过筛选获得45个抗性芽，最后移栽成活了37株抗性植株，转化效率为5.29%;得到37株TO代转MuMADS2番茄。2)转MUMADS2番茄的鉴定提取TO代转MuMADS2番茄的进行Southern印迹检测，以野生型番茄(WT)为对照，探针引物为M2probel:5’-TCAGGTGCCAITGTAGAT-3’和M2probe25，-GTCATAGCCAAGATGGAG-3，。结果如图2所示，27、15、53、26、28、13、56、57、23、12、4、8为TO代转MuMADS2番茄的不同株系，WT为野生型番茄，可以看出，得到9株编号为L53、L56、L57、L15、L27、L4、L13、L12、L26的阳性TO代转MuMADS2番茄。采用同样的方法将空载体PCAMBIA1302转入野生型番茄中，得到TO代转空载体番茄，按照上述方法进行Southern印迹检测，未检测到目的片段，说明得到阳性TO代转空载体番爺。将上述TO代植物均播种、收种，直到得到T2代纯合株系。实施例2、转MUMADS2番茄的功能研究I、转MuMADS2番茄的表型播种编号为L12、L13、L15、L26、L27、L53、L56的T2代转MuMADS2番茄(MuMADS2)、T2代转空载体番茄和野生型番茄(对照)，将以上株系番茄种子播在育苗钵中，在25°C，光照30001ux,8h/d下培养，生长2个月左右当植株生长健壮，株高达15-20cm时将幼苗转入大田。每个株系20株，实验重复三次，结果取平均值土标准差。结果如图3-图5所示，其中图3为形态学观察，图4为MuMADS2对果实形状、大小的调控，图5为MuMADS2对育性的调控；图3中看出，T2代转MuMADS2番茄植株与野生型番茄相比表现出不同程度的矮化现象；在花发育方面，个别株系花药变异发育成花瓣或雌蕊，且子房明显增大；转基因番茄L53表现出矮化，茎粗壮而直立，生长紧凑；节间短缩；丛生芽；叶片外观也相当特殊，叶缘较平滑且向叶反面方向卷曲，而对照株的叶片多为裂叶，叶片数量和大小也都高于转基因植株，淡緑色；果实卵圆形，种子数量明显低于对照株，甚至是不育的；统计株高，结果如下编号为L12、L13、L15、L26、L27、L53、L56的7个转基因株系的高度分别为(单位cm):113.25±4.03,54.25±11.44,57.25±4.65,78.75±13.15、55.25±2.50,44.75±6.95,48.25±7.23，野生型番茄的株高为126.75±3.50cm；图4中看出，T2代转MuMADS2番茄植株与野生型番茄相比果实变小重量减轻；统计果重(果实重量)，结果如下编号为L12、L13、L15、L26、L27、L53、L56的7个T2代转MuMADS2番茄的单果重分别为(单位克)4.51±1.47,2.72±0.62,3.69±0.61、5.13±0.77,5.59±0.42,6.24±0.97,5.07±0.81，而野生型番茄果重6.33±1.03克；图5中，A为绿熟期野生型番茄，B为绿熟期T2代转MuMADS2番茄，C为红熟期野生型番茄，D为红熟期T2代转MuMADS2番茄，可以看出，T2代转MuMADS2番茄植株与野生型番茄相比种子数量減少。统计红熟期的种子数量如下编号为L12、L13、L15、L26、L27、L53、L56的7个转基因株系的种子数量均減少，7个株系果实的种子粒数分别为22.47±9.23,7.87±3.89、22.47±9.23,23.60±6.94,2.00±0.02、0±0、5.2±2.60，而野生型番茄为每个果实48.60±8.92粒；T2代转空载体番茄和野生型番茄结果无显著差异。2、番茄果实品质相关指标测定采收编号为L56、L13、L26的T2代转MuMADS2番茄、T2代转空载体番茄和野生型番茄的红熟期(redmature-RM)果实，分别测定氨基酸含量、糖含量、胡萝卜素、番茄红素、抗坏血酸和叶黄素含量这些与品质相关指标。每个株系3株，如无特殊说明，实验重复三次，结果取平均值。氨基酸含量的检测方法记载在YuShanetal.2010AMINO-ACIDANDMINERALCOMPOSITIONOFStellariamedia.ChemistryofNaturalCompounds，Vol.46，No.4;糖含量的检测方法记载在MatejaCetal.2006Influenceofbranchbendingonsugarorganicacidandphenoliccontentinfruitsof‘Willians’pear(PyruscommunisL.).JSciFoodAgric86:2463-2467；胡萝卜素的检测方法记载在OlivesBarbaetal,2006ApplicationofaUV-visdetection_HPLしmethodforarapiddeterminationoilycopeneandb-caroteneinvegetables.FoodChemistry95328-336；番煎红素的检测方法记载在OlivesBarbaetal,2006ApplicationofaUV-visdetection-HPLCmethodforarapiddeterminationoilycopeneandb-caroteneinvegetables.FoodChemistry95328-336；抗坏血酸的检测方法记载在MichaelTausz，etal.1996，SimultaneousDeterminationofAscorbicAcidandDehydroascorbicAcidinPlantMaterialsbyHighPerformanceLiquidしhromatography.Phytochemicalanalysis,vol.7.69-721996；叶黄素的检测方法记载在BrendonD.Gilletal.2008,LiquidchromatographicmethoaIorthedeterminationoiluteminmilkandpediatriciormulas.丄nternationalDairyJournal18894-898；I)17种氨基酸含量检测编号为L56的T2代转MuMADS2番茄和野生型番茄红熟期(redmature-RM)果实结果如表I-表2所不表I为野生型番茄的17种氨基酸含量第二次检第一次检测测含量平均值标准偏相对标准偏名称含量(g/kg)(g/kg)(g/kg)差差天n冬氨__(Asp)__0.8784__0.8750__0.8767—0.0024_0.2742苏氨酸(Thr)0.22790.2259_0.2269_0.0014_0.6233丝氨酸(Ser)0.24520.23650.24090.00622.5542谷氨酸(CUu)3.30713.2782:3.2927:0.0204'0.6206_甘氨酸(Glv)0.26110.25480.25800.00451.7270丙氨酸(Ala)0.42250.42170.42210.00060.1340胱氨酸(Cys)0.54000.53590.53800.00290.5389缬氨酸(Val)0.35680.35290.35490.00280.7771蛋氨酸(Met)0.31110.3667:0.3389:0.0393:11.6008:异亮氨酸_(Ile)__0.3148__0.3722__0.3435_0.0406_11.8160亮氨酸(Leu)0.40510.46310.4341_0.0410_9.4476.酪氨酸(Tyr)0.65110.70920.68020.04116.0403苯丙氨酸_(Phe)__0.56350.6407」—0.6021」0.0546_9.066权利要求1.MuMADS2蛋白或MuMADS2蛋白的编码基因在调控植物表型、改良植物果实品质和/或提闻与果实成熟相关基因表达量中的应用；所述MuMADS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述调控植物表型体现在降低植物株高、减小植物果实重量和/或減少植物种子数量;所述改良植物果实品质体现在提高植物果实的氨基酸、胡萝卜素、番茄红素、叶黄素和/或抗坏血酸含量；所述氨基酸具体为天门冬氨酸和/或谷氨酸；所述与果实成熟相关基因为ACS2、CNR、E8、PG、PSY1和TAGLl中的至少ー种；所述植物具体为双子叶植物或者单子叶植物；所述双子叶植物进ー步具体为番茄；所述MuMADS2蛋白的编码基因为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸。3.ー种培育转基因植物方法，为将MUMADS2蛋白的编码基因导入目的植物，获得具有如下I)-5)中至少ー种特征的转基因植物1)所述转基因植物的株高低于所述目的植物；2)所述转基因植物的果实重量小于所述目的植物；3)所述转基因植物的种子数量小于所述目的植物；4)所述转基因植物果实的品质得到改良；5)所述转基因植物果实中与果实成熟相关基因表达量高于所述目的植物；所述MuMADS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述MUMADS2蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述转基因植物果实的品质得到改良体现在如下A-EA、所述转基因植物果实的氨基酸含量高于所述目的植物；B、所述转基因植物果实的胡萝卜素含量高于所述目的植物；C、所述转基因植物果实的番茄红素含量高于所述目的植物；D、所述转基因植物果实的叶黄素含量高于所述目的植物；E、所述转基因植物果实的抗坏血酸含量高于所述目的植物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述氨基酸为天门冬氨酸和/或谷氨酸。7.根据权利要求3-6任一所述的方法,其特征在于所述MuMADS2蛋白的编码基因通过表达载体导入所述目的植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述表达载体为将所述MUMADS2蛋白的编码基因插入PCAMBIA1302中，得到的表达MuMADS2蛋白的载体。9.根据权利要求3-8任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物；所述双子叶植物具体为番茄。10.ー种表达载体，为将MuMADS2蛋白的编码基因插入pCAMBIA1302中，得到的表达MuMADS2蛋白的载体；所述MuMADS2蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2;所述MuMADS2蛋白的编码基因具体为序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-702位核苷酸。全文摘要本发明提供了MuMADS2在培育果实品质改良的转基因植物中的应用。本发明提供了MuMADS2蛋白或MuMADS2蛋白的编码基因在调控植物表型、改良植物果实品质和/或提高与果实成熟相关基因表达量中的应用；所述MuMADS2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明将MuMADS2导入番茄中，获得35S启动子驱动的MuMADS2转基因番茄7个独立株系，过量表达MuMADS2降低了植株高度、减少果实种子数量，这些结果显示MuMADS2在果实发育及品质形成过程中发挥着重要作用。文档编号C12N15/29GK102827263SQ20121031673公开日2012年12月19日申请日期2012年8月31日优先权日2012年8月31日发明者徐碧玉,金志强,刘菊华,贾彩红,张建斌,王甲水,李羽佳,谭光兰申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所