专利名称：一种能够自发消除农残的果实种质培育方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种能特异性降解果实中 农药残留的植物种质的培育方法。
背景技术：
农药污染是全球性环境问题之一 ，有机磷农药又是其中使用量最大、 施用面最广、毒性最高的一类化合物。有些农药具有"三致"物质，致癌与 致突变作用的潜伏期可达数十年以上，有的农药是环境激素，进入动物和 人体后干扰内分泌，使生殖机能异常。目前已查明的"环境激素名录"中，有
机化合物有67种，其中农药为44种，占65.7%。全世界每年需要施用百 万吨农药，但直接用于靶标生物的不超过5%,绝大多数农药残留释放到环 梗中(Pimental andLevitan 1986)。全世界因有机磷农药中毒每年死亡人数达 数十万，主要发生在发展中国家(Eddleston M. 2000; Eddleston M, 2004)。 有机磷农药在蔬菜中的残留不可忽视，2003年土耳其番茄中最大乐果残留 水平达到mg/kg，而年产量达到425000吨(Anonymous 2003)。 2004年 P.Aysal等通过"C标记乐果，检测番茄果实中有机磷农药乐果残留，发现 季中或季末残留水平达到0.49ppm和0.45ppm,超过了欧盟最大乐果残留限 制的0."ppm,其中果酱富集k残比果汁高(P. Aysal， 2004)。
我国是个农业大国，也是生产和消费农药的大国。近年来，我国每年 生产的农药品种约200多个，加工铺剂500多种，原药的生产量约40万吨， 排名世界第2位，农药中杀虫剂占70%以上，而高毒的有机磷杀虫剂又占 70%以上。每年农药使用达45亿亩次，其中70-80%的农药直接散落到环境 中，对土壤、地表水、地下水和农产品造成污染。据统计，每年引发数万 起人员中毒伤亡事件，中毒的人数占世界同类事故中毒人数的50%。
农药的大量施用与滥用，使农产品中农药残留量超标。不仅农产品表 面农药残留高，而且由于许多农药具有接触吸收作用，可以渗透进农产品 内部，尤其是植物源农产品还可以通过维管束从水体中吸收而富集，导致 农副产品农药残留超标，并进一步进入生物一随。如茶叶中DDT超标，蜂蜜 中含有杀虫醚，苹果中含有曱胺磷，葡萄汁商品饮料中检测到甲基内吸磷、 克线磷、曱硫威(Yolanda Pic6,2007),番茄酱中含有多种有机磷(李锋格， 2006)，冻猪肉、冻免、冻鸡中农药残留超标等，严重影响我国的对外贸易。
利用农药降解基因构建工程菌用于降解酶生产或农残修复，已进行了 一些研究。Shimazu等用INPNC-OPH把农药水解酶OPH定位到大肠杆菌(Eco//)和摩氏杆菌(Morare//" sp.)细胞表面，使其能够同时降解有机
磷农药和PNP。 Lan等在pETDuet中同时表达了来自黄杆菌的有机磷水解
酶基因opd和来自致倦库蚊Culex pipiens的羧酸酯酶基因bl,携带该载体
的工程菌可以同时降解有机磷、氨基曱酸盐和拟除虫菊酯三类农药。蒋建
东等将mpd基因插入到鞘氨醇单胞菌CDS-1菌抹的rDNA位点且不带入外
源抗性，工程菌抹CDS-lmpd和CDS-2mpd能同时降解曱基对硫磷和克百
威。已有研究主要集中在使用基因工程菌或其生产的降解酶修复农药污染 的水体和土壤。
发明内容
本发明的目的是克服上述缺点而提供的一种既能降低果实的农药残 留，同时也不影响田间农药的功效，从而有利于提高产量和质量的一种能 自发消除农残的果实种质培育方法。
本发明的一种能自发消除农残的果实种质的培育方法，包括下列步骤 (1 )按常规方法克隆果实特异性启动子
所述的果实特异性启动子是E8等果实特异性基因表达启动子；根据 Genbank accession: AF515784.1中提供的E8启动子序列的特点，设计引物 以番茄DNA为模板做PCR扩增，E8启动子的引物为
P1: 5 ，-CCCAAGCTTAGGAATTTCACGAAATCG -3';
P2: 5 ，-CGCGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATG -3'; (2 )人工合成有机磷水解酶OPH的基因
所述的有机磷水解酶具有Genebank Accession: AAA24930所述氨基酸 序列，根据番茄密码子偏好性翻译成碱基序列后人工合成而得； (3 )构建果实特异性OPH植物表达载体
将E8扩增产物和人工合成的OPH基因序列分别连接到pGEM-T easy 上构建出pGEM-E8和pGEM-OPH,然后用HindIII和BamHI双酶切 pGEM-TE8和pSH,把E8构建到pSE8;用EcoRI单酶切pGEM-OPH和 pSE8，把OPH构建到pSE80P,筛选出正向连接载体，从而得到果实特异 性启动子驱动的植物表达载体备用；
(4) 转化土壤农杆菌和植物外植体 所述植物外植体来源于番茄、黄瓜或辣椒等植物。
将表达载体pSE80P用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404,挑取含有 表达载体pSE80P的农杆菌单菌落，在含100mg'U1 Km和20 mg'L/1 Rif的 YEP培养基中28。C震荡培养至OD600为0.5-0.7, 6000rpm离心5min收集 菌体，用MS重悬培养基重悬菌体；挑选鲜嫩的植物外植体于重悬的菌液 中浸泡10min,用无菌滤纸吸干菌液后接于共培养基上，2天后转入脱菌培 养基(含06纟30011^七-1)上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；
(5) 转基因植抹的分化、移栽
5将在脱菌培养基上存活下来的外植体接于分化培养基上，分化的幼苗
长至2-3cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5-10cm时打开瓶差，炼
苗3-5d后移植到土壤中。
所述MS重悬培养基中含有100 mg.L-1 AS及20 g'L一蔗糖。 所述预培养基中含有l.Omg丄-1 6-BA、 0.1 mg.L" IAA及20g.U1蔗糖。 所述共培养基中含有l.Omg丄"6-BA、 O.lmg.L"IAA、 100mg七-'AS及 20g丄"蔗糖。
所述脱菌培养基中含有1.0mg.L/1 6-BA、 0.1 mg'L" IAA、 300mg.L—1 Cef 及30g'L—'蔗糖；
所述分化培养基含有l.Omg.L" 6-BA、 0.1 mg丄"IAA、 300mg.L/1 Cef、 70mg七"Km及30g'U'蔗糖；
所述生根培养基中含有0.1 mg丄"IAA、 300 mg'L—1 Cef、 70mg.L一 Km 及20 g七—1蔗糖。
除生根培养基以1/2MS为基础培养基，其余培养基均以MS为基础培 养基。
其中1LMS培养基中包含硝酸钾(KN03) 1900mg,硝酸铵(NH4N03) 1650mg,氯化钓(CaC12'2H2O)440mg，硫酸镁(MgS04.7H20) 370mg，磷酸 二氢钾(KH2P04) 170mg , 硫酸锰(MnS04'4H20) 22.3mg , 硫酸锌 (ZnS04'7H20) 8.6mg,硼酸(H2B03) 6.2mg,碘化钾(KI) 0.83mg,钼酸钠 (Na2Mo04.2H20) 0.25mg,乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg, 硫酸亚铁(FeS04.7H20) 27.8mg,硫酸铜(CuSO小5H20) 0.025mg,氯化钴 (COC12.6H20) 0.025mg,肌醇100mg,烟酸0.5mg,盐酸石克胺素(维Bl) O.lmg,盐酸吡,素(维B6)0.5mg,甘氨酸2mg, PH值5.80。 1LYEP培养 集中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl， PH值7.20。
由上可知，本发明的方法与现有技术相比，本发明以农杆菌介导法把 由杲实特异性启动子E8和有机磷水解酶OPH基因构建的植物表达载体 pE80P转化植物外植体，使其获得果实特异性降解有机磷农药残留的能力， 也不影响整个植株喷施农药对病害防治的功效，增强了果蔬的食品安全。 以下通过具体实施方式
来进一点说明本发明的有益效果。
图1 E8启动子的克隆；
图2人工合成有机磷水解酶OPH基因的碱基序列及氨基酸序列; 图3植物表达载体pE80P的构建示意图； 图4番茄GUS染色与酶活分析具体实施例方式
实施例l:自发消除农残的番茄种质培育(1 )按常规方法克隆果实特异性启动子
从番茄叶片中提取基因组DNA,用PCR方法克隆UKbE8启动子(见 图l),根据GenbankID: AF515784J中提供的E8启动子序列设计PCR引 物，由上海捷瑞生物工程公司合成，序列为
P1: 5, -CCCAAGCTTAGGAATTTCACGAAATCG -3';
P2: 5 ,-CGCGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATG -3';
上游引物引入HindIII酶切位点，下游引物引入BamHI酶切位点。按 照质粒pGEM-T easy使用说明，将克隆产物连接到质粒pGEM-T easy上转 化￡. co// TGI,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，送北京三博远志生物公司 测序，以获得正确的E8启动子基因序列。
(2 )人工合成有机磷水解酶OPH的基因
根据Genebank gi:148713公布有机磷水解酶氨基酸序列和番茄密码子 偏好性，设计OPH基因序列(见图2),由上海捷瑞生物工程公司合成。
(3) 构建果实特异性OPH植物表达载体
将E8扩增产物和人工合成的OPH基因序列分别连接到pGEM-T easy 上构建出pGEM-E8和pGEM-OPH,然后用HindIII和BamHI双酶切 pGEM-TE8和pSH,将E8启动子替换pSH上35S启动子，把E8构建到pSE8; 用EcoRI单酶切pGEM-OPH和pSE8，由T4 DNA连接酶连接，把OPH构 建到pSESOP，然后通过HindIII和KpnI双酶切筛选正向植物表达载伴，从 而得到果实特异性启动子驱动的植物表达载体，转化￡. co// TG1保存菌种 备用(见图3)。
质粒pGEM-T easy购自Promega公司，所有宿主菌co/z' TG1和 爿grai)flcten.ww ZwMey^c/era LBA4404由本室j呆存。LA.Taq DNA聚合酶，以 及各种限制性内切酶BamHI、 Kpnl、 HindIII和EcoRI、 T4 DNA连接酶均 为TaKaRa产品，其余试剂为分析纯。细菌增殖培养所用培养基为LB培养 基，含质粒菌体的培养基中加卡那霉素浓度为100mg/l;
(4) 转化土壤农杆菌和番茄外植体
将表达载体pSE80P用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404。挑取含有 表达载体pSE80P的农杆菌单菌落，在含lOOmg丄-1 Km和20 mg丄-1 Rif的 YEP培养基中28。C震荡培养至OD600为0.5-0.7, 6000rpm离心5min收集 菌体，用MS重悬培养基重悬菌体用于侵染番茄外植体。
小皇后樱桃番茄种子购买自中国农科院蔬菜花卉所。成熟的番茄种子 用75。/。酒精浸泡45s,再用0.05。/。HgC12浸泡60S,用无菌水清洗5次，吸 干水分接于MS培养基上，当种子萌发有5cm高并且子叶充分伸展时，切 取下胚轴和子叶块在预培养基上培养2天。番茄的遗传转化采用农杆菌介 导法。将预培养的番茄下胚轴和子叶块在重悬的菌液中浸泡10min,用无菌 滤纸吸干菌液后接于共培养基上，2天后转入脱菌培养基(含Cef 300mg丄") 上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；(5)转基因植抹的分化、移栽
将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为4000ux、 Mh/d。每20天继代一次，分化的幼苗长至3-5cm时转移至生根培养基中培 养，待苗长至5-10cm时打开瓶盖，炼苗3-5d后移植到土壤中。
植物组织培养各个阶段培养条件为诱导、转化为暗培养；脱菌、分 化、生根为光培养，光强为40001ux、 14h/d。MS重悬培养基中含有lOOmg-L" AS及20 g.L"蔗糖；预培养基中含有l.Omg.L" 6-BA、 0.mg.L" IAA及 20g'L"蔗糖；共培养基中含有l.Omg.U1 6-BA、 0.1 mg.L-1 IAA、〗00 mgl/'AS 及20g七"蔗糖；脱菌培养基中含有l.Omg.L" 6-BA、 0.1 mg'!/1 IAA、 300mg.L" Cef及30 g.L-1蔗糖；分化培养基含有l.Omg.L" 6-BA、 0.1 mg.U'IAA、 300mg丄-'Cef、 70mg.L/1 Km及30g七-'蔗糖；生根培养基中含 有0.1 mg丄—1 IAA、 300 mg'L/' Cef、 70mg'L" Km及20 g'U1蔑糖。实验中除 生根培养基以1/2MS为基础培养基，其余培养基均以MS为基础培养基。
其中1LMS培养基中包含硝酸钾(KN03) l卯Omg,硝酸铵(NH4N03) 1650mg,氯化钓(CaC12'2H2O)440mg,硫酸镁(MgS04'7H20) 370mg,磷酸 二氮钾(KH2P04) 170mg , 硫酸锰(MnS04.4H20) 22.3mg , 硫酸锌 (ZnS04.7H20) 8.6mg，硼酸(H2B03) 6.2mg,碘化钾(KI) 0.83mg,钼酸钠 (Na2MoO4-2H20) 0.25mg，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg, 硫酸亚铁(FeS04.7H20) 27.8mg,硫酸铜(CuSO小5H20) 0.025mg,氯化钴 (COC12.6H20) 0.025mg,肌醇100mg,烟酸0.5mg,盐酸石充胺素(维Bl) O.lmg,盐酸吡,素(维B6)0.5mg,甘氨酸2mg, PH值5.80。 1LYEP培养 集中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl， PH值7.20。
通过以下方法进4亍快速检测
a. 、 OPH基因对番茄的瞬时转化
将制备表达载体pE80P的农杆菌LBA4404在含100 mg七"Km和20 mg七-i Rif的YEP培养基中28。C震荡培养至OD600约为0.5-0.7时，在 6000rpm下5min收集菌体，用MS重悬培养基重悬菌体至OD600约为2.0。 用lml注射器从青果期樱桃番茄基部插入3-4mm深，4巴6ml左右重悬菌液 轻緩注入番茄果肉組织中，28。C培养3d后进行分析。
b、 转化番茄的GUS染色和酶活检测
转化后培养3d,切取薄片进行GUS染色，切取染色成功的番茄、剩余 部分进行酶活分析。对GUS染色阳性的番茄进行表面消毒后，用液氮速冻 快速研磨成浆，加入2-3倍体积的50mM Tris-Hcl (pH 8.4)缓冲液，冰浴 下继续研磨至透明，然后12000rpm, 15min取上清作为粗酶液。取200^1 含O.lmM蝇毒磷的50mM Tris-Hcl ( pH 7.4 )缓冲液，并向反应体系中添加 20|il粗酶液，在28。C暗箱静置30min后，340nrn UV下观察荧光产生情况 (见图4)。
在同样的反应体系中，通过对比A(灭活的转化果实粗酶液)与B (转化果实粗酶液)，以及C (未转化果实粗酶液)之间荧光产生情况，结果表
明经瞬时转化的番茄可以表达GUS和有机磷水解酶OPH,该酶能将有机磷 农药蝇毒磷降解生成香豆素类衍生物，从而^ UY激发下释放出荧光。"因
OPH，所以反映出的酶活是番茄果实表达的情况，可以有效降解有机磷农药。
实施例2:自发消除农残的黄瓜种质培育
(1 )按常规方法克隆果实特异性启动子 同实施例l;
(2 )人工合成有机磷水解酶OPH的基因 同实施例1;
(3) 构建果实特异性OPH植物表达载体 同实施例1;
(4) 转化土壤农杆菌和黄瓜外植体 转化土壤农杆菌同实施例1;
津研4号黄瓜种子购自天津农科院。把成熟的黄瓜种子温水浸泡lh, 剥皮后用75。/。酒精浸泡45s,再用0.1% HgCb浸泡5min,用无菌水清洗5 次，灭菌纸吸干水分接于MS培养基上，当种子萌发有5cm高并且子叶充 分伸展时，切取子叶带柄的下半截在预培养基上培养2天。将制备表达载 体pE80P的农杆菌LBA4404在含100 mg-L-l Km和20 mg七-1 Rif的YEP 培养基中28。C震荡培养至OD600约为0.5-0.7时，在6000rpm下5min收集 菌体，用MS重悬培养基重悬菌体。挑选深绿色预培养的子叶块于重悬的 菌液中浸泡，其间不断摇动，10min后取出用无菌滤纸吸干菌液接于共培养 基上培养。经共培养3天后的外植体转接于脱菌培养基，保持选择压7天 保i正脱菌完全。
(5) 转基因植抹的分化、移栽 同实施例1。
通过以下方法进行快速检测
a、 OPH基因对黄瓜的瞬时转化
将制备表达载体pE80P的农杆菌LBA4404在含100 mg丄"Km和20 mg丄"Rif的YEP培养基中28。C震荡培养至OD600约为0.5-0.7时，在 6000rpm下5min收集菌体，用MS重悬培养基重悬菌体至OD600约为2.0。 用重悬菌液在真空70kpa条件下浸润黄瓜果实薄片10min,快速释放后重复 浸润10min, 28。C培养3d后进行酶活分析。
b、 转化黄瓜的GUS染色和酶活检测
转化黄瓜果实切片28。C培养3d后，切取部分进行GUS染色，切取染 色成功的黄瓜剩余部分进行酶活分析。'对GUS染色阳性的黄瓜用液氮速冻 快速研磨成浆，加入2-3倍体积的50mM Tris-Hcl (pH 8.4)緩冲液，冰浴下继续研磨至透明，然后12000rpm， 15min取上清作为粗酶液。取200pl 含O.lmM蝇毒磷的50mM Tris-Hcl (pH 7.4 )緩沖液，并向反应体系中添加 20^1粗酶液，在28。C暗箱静置30min后，340nm UV下观察荧光产生情况。 结果表明经瞬时转化的黄瓜可以表达GUS和有机磷水解酶OPH。
实施例3:自发消除农残的辣椒种质培育 (1 )按常规方法克隆果实特异性启动子
同实施例1;
(2 )人工合成有机磷水解酶OPH的基因 同实施例1;
(3) 构建果实特异性OPH植物表达载体-. 同实施例1;
(4) 转化土壤农杆菌和辣椒外植体 转化土壤农杆菌同实施例1;
天椒一号辣椒种子购自北京金天利公司。把种子表面用95%酒精浸泡 45s,再用50%漂白剂浸泡10min,用无菌水清洗5次，灭菌纸吸干水分接 于MS培养基上，25。C光照培养，当种子萌发子叶充分伸展时，切取下胚 轴在预培养基上培养2天。将制备表达载体pE80P的农杆菌LBA4404在含 100 mg'L-1 Km和20 mg.L-1 Rif的YEP培养基中28。C震荡培养至OD600 约为0.5-0.7时，在6000rpm下5min收集菌体，用MS重悬培养基重悬菌 体。预培养后的下胚轴段i重悬菌液中浸泡，其间不断摇动，10min后取出， 用无菌滤纸吸干菌液接于共培养基上培养。经共培养3天后的外植体转接 于脱菌培养基，保持选择压7天保证脱菌完全。
(5) 转基因植抹的分化、移栽 同实施例1。
通过以下方法进行快速检测
a、 OPH基因对辣椒的瞬时转化
将制备表达载体pE80P的农杆菌LBA4404在含100 mg丄"Km和20 mg丄-1 Rif的YEP培养基中28。C震荡培养至OD600约为0.5-0.7时，在 6000ipm下5min收集菌体，用MS重悬培养基重悬菌体至OD600约为2.0。 用重悬菌液在真空70kpa条件下浸润辣椒果皮20min,快速释放后重复浸润 20min, 28。C培养3d后进行酶活分析。
b、 转化辣椒的GUS染色和酶活检测 把转化辣椒果皮用液氮速冻快速研磨成浆，加入2-3倍体积的50mM
Tris-Hd (pH8.4)緩沖液，冰浴下继续研磨至透明，然后U000卬m， "min 取上清作为粗酶液。取200^1含0.lmM蝇毒磷的50mM Tris-Hcl (pH 7.4 ) 緩冲液，并向反应体系中添加20pl粗酶液，在28。C暗箱静置30min后， 340nm UV下观察荧光产生情况。结果表明经瞬时转化的辣椒可以表达GUS 和有机-畴水解酶OPH。
权利要求
1、一种能自发消除农残的果实种质的培育方法，包括下列步骤(1)按常规方法克隆果实特异性启动子所述的果实特异性启动子是E8等果实特异性基因表达启动子；根据Genbank accessionAF515784.1中提供的E8启动子序列的特点，设计引物以番茄DNA为模板做PCR扩增，E8启动子的引物为P15’-CCCAAGCTTAGGAATTTCACGAAATCG-3’；P25’-CGCGGATCCTCTTTTGCACTGTGAATG-3’；(2)人工合成有机磷水解酶OPH的基因所述的有机磷水解酶具有Genebank AccessionAAA24930所述氨基酸序列，根据番茄密码子偏好性翻译成碱基序列后人工合成而得；(3)构建果实特异性OPH植物表达载体将E8扩增产物和人工合成的OPH基因序列分别连接到pGEM-T easy上构建出pGEM-E8和pGEM-OPH，然后用HindIII和BamHI双酶切pGEM-TE8和pSH，把E8构建到pSE8；用EcoRI单酶切pGEM-OPH和pSE8，把OPH构建到pSE8OP，筛选出正向连接载体，从而得到果实特异性启动子驱动的植物表达载体备用；(4)转化土壤农杆菌和植物外植体将表达载体pSE8OP用冻融法转化到土壤农杆菌LBA4404，挑取含有表达载体pSE8OP的农杆菌单菌落，在含100mg·L-1Km和20mg·L-1Rif的YEP培养基中28℃震荡培养至OD600为0.5-0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用MS重悬培养基重悬菌体；挑选鲜嫩的植物外植体于重悬的菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后接于共培养基上，2天后转入脱菌培养基(含Cef 300mg·L-1)上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；(5)转基因植株的分化、移栽将在脱菌培养基上存活下来的外植体接于分化培养基上，分化的幼苗长至2-3cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5-10cm时打开瓶盖，炼苗3-5d后移植到土壤中。
2、 如权利要求1所述能自发消除农残的果实种质的培育方法，其中 植物外植体来源于番茄、黄瓜或辣椒。
3、 如权利要求1或2所述能自发消除农残的果实种质的培育方法，其中MS重悬培养基中含有100 mg'U1 AS及20 g.L"蔗糖； 预培养基中含有l.Omg.L-1 6-BA、 0.1 mg.U1 IAA及20g.U1蔗糖;所述 共培养基中含有l.Omg.L-1 6-BA、 0.1 mg-L-1 IAA、 100 mg.L"AS及 20g七"蔗糖；脱菌培养基中含有l.Omg'L-1 6-BA、 0.1 mg.L" IAA、 300mg-L" Cef及 30 g七"蔗糖；分化培养基含有l.Omg七-'6-BA、 0.1 mg.L"IAA、 300mg.L" Cef、 70mg丄"Km及30g丄-'蔗糖；生根培养基中含有O.l mg.L—'IAA、 300 mg丄-1 Cef、 70mg.L" Km及20 g-U1蔗糖；除生根培养基以1/2MS为基础培养基，其余培养基均以MS为基础培 养基。
4、如权利要求3所述能自发消除农残的果实种质的培育方法，其中 ]丄MS培养基中包含硝酸钾(KN03) 1900mg,硝酸铵(NH4N03) 165Gmg, 氯化钙(CaCI2'2H20) 440mg，硫酸镁(MgS04.7H20) 370mg,磷酸二氢钾 (KH2P04) 170mg,硫酸锰(MnS04.4H20) 22.3mg,硫酸锌(ZnS04.7H20) 8.6mg,硼酸(H2B03)6.2mg,石典化钾(KI) 0.83mg,钼酸钠(Na2Mo04'2H20) 0.25mg ,乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg ，硫酸亚铁 (FeS04.7H20) 27.8mg，硫酸铜(CuS04.5H20) 0.025mg,氯化钴(COC12'6H20) 0.025mg,肌醇100mg,烟酸0.5mg,盐酸硫胺素(维B〗)O.lmg,盐酸魂哆 素(维B6)0.5mg,甘氨酸2mg, PH值5.80;1LYEP培养集中包含5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCJ， PH 值7.20。
全文摘要
一种能自发消除农残的果实种质的培育方法，包括下列步骤(1)按常规方法克隆果实特异性启动子(2)人工合成有机磷水解酶OPH的基因；(3)构建果实特异性OPH植物表达载体将E8扩增产物和人工合成的OPH基因序列分别连接到pGEM-T easy上构建出pGEM-E8和pGEM-OPH，然后用HindIII和BamHI双酶切pGEM-TE8和pSH，把E8构建到pSE8；用EcoRI单酶切pGEM-OPH和pSE8，把OPH构建到pSE8OP，筛选出正向连接载体，从而得到果实特异性启动子驱动的植物表达载体备用；(4)转化土壤农杆菌和植物外植体；(5)转基因植株的分化、移栽。本发明既能降低果实的农药残留，同时也不影响田间农药的功效，从而有利于提高产量和质量。
文档编号C12N15/55GK101451144SQ20081006877
公开日2009年6月10日 申请日期2008年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者晨 潘, 赵德刚, 赵杰宏, 洁 韩 申请人:贵州大学