专利名称：一种检测柯萨奇病毒a16型rna的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供一种提取纯化和检测柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16)RNA的方法，并提供一种相应的检测CA16RNA的试剂盒。
背景技术：
实时荧光PCR技术(FQ-PCR)把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势(1)与免疫学检测比较，其具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。(2)根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。(3)能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的 高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。(4)可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对如手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。(5 )将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤(6)全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。(7)实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测CA16-RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的CA16-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处I)检测灵敏度低，约在lOOOcopie/ml左右；检测范围窄，一般在 I. 00E+03copie/ml I. 00E+07copie/ml 之间，对于临床高值(大于 5. 00E+07copie/ml)和低值(小于I. 00E+03copie/ml)的样本无法检测；2)对于CA16的不同亚型存在一定的漏检现象；3)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4)无法有效去除样本中的PCR抑制物(如全血、痰液等)，体系中一般没有阳性内对照(即内标)，无法预防假阴性；5)国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。磁珠(免疫磁珠)法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂；提取纯化的核酸质量好、产量高；提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化；这些优点使其有替代其它核酸提取和纯化方法的发展趋势。但在现有技术中，并未见有磁珠法用于提取纯化和检测CA16RNA的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有柯萨奇病毒A16型(CA16RNA)荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的CA16核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对咽拭子、粪便等未知样本中的CA16RNA进行快速、准确检测，检测结果可用于CA16感染的辅助诊断。本发明用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以CA16基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对CA16RNA进行定性检测。本发明提供一种检测CA16RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化CA16RNA。在本发明中，所述磁珠是生物科学和纳米材料科学二者结合的产品。它运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠；该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。它利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,能将血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用于临床疾病诊断、输血安全、法医 学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。在本发明中，所述磁珠可经商购获取。在优选的情况下，本发明结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测CA16RNA。具体的，在一个实施方式中，本发明所述方法包括如下步骤，步骤A，裂解病毒每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待测样本，混匀后离心；CA16阴性对照和CA16阳性对照参照与待测样本相同的方法作RNA提取和纯化处理；步骤B，磁珠吸附核酸每管加入含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠的RNA提取溶液II，混匀后静置；步骤C，去除杂质经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出；步骤D，洗涤每管加入含曲拉通和氯化钠的RNA提取溶液III和含矿物油的RNA提取溶液IV，混匀后离心，将离心管再置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃；步骤E，RNA洗脱加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；步骤F，荧光PCR分析将洗脱磁珠后的待测样本RNA、CA16阴性对照、CA16阳性对照中均加入含PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、探针的PCR反应液和含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶的CA16酶混合液，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。本发明还提供一种检测CA16RNA的试剂盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物CA16-F、下游引物CA16-R和用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P的PCR反应液；其中，上游引物CA16-F的碱基序列为5 ' -GCCCTAGAGAAAAGGATGAACAACT-3 ';下游引物 CA16-R 的碱基序列为 5 ' -CAAGTGACTTGCCTGTTCCTGG-3 ；探针CA16-P 的碱基序列为 5’ FAM-CATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGA-BHQ13’。在本发明的试剂盒中，发明人寻找出CA16基因组的保守序列而设计出用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和探针序列，为CA16RNA的实时荧光PCR检测提供了保障。在本发明所述试剂盒中，优选的是，所述试剂盒中还包括内标，所述内标即为一段长为88碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，其碱基序列为5’_GCCAATACGACAAATCACCTTGGTCCTCTGTCATCCAGACTTCGCACGTCACGTATTCGAGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3，。
在本发明一个具体实施方式
中，所述试剂盒中包括如下组分，①RNA提取溶液I :包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100 400 μ g/ml的磁珠RNA提取溶液II 含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠RNA提取溶液III :含曲拉通和氯化钠RNA提取溶液IV :含矿物油RNA洗脱液含Tris-HCl和EDTA ;⑥内标如上所述的可选择使用的内标； PCR反应液包括5XPCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16-R，用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P，用于内标扩增和检测的上、下游引物IC-F与IC-R和探针IC-P '⑧CA16酶混合液含mMLV酶和H-TaqDNA聚合酶；(D CA16阳性对照标定已知浓度的慢病毒，其浓度为I. 00 5. 00E+05copie/ml ;和⑩CA16阴性对照灭菌生理盐水。在本发明的上述试剂盒中，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16-R和用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P的序列是本发明的核心；而用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R和用于内标检测的探针IC-P均可以据内标的碱基序列而任意选择。在本发明中，例如，上游引物IC-F为5’ -GCCAATACGACAAATCACCTTGGTC-3’ ；下游引物 IC-R 为5’ -CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’ ；探针 IC-P 为5’ HEX-TGTCATCCAGACTTCGCACGTCACGTAT-BHQ13’。·
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在上述试剂盒中，更为优选的是，①RNA提取溶液I :由十二烷基硫酸钠O. 2 I. 0%(质量/体积)、曲拉通I. O 4. 0%(体积/体积),异硫氰酸胍O. 2 I. Omol/L和100 400 μ g/ml的磁珠组成。②RNA提取溶液II :包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100 300mmol/L、氯化钠100 300mmol/L，溶液II的pH值为6. 5±0· 2 RNA提取溶液III :含曲拉通O. I
I.0%(体积/体积)和氯化钠100 300mmol/Lo⑤RNA洗脱液含Tris-HClO. 8 I. 2mol/L 和 EDTA0. I I. Omol/L PCR 反应液:包括 5XPCR 反应缓冲液 10 μ 1,0. 2mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸，O. 2 O. 4μ mol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16-R，0. 2 0.4 μ mol/L的用于靶多核苷酸检测的探针CA16_P，0. I 0. 2 μ mol/L的用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R，0. 05 0. 2 μ mol/L的用于内标检测的探针IC-P ；⑧CA16酶混合液包括mMLV酶10 150U/ μ I和I 10U/ μ I的H-Taq DNA聚合酶。本发明在对CA16所有已知基因型的基因组序列进行比对的基础上，在CA16的最保守区域设计了两对引物和探针，经定量PCR优化，筛选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出CA16所有已知基因型，但不能检测出非CA16病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。本发明对CA16-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度(检测下限)可达200COpie/ml，检测范围为2. 0E+02 2.0E+08copies/ml。另外，在本发明的一种优选实施方式中，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。本发明中，在荧光PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可为灵敏、早期诊断柯萨奇病毒A16型感染提供可靠的实验证据。
图IA示出了本发明提供的一个CA16阳性对照和一个CA16阴性对照其本身的扩增曲线图；图IB示出了本发明提供的一个加在CA16阳性对照中的内标和一个加在CA16阴性对照中的内标的内标扩增曲线图；图2A示出了本发明提供的十个CA16阳性样本的扩增曲线图；图2B示出了本发明提供的十个CA16近似病原体(分别为肠道病毒71型、流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、解脲脲原体、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌)的扩增曲线图。
具体实施例方式以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保 护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。实施例I本实施例提供一种柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒(检测CA16RNA的试剂盒)，它包括如下组分①RNA提取溶液I :由十二烷基硫酸钠O. 2 I. 0% (质量/体积)、曲拉通I. O 4. 0% (体积/体积)，异硫氰酸胍O. 2 I. Omol/L和100 400 μ g/ml的磁珠组成；②RNA提取溶液II :包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100 300mmol/L、氯化钠100 300mmol/L，溶液 II pH 值为 6. 5±0· 2 ;③RNA提取溶液III 曲拉通O. I L 0% (体积/体积)、氯化钠100 300mmol/L ；④RNA提取溶液IV :矿物油；⑤RNA 洗脱液:Tris-HClO. 8 I. 2mol/L、EDTA0. I I. Omol/L ；⑥内标(阳性内对照)一段长为88碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，浓度为I. 00E+03 I. 00E+06copies/ml ;其碱基序列为5， -GCCAATACGACAAATCACCTTGGTCCTCTGTCATCCAGACTTCGCACGTCACGTATTCGAGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3，⑦PC R反应液5XPCR反应缓冲液10μ I (购买mMLV酶时附带的)，0. 2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0. 2 0. 4 μ mol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16-R，0. 2 0.4 μ mol/L的用于靶多核苷酸检测的探针CA16_P，0. I 0. 2 μ mol/L的用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R，0. 05 0. 2 μ mol/L的用于内标检测的探针IC-P，所述用于靶多核苷酸扩增和检测的上下游引物及探针，其碱基序列分别为上游引物CA16-F :5' -GCCCTAGAGAAAAGGATGAACAACT-3'；下游引物CA16-R :5' -CAAGTGACTTGCCTGTTCCTGG-3'；探针CAl6-P :5，FAM-CATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGA-BHQ13，；针对88碱基的序列设计了非竞争性内标的引物及探针，其碱基序列分别为上游引物IC-F :5’ -GCCAATACGACAAATCACCTTGGTC-3’ ；下游引物IC-R :5’ -CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’ ；探针IC-P :5’ HEX-TGTCATCCAGACTTCGCACGTCACGTAT-BHQ13’ ；⑧CA16 酶混合液mMLV 酶 10 150U/ μ 1，I 10U/ μ I H-Taq DNA 聚合酶；
⑨CA16阳性对照标定已知浓度的慢病毒，其浓度为I. 00 5. 00E+05copie/ml。⑩CA16阴性对照灭菌生理盐水。从附图1A、1B可以看出，CA16阳性对照本身有S型扩增曲线，可明显判为阳性；而CA16阴性对照本身扩增曲线平直，与阈值线无交点，没有Ct值(No Ct)，可明显判为阴性。加入CA16阳性对照中的内标和加入CA16阴性对照中的内标的内标扩增曲线均为S型，可明显判为阳性。说明本试剂盒阴、阳性对照和内标可以监测提取过程和反应体系，避免假阴
性结果。实施例2本实施例提供上述实施例I所述试剂盒用于检测咽拭子等未知样本中CA16-RNA的操作步骤
一、试剂准备I)按比例取相应量的RNA提取溶液I (200μ I Iml/人份)及内标(I μ I/人份)充分混匀成RNA提取溶液Ι-mix，瞬时离心后备用。2)根据待测样本、CA16阴性对照、CA16阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液(43 μ I/人份)及CA16酶混合液(2 μ I/人份)，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。二、RNA提取操作I)裂解病毒每管加入200μ I Iml RNA提取溶液l_mix，然后加入100 μ I Iml待测样本(如咽拭子)，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；CA16阴性对照和CA16阳性对照参照与待测样本相同方法作RNA提取和纯化处理；2)磁珠吸附核酸每管加入50 400 μ I RNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置10 30分钟；3)去除杂质瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，2 5分钟后缓慢将溶液吸出；4)洗涤每管加入400 μ I Iml RNA提取溶液III和100 500 μ I RNA提取溶液IV，震荡混匀3 7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上进行磁珠分离；5) 2 5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置I 3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；6)加入10 IOOul RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3 4次，室温静置5 30分钟后将离心管再次置于分离器上2 5分钟，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的I. 5ml灭菌离心管中；7)每个反应管加入45 μ I的PCR-mix，吸取已经洗脱磁珠后的待测样本RNA、CA16阴性对照、CA16阳性对照各5 μ I加入PCR-mix中，盖好管盖。三、荧光PCR反应与结果分析(在荧光定量PCR扩增仪上进行)I)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。2)突光检测通道选择选择FAM通道(Reportere:FAM, Quencher:None)检测 CA16 ；选择 HEX 或 VIC 通道(Reporter:VIC, Quencher:None)检测内标。3)荧光定量PCR反应条件见表I :表I
权利要求
1.一种检测柯萨奇病毒A16型RNA的方法,其中使用磁珠法提取和纯化柯萨奇病毒A16 型(CA16) RNA。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测CA16RNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 步骤A，裂解病毒每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待测样本，混匀后离心；CA16阴性对照和CA16阳性对照参照与待测样本相同的方法作RNA提取和纯化处理； 步骤B，磁珠吸附核酸每管加入含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠的RNA提取溶液II，混匀后静置； 步骤C，去除杂质经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出； 步骤D，洗涤每管加入含曲拉通和氯化钠的RNA提取溶液III和含矿物油的RNA提取溶液IV，混匀后离心，将离心管再置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃； 步骤E，RNA洗脱加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中； 步骤F，荧光PCR分析将洗脱磁珠后的待测样本RNA、CA16阴性对照、CA16阳性对照中均加入含PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、探针的PCR反应液和含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶的CA16酶混合液，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。
4.一种检测CA16RNA的试剂盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物CA16-F、下游引物CA16-R和用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P的PCR反应液；其中，上游引物CA16-F的碱基序列为Y -GCCCTAGAGAAAAGGATGAACAACT-3';下游引物CA16-R 的碱基序列为 5' -CAAGTGACTTGCCTGTTCCTGG-3 ;探针 CA16-P 的碱基序列为 5’ FAM-CATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGA-BHQ13 ’。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，即为一段长为88碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，其碱基序列为5’ -GCCAATACGACAAATCACCTTGGTCCTCTGTCATCCAGACTTCGCACGTCACGTATTCGAGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3，。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括如下组分， ①RNA提取溶液I:包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100 400 μ g/ml的磁珠； ②RNA提取溶液II:含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠； ③RNA提取溶液III:含曲拉通和氯化钠； ④RNA提取溶液IV:含矿物油； ⑤RNA洗脱液含Tris-HCl和EDTA； ⑥内标如上所述的可选择使用的内标； ⑦PCR反应液包括5X PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16-R，用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P，用于内标扩增和检测的上、下游引物IC-F与IC-R和探针IC-P ； ⑧CA16酶混合液含mMLV酶和H-TaqDNA聚合酶； ⑨CA16阳性对照标定已知浓度的慢病毒，其浓度为I.OO 5. 00E+05copie/ml ； ⑩CA16阴性对照灭菌生理盐水。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中， ①RNA提取溶液I:由十二烷基硫酸钠O. 2 I. 0% (质量/体积)、曲拉通I. O 4. 0%(体积/体积)，异硫氰酸胍O. 2 I. Omol/L和100 400 μ g/ml的磁珠组成。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中， ②RNA提取溶液II:包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100 300mmol/L、氯化钠100 300mmol/L，溶液 II 的 pH 值为 6. 5±0· 2 ; ③RNA提取溶液III:含曲拉通O. I I. 0% (体积/体积)和氯化钠100 300mmol/L。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，⑤ RNA 洗脱液含 Tris-HCl O. 8 I. 2mol/L 和 EDTA0. I I. Omol/L ； ⑦PCR反应液包括5XPCR反应缓冲液10μ 1，O. 2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，O. 2 O. 4ymol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物CA16-F与CA16_R，0. 2 O. 4ymol/L的用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P，0. I O. 2μπι01/1的用于内标扩增的上、下游引物IC-F与IC-R,0. 05 O. 2ymol/L的用于内标检测的探针IC-P ； ⑧CA16酶混合液包括mMLV酶10 150U/ μ I和I IOU/ μ I的H-Taq DNA聚合酶。
全文摘要
本发明提供一种提取纯化和检测CA16RNA(柯萨奇病毒A16型RNA)的方法，并提供一种相应的检测CA16RNA的试剂盒。本发明提供的试剂盒中包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物CA16-F、下游引物CA16-R和用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P的PCR反应液。本发明提供的试剂盒可检测出CA16RNA所有已知基因型，但不能检测出非CA16病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性；另外，本发明选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，其检测下限即灵敏度可达200copie/ml，检测范围(试剂盒的定量线性范围)为2.00E+02～2.00E+08copies/ml。
文档编号C12Q1/68GK102816867SQ20121031601
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者戴立忠, 邓中平, 黄河 申请人:湖南圣湘生物科技有限公司