一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法

专利名称：一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法。
背景技术：
生物碱是广泛存在于植物体内的一类由小分子含氮化合物组成的次生代谢产物，目前世界上已有超过12000种的生物碱类物质被分离鉴定。生物碱在烟草及其制品中有特殊的地位，它不仅是烟草重要的品质要素，而且规定了烟草作为一种商品的特质。烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟草碱是烟草中的4中主要生物碱。人们吸食烟草主要是吸食其中的烟碱(nicotine)，又名尼古丁。普通烟草属于烟碱积累型，烟碱含量占总生物碱含量的90 95%，另外3种仅占生物碱总含量的5% 10%，降烟碱含量一般不超过总生物碱含 量的3. 5 %。普通烟草是纯合双隐性基因型(ctctcscs)，不具有烟碱去甲基能力。但在栽培品种的烟株群体中，一些植株会因为基因突变而具有烟碱去甲基能力，导致烟碱含量显著降低，降烟碱含量则相应增加，甚至可以达到95 %以上。这种烟碱向降烟碱转化的性状称为烟碱转化，具有烟碱转化能力的烟株称为转化株(converter)。降烟碱含量的升高会直接影响烟叶的香吃味品质，导致烤烟调制后出现“樱红”现象且香味不佳。同时由于降烟碱易于在烟叶调制和调制后的陈化过程中发生氧化、亚硝化和酰化等生化反应，形成许多有害成分，如麦斯明(myosmine)、酰化降烟碱(acylnornicotines)和亚硝基降烟碱(NNN)等，因此降烟碱含量的升高对人体健康也存在不利影响。控制较低水平的降烟碱不仅是因为它作为许多有害成分的前体物质对人体具有潜在的致癌性，还因为降烟碱本身对人体的健康也具有负面影响。降烟碱可以导致蛋白质的异常糖基化，而且还可同许多常用的类固醇药物(如强的松)发生共价反应，从而改变这类药物的药效和毒理。因此，及时剔除烟草群体中的转化株从而控制较低水平的降烟碱含量成为国际烟草工业界和学术界关注的热点问题之一。目前检测烟草烟碱转化水平的方法主要是通过气相色谱法(GC)和气质联用法(GC-MS)检测其生物碱组分与含量，进而计算烟碱转化水平。虽然该方法稳定性、可操作性都比较好，但该方法通常仅能分析采收后的成熟烟叶或调制后的烟叶，且采收后需要一定的处理，较为耗时，无法在整个生育期动态了解不同品种烟叶及同一品种的不同群体内的烟碱转化水平，进而无法及时地将不良转化株淘汰。

发明内容
本发明提供了一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法，利用该方法可以简便快速检测同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片之间烟碱转化相对水平。
一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法，包括如下步骤(I)收集同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片；(2)分别提取所述叶片的总RNA，逆转录合成cDNA ；(3)针对烟碱转化相关基因设计特异性引物，以所述cDNA为模板，利用所述特异性引物进行实时荧光定量PCR，得到各自的Ct值；(4)根据所述Ct值，利用标准曲线计算得到各cDNA中烟碱转化相关基因的模板量，判断同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片之间的烟碱转化相对水平；所述特异性引物为 上游引物5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；下游引物5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’ ；所述烟碱转化相关基因为烟碱去甲基化酶基因CYP82E4，其全长cDNA核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。在检测同一烟草品种不同部位或不同烟草品种的叶片烟碱转化相对水平时，一般选用成熟期叶片。烟碱去甲基化酶基因CYP82E4是CYP82E2基因家族的成员，介导烟碱向降烟碱的转化。该基因家族尤其是烟碱去甲基化酶基因CYP82E4在烟草转化株中的转录水平普遍高于非转化株，使用RNAi干扰技术抑制该基因的表达，可以有效降低高降烟碱含量烟草在烟草转化株的比例。因此，针对该基因设计方法，能准确灵敏地检测烟草烟碱转化相对水平。本发明实时荧光定量PCR所扩增的并不是烟碱转化相关基因的全序列，而仅仅是其中的某一片段，其碱基序列如SEQ ID No.4所示。逆转录过程中，各组所取RNA的体积及浓度是相同的，通过计算烟碱转化相关基因的模板量(浓度)，就可以得到该基因的表达水平。所述实时荧光定量PCR采用SYBR Green I荧光嵌合法。所述实时荧光定量PCR的扩增体系为20 μ L，其中Takara 2X SYBR Premix EXTaq 10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 5 μ L、cDNA模板2 μ L、灭菌蒸懼水7 μ L。所述实时荧光定量PCR的反应程序为94°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s, 72°C延伸 50s, 35 个循环；72°C延伸 5min。所述标准曲线的制备方法为(I)制备一组浓度呈梯度分布的标准品；(2)以所述标准品为模板，利用所述引物，进行实时荧光定量PCR，记录Ct值；(3)绘制得到标准曲线。所述标准品为含有烟碱去甲基化酶基因CYP82E4全长cDNA核苷酸序列的重组载体悬液，或是含有所述重组载体的转基因宿主细胞悬液。所述标准品的制备方法为(I)提取烟叶总RNA并反转录为cDNA ；(2)以所述cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的片段；(3)将所述目的片段连入T载体，获得重组载体。所述PCR扩增所使用的引物为
上游引物为5’-ATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’ ；下游引物为5’ -TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3 ’。所述总RNA的质量至关重要,应采用高品质的试剂盒或试剂进行提取,如QiagenRNeasy Plant Mini kit 试剂盒。由于RNA易降解且杂质难以去除，因此要测定所提取RNA的纯度。RNA纯品的OD26tl/OD280比值为2. O，若该比值较低，说明有蛋白或酚污染；若该比值太高，说明RNA有不同程度的降解。一般0D26Q/0D28Q比值为I. 8-2. O的RNA可用。PCR扩增烟碱去甲基化酶基因CYP82E4全长cDNA，是用于构建重组载体；而实时荧光定量PCR是为了检测该基因的表达量，因此在扩增时不需全序列扩增，但选用引物应具有更好的特异性。
本发明采用SYBR Green I荧光嵌合法进行实时荧光定量PCR，是基于该方法具有以下优点对DNA模板无选择性，适用于任何DNA ;不必设计复杂探针，使用方便；非常灵敏；价格低廉。但正是由于SYBR Green I对DNA模板无选择性，使之易与非特异的双链DNA结合，产生假阳性。因此，在实时荧光定量PCR反应结束后要作熔解曲线分析，判断扩增产物是否为目标片段。若曲线只有单峰，且出峰位置是退火温度，则无非特异性荧光，定量准确；若出现杂峰或出峰位置不是退火温度，则有其他产物出现非特异性荧光，定量不准确。实时荧光定量PCR中，log X。(模板量)与Ct值呈线性关系，通过已知模板量的标准品可作出标准曲线，根据各样品的Ct值，就可计算出所对应的模板量，进而分析各样品的烟碱转化相对水平。与现有技术相比，本发明的有益效果为(I)本发明所述检测烟草烟碱转化相对水平所采用的SYBR Green I荧光嵌合法精确度高、灵敏性强；而且相比于相对定量法，本发明采用标准品进行绝对定量，在分析同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片的烟碱转化相对水平方面具有更大的优势。(2)本发明所述的方法取样量少，与现有的检测方法(GC法和GC-MS法)相比，不会对取样烟株造成明显伤害，且操作简便、结果精确、重复性好。(3)现有检测方法只能在烟叶采收后才能对其烟碱转化水平进行分析，而本发明可以在整个生育期对不同烟叶样品的烟碱转化相对水平进行实时监控，避免了现有检测方法的时间限制，为研究人员与种植户及时剔除不良转化株开辟了一条新的有效途径。


图I为烟碱去甲基化酶基因CYP82E4cDNA全长常规PCR的凝胶电泳检测结果。其中，M为Takara DL2000DNAMarker, I为烟碱去甲基化酶基因CYP82E4cDNA全长扩增产物。图2为重组质粒标准品构建常规PCR验证的凝胶电泳检测结果。其中，M为TakaraDL2000DNA Marker, 1-6为不同阳性克隆中的目的片段。图3为不同稀释梯度的重组质粒标准品实时荧光定量PCR的扩增曲线。图4为不同稀释梯度的重组质粒标准品实时荧光定量PCR的标准曲线。其中，横坐标代表模板数的对数值，纵坐标代表Ct值。
图5A为不同稀释梯度的重组质粒标准品实时荧光定量PCR的熔解曲线。图5B为不同稀释梯度的重组质粒标准品实时荧光定量PCR的熔融峰。图6为不同稀释梯度的重组质粒标准品常规PCR的凝胶电泳检测结果。其中，M为 Takara IOObp DNA Marker, 1-7 依次为 I X 105、I X 106、I X 107、I X 108、I X 109、I X 1010、I X IO11拷贝/mL的重组质粒标准品。
具体实施例方式实施例I检测烟草烟碱转化相对水平的标准品的制备下面仅以含有烟碱去甲基化酶基因CYP82E4全长cDNA 的重组质粒为例，阐明其检测烟草烟碱转化相对水平的效果，其它含有烟碱去甲基化酶基因CYP82E4全长cDNA的全部或部分核苷酸序列的重组载体或含有该重组载体的转基因宿主细胞检测烟草烟碱转化相对水平的效果都与该标准品相同。(I)烟叶取样以白肋烟B37为材料，选取其成熟期中部叶片2g，取好的鲜叶样品用锡箔纸包好并标记，迅速放入装有液氮的冰盒中保存，快速送往实验室进行下一步工作。(2)总RNA提取、含量测定及反转录反应总RNA提取取上述锡箔纸中的烟叶样品200mg,采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其总RNA,具体步骤如下将烟叶加液氮磨细，液氮挥发前转入Eppendorf管并加450 μ L RLT提取缓冲液，振荡后56°C温浴3min ;将提取液转入紫色柱，IOOOOg离心2min,滤液转入新的Eppendorf管，加225 μ L无水乙醇混匀；滤液再转入粉红色柱，8000g离心15s，弃滤液；加700 μ L Rffl于粉红色柱，8000g离心15s，弃滤液；加500 μ L RPE于粉红色柱，8000g离心15s，弃滤液，重复一次，空管离心2min ;将粉红色柱插到新的Eppendorf管上，加30 μ L无RNase水，IOOOOg离心Imin ;提取好的RNA样品置_80°C保存。总RNA含量测定用核酸蛋白测定仪内置的RNA测定程序读取RNA含量为345. 8 μ g/mL、OD260/OD280值为I. 933，表明总RNA纯度较好，备用。反转录反应采用Takara公司的AMV反转录酶，将总RNA中的mRNA反转录为cDNA，稀释10倍后备用。具体步骤如下反应体系为20 μ L，其中总 RNA 2 μ L、50pmol/μ L Oligo (dT) 18primerl μ L, IOmMdNTP Mixture 2· 5 μ L、RNase Inhibitor 20U、AMV 反转录酶 10U、5 XAMV Buffer 4μ L,DEPC H2O定容至20yL。室温下放置lOmin，移入42°C恒温槽中保温I. 5h，在冰水中冷却2min即可。将得到的cDNA稀释10倍后备用。(3)标准品的制备以上述cDNA为模板，以下述引物对烟碱去甲基化酶基因CYP82E4全长cDNA序列进行常规PCR扩增，所述引物为正向引物序列5’-ATGCTTTCTCCCATAGAAGCC-3’ ；反向引物序列5，-TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3，。所述常规PCR扩增的具体步骤为I)目的基因的克隆和纯化
PCR 反应体系为 50 μ L，其中5U/ μ L Takara LATaq O. 5 μ L、2. 5mMdNTP 8 μ L、LATaq Buffer (Mg2+Free) 5 μ L,25mM MgCl25 μ L、20 μ M 正反向引物各 I μ L、cDNA 模板 I μ L、灭菌蒸懼水28. 5 μ L0PCR 反应程序为94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 90s，30个循环；72°C延伸7min。取5 μ L PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图I所示。结果表明该扩增产物大小为1600bp左右，显示该扩增产物为目的片段。取剩余的45 μ L PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳回收，利用Promega胶回收试剂盒(编号Α9281)进行目的片段的回收纯化。回收纯化后取5μ L进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明回收纯化的效果较好，可用于T-A或其他双酶切克隆。2) T-A克隆技术
a、反应将回收纯化的目的片段和Takara pMD18_T simple Vector载体连接，连接体系为IOyL,其中目的片段2yL、pMD18-T simple Vector载体I μ L、高效连接液Solution I 5 μ UdH2O 2yL;4°C过夜连接。b、感受态细胞转化将10 μ L连接产物加入至IOOyL DH5 α感受态细胞中，冰上放置30min ;42°C加热45s，再在冰中放置Imin ;加入890 μ L LB培养基，37°C振荡培养60min ;在含有X-Gal、IPTG和Amp的LB培养基上过夜培养，形成单菌落。3)阳性克隆的鉴定a、阳性克隆验证在转化后涂板的培养基上分别挑取16个白色单菌落至含有5mLLB (Amp+)液体培养基的试管中，37°C振荡过夜培养。取I μ L菌液为模板，采用步骤I)中的PCR体系与程序进行PCR扩增，验证质粒中是否转入了 1600bp左右的目的条带。验证结果如图2所示。将经PCR证明为阳性克隆的菌液送测序，测序结果为1554bp，blast比对结果证明其为阳性重组质粒，且该重组质粒和GenBank中烟碱去甲基化酶基因CYP82E4mRNA序列(GenBank 登录号DQ205656. I ；DQ131885. I ；DQ131886. I)具有 99% 以上的同源性，表明质粒标准品构建成功。该重组质粒中所承载的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。b、提取质粒选择含有目的片段的菌液，采用Axygen公司改进的SDS碱裂解法AxyPrep质粒DNA试剂盒提取质粒DNA。具体过程如下取3mL菌液,12000g离心Imin,尽弃上清；加入250 μ L SI缓冲液重悬浮细菌沉淀；加入250 μ L S2缓冲液，温和并充分地混匀使菌体充分裂解；加入350 μ L S3缓冲液，温和混勻，12000g离心IOmin ;吸取上清转移到制备管中，12000g离心Imin,弃滤液；加入500 μ L Wl缓冲液，12000g离心Imin,弃滤液；加入700 μ L W2缓冲液，12000g离心Imin,弃滤液；在制备管中加入80 μ L去离子水，12000g离心Imin ;_20°C保存备用。(4)重组质粒标准品检测I)重组质粒的浓度测定和拷贝数计算取纯化的质粒标准品2 μ L，利用核酸蛋白测定仪测得其浓度为94.5 μ g/mL，且OD26tZOD28tl比值为I. 888，表明质粒标准品纯度较好。根据质粒标准品浓度可计算其拷贝数，计算公式如下DNA的拷贝数=(DNA的质量/DNA的摩尔质量)X 6. 02 X IO23双链DNA 中 Ibp = 660Da，则 DNA 的摩尔质量=660DaX (2692+1554)bp。带入上述公式，得出质粒标准品的拷贝数为2. 030X IO13拷贝/mL。2)实时突光定量PCR检测重组质粒标准品的范围将重组质粒标准品进行10倍的倍比稀释，各稀释梯度为1X1011，
IXio10......I X IO1拷贝/mL。利用下述特异性引物进行实时荧光定量PCR检测，该引物
的核苷酸序列为正向引物序列为5’-ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；反向引物序列为5’-GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’。采用SYBR Green I荧光嵌合法进行实时荧光定量PCR检测，反应体系为20 μ Lj 中Takara 2 X SYBR Premix EX Taq 10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 5 μ L、质粒标准品 2 μ L、灭菌蒸馏水7 μ L。实时荧光定量PCR反应程序为94°C预变性3min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，35个循环；72°C延伸5min ;55_95°C缓慢升温，产生熔解曲线。扩增曲线如图3所示，由图可知实时荧光定量PCR检测重组质粒标准品的范围为Ixio5-Ixio11 拷贝 /mL。3)实时荧光定量PCR检测标准曲线的绘制取已知的7个倍比稀释的重组质粒标准品(I X IO11U X IO10U X IO9UX IO8,I X IO7,1 X 106、I X IO5拷贝/mL)，进行实时荧光定量PCR检测标准曲线的绘制。每个稀释梯度做3次重复，进行实时荧光定量PCR反应，反应体系和程序同实施例I步骤(4)-2)。标准曲线如图4所示，质粒标准品在I X IO5-I X IOltl拷贝/mL的范围内R2 = O. 9937，说明该体系线性较好；斜率为-4. 4208，说明该体系扩增效率较高。图中结果为3次重复试验的平均结果。4)实时荧光定量PCR检测标准曲线的熔解曲线重组质粒标准品的熔解曲线的测定方法同步骤(4)_2)。测定结果如图5A和58所示，特异性反应的Tm值为81. 5±0.5°C，且曲线为单峰，说明未出现非特异性荧光，定量准确。5)常规PCR检测重组质粒标准品的范围将稀释梯度为I X IO5-I X IO11拷贝/mL的重组质粒标准品进行常规PCR检测。常规PCR 反应体系为 50 μ L，其中，5U/μ L Takara LA Taq O. 5μ L,2. 5mM dNTP8μ L.LA Taq Buffer (Mg2+ Free) 5 μ L、25mM MgCl2 5 μ L、20 μ M 正反向引物各 I μ L、重组质粒标准品I μ L、灭菌蒸懼水28. 5 μ L0常规PCR反应程序为94°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s, 30 个循环；72°C延伸 7min。取5 μ L PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图6所示，扩增产物大小在200-300bp之间，测序结果为238bp，通过blast比对后，证明其为重组质粒标准品目的片段中的部分核苷酸片段，该核苷酸片段的序列如SEQ ID N0.4所示。实施例2检测白肋烟野生型和突变型烟碱转化相对水平以白肋烟B37和高烟碱转化突变体HNC-I为材料，利用所述引物检测其烟碱转化相对水平，具体步骤如下(I)烟叶取样
以白肋烟B37和高烟碱转化突变体HNC-I为材料，分别选取其团棵期、旺长期和成熟期的中部叶片各2g，取好的鲜叶样品用锡箔纸包好并标记，迅速放入装有液氮的冰盒中保存，快速送往实验室进行下一步工作。⑵总RNA提取、含量测定 及反转录反应总RNA提取取上述锡箔纸中的烟叶样品200mg,采用Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit提取其总RNA,具体步骤如下将烟叶加液氮磨细，液氮挥发前转入Eppendorf管并加450 μ L RLT提取缓冲液，振荡后56°C温浴3min ;将提取液转入紫色柱，IOOOOg离心2min,滤液转入新Eppendorf管，加225 μ L无水乙醇混匀；滤液再转入粉红色柱，8000g离心15s，弃滤液；加700 μ L RWl于粉红色柱，8000g离心15s，弃滤液；加500 μ L RPE于粉红色柱，8000g离心15s，弃滤液，重复一次，空管离心2min ;将粉红色柱插到新Eppendorf管上,加30 μ L无RNase水，IOOOOg离心Imin ;提取好的总RNA样品置_80°C保存。总RNA含量测定 总RNA用RNase-free处理水稀释60倍，用核酸蛋白测定仪内置的RNA测定程序读取RNA的含量(表2)。表2白肋烟样品RNA含量
权利要求
1.一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)收集同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片； (2)分别提取所述叶片的总RNA，逆转录合成cDNA； (3)针对烟碱转化相关基因设计特异性引物，以所述cDNA为模板，利用所述特异性引物进行实时荧光定量PCR，得到各自的Ct值； (4)根据所述Ct值，利用标准曲线计算得到各cDNA中烟碱转化相关基因的模板量，判断同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片之间的烟碱转化相对水平； 所述特异性引物为上游引物5’ -ACGTGATCCTAAACTCTGGTCTG-3’ ；下游引物5’ -GCCTGCACCTTCCTTCATG-3’ ； 所述烟碱转化相关基因为烟碱去甲基化酶基因CYP82E4，其全长cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR采用SYBRGreen I突光嵌合法。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的扩增体系为20 ii L，其中Takara 2X SYBR Premix EX Taq 10 ii L、10 ii M 正反向引物各 0. 5 ii L、cDNA 模板2 ii L、灭菌蒸懼水7 ii L。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为94°C预变性3min ;94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸50s，35个循环；72°C延伸5min。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的制备方法为 (1)制备一组浓度呈梯度分布的标准品； (2)以所述标准品为模板，利用权利要求I所述的引物，进行实时荧光定量PCR，记录Ct值； (3)绘制得到标准曲线； 所述标准品为含有烟碱去甲基化酶基因CYP82E4全长cDNA核苷酸序列的重组载体悬液，或是含有所述重组载体的转基因宿主细胞悬液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组载体的制备方法为 (1)提取烟草叶片总RNA，并反转录为cDNA； (2)以所述cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的片段； (3)将所述目的片段连入T载体，获得重组载体。
所述PCR扩增所使用的引物为 上游引物为5’ -ATGCTITCTCCCATAGAAGCC-3’ ； 下游引物为5’ -TTAATAAAGCTCAGGTGCCAG-3’。
全文摘要
本发明公开了一种检测烟草烟碱转化相对水平的方法，包括(1)收集同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片；(2)分别提取所述叶片的总RNA，逆转录合成cDNA；(3)针对烟碱转化相关基因设计特异性引物，以所述cDNA为模板，利用所述特异性引物进行实时荧光定量PCR，得到各自的Ct值；(4)根据所述Ct值，利用标准曲线计算得到各cDNA中烟碱转化相关基因的模板量，判断同一品种烟草不同时期或不同部位或不同品种烟草的叶片之间的烟碱转化相对水平。本发明公开的方法不仅能对烟草烟碱转化相对水平进行实时监控，且准确度高，灵敏性强，能及时将不良烟草转化株淘汰。
文档编号C12Q1/68GK102796821SQ20121031505
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者储国海, 周国俊, 孙勃, 黄芳芳, 林福呈, 杨军, 张芬, 金立锋 申请人:浙江中烟工业有限责任公司, 中国烟草总公司郑州烟草研究院