一种变温发酵制取乙醇的方法

专利名称：一种变温发酵制取乙醇的方法
技术领域：
本发明属于利用植物纤维原料制备生物乙醇技术领域，具体涉及一种变温发酵制取乙醇的方法。
背景技术：
乙醇，俗称酒精，是一种重要的化学品。乙醇广泛应用于化工、能源、饮料、食品、轻工、农业等领域。乙醇的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，其中以微生物发酵法为主。微生物发酵法制取乙醇的原料主要包括三类:淀粉质原料、糖质原料和植物纤维原料。目前，大规模商业化生产乙醇主要以淀粉质、糖质为原料，其工艺已经较为成熟，而以植物纤维原料制取乙醇的技术尚处于研究阶段。随着人类工业文明进步的加快和社会经济的发展，人类社会对以石油为代表的化石资源的过度开采和使用使人类社会不可避免地面临资源危机、能源危机和环境污染等问题，其中近年来能源短缺问题尤为突出。人类社会急需寻找清洁、可再生的替代能源，其中来源于生物质材料(包括淀粉质、糖质和植物纤维原料)的生物乙醇是良好的汽油替代品。尽管以淀粉质、糖质等粮食为原料生产乙醇的技术体系已经较为成熟，但从全球范围看，人类社会粮食生产形势依然严峻，粮食基乙醇的生产不能满足迅猛发展的汽车工业对乙醇的大量需求。而地球上有丰富的植物纤维资源，以可再生的植物纤维资源生产乙醇作为汽车燃料，不仅可以达到节粮代粮的目的，而且可以实现资源的永续利用，符合循环经济的要求。植物纤维原料生物法制取乙醇的关键技术主要包括原料预处理、纤维素酶制备、纤维素水解、糖液发酵4个关键技术，其中纤维素水解、发酵工艺是影响乙醇生产成本的关键因素之一。从降低乙醇生产成本的角度出发，植物纤维原料制取乙醇对水解、发酵工艺的要求除了有较高的纤维素水解得率和较高的乙醇发酵糖利用率和乙醇得率外，还要求在生产过程中吨乙醇消耗的 水、能耗尽可能低。目前研究较多的纤维素水解、发酵技术主要包括以下三种:
1、低底物浓度纤维素水解、清液乙醇发酵。该法是国内外目前研究较多的方法之一。具体过程为:预处理的植物纤维原料在较低的底物浓度下水解，一般在底物浓度10-15%(固液比1:10-1:6.67)之间，水解结束后固液分离，并用一定量的水将固液分离后固体酶解渣中的糖分洗出，与前面糖液合并后直接发酵或浓缩到一定糖浓度后发酵成乙醇。该法的理由是:纤维素酶是一种属于反馈抑制的水解酶类，在纤维素水解过程中纤维素酶活性受到纤维素水解产物葡萄糖的反馈抑制，因此，高底物浓度导致的水解糖液中高糖浓度对纤维素酶的活性产生较高的抑制作用，降低了纤维素酶水解得率。所以在较低底物浓度下水解有利于提高水解得率。但该法存在以下缺点:(1)水解结束固液分离后仍有一部分糖分存留于酶解渣中，需耗用大量水来洗涤，同时洗涤后糖液与前面固液分离得到的糖液合并后糖液浓度降低，如果不浓缩直接清液发酵得到的发酵醪液中乙醇浓度较低，从而使后续的乙醇蒸馏消耗大量的蒸汽；如果合并后糖液浓缩后发酵，因为洗涤额外增加的水分的浓缩又消耗大量的蒸汽。(2)纤维素酶水解结束后采用固液分离、洗涤的工艺不可能将酶水解渣中糖分完全洗出，导致一部分的糖分的损失。2、高底物浓度纤维素水解、带渣乙醇发酵。该法是国内外目前研究较多的方法之一。具体过程为:预处理的植物纤维原料在较高的底物浓度下水解，一般在20-30% (固液比1:5-1:3.33)之间，水解结束后水解物不固液分离直接用于发酵。该法的理由是:鉴于低底物浓度纤维素水解尽管纤维素水解得率高，但固液分离、渣中糖分洗涤后的糖液浓度变稀，直接发酵导致所需发酵罐体积增加，浓缩后发酵浓缩则所需能耗大的问题，采取高底物浓度批式酶水解可获得较高浓度的糖液；同时酶水解结束后水解物直接发酵避免了酶水解渣中糖分洗涤和洗涤导致糖分损失的问题；另外，酶水解后水解物直接发酵，在酶解过程中没有失活的部分纤维素酶在发酵时仍然可以降解纤维素成葡萄糖，但由于发酵温度(28-35°C)与酶水解温度(45-50°C)不统一，此时的酶水解效率低。但该法存在以下缺点:
(I)由于高底物浓度水解，高底物浓度水解过程中生成的高浓度水解产物葡萄糖严重抑制了纤维素酶的活性，降低了纤维素酶水解的得率。(2)尽管是高底物浓度酶解，但研究表明，纤维素水解过程中底物浓度仍然存在一定限制，一般不能超过30%，底物浓度超过30%不仅纤维素水解得率大幅度下降，而且更重要的是工业过程植物纤维原料预处理后较难实现固形物浓度在30%以上的物料。而就是在底物浓度30%的物料水解，一般水解糖液中葡萄糖浓度在70-120g/L之间，由于水解物中含大量固体残渣，很难进行水解物的带渣浓缩，从而无法实现高糖浓度(160-250g/L)下的乙醇发酵，而对于乙醇生产而言，对发酵醪液中乙醇浓度的要求是越高越好。含葡萄糖浓度70-120g/L的糖液发酵，乙醇理论得率(Ig葡萄糖经酿酒酵母发酵乙醇理论得率为0.51g)为35.7-61.2g/L，而含葡萄糖浓度160_250g/L的糖液发酵，乙醇理论得率可达81.6-127.5g/L，含高浓度乙醇的发酵醪液可以大幅度降低后续乙醇蒸馏所耗能量(蒸汽)。因此，本法虽然采用高底物浓度水解获得较高浓度的糖液，但水解物中葡萄糖浓度仍然受到限制，发酵后醪液中乙醇浓度仍然较低，不利于后续的乙醇蒸馏。(3)工业生产上传统的清液发酵过程无需搅拌，而高底物浓度纤维素经过酶水解后直接发酵，需要在搅拌 条件下进行，耗能高。(4)清液发酵可实现酵母的循环利用，而带渣发酵由于酵母和酶水解渣不能有效分离而不能循环利用。3、纤维素同步糖化发酵。具体过程为:纤维素的酶水解和乙醇发酵在同一反应器中进行。该法的理由是:鉴于纤维素的酶水解产物葡萄糖对纤维素酶能产生抑制作用，采用纤维素的酶水解和乙醇发酵在同一反应器中进行，目的是纤维素经纤维素酶水解的产物葡萄糖及时被酵母发酵成乙醇，从而解除酶水解产物对纤维素酶的抑制作用。但该法存在的缺点是:纤维素的酶水解和酵母乙醇发酵的温度不一致。纤维素的酶水解一般要求在45-50°C，而酵母乙醇发酵则要求温度在28-35°C，酶反应和乙醇发酵最适温度的差异严重影响了纤维素的酶水解过程和乙醇发酵过程，从而限制了该法在工业上的应用。综上所述，从生产成本角度出发，目前研究的主要几种植物纤维原料纤维素酶水解、发酵工艺均存在着一些问题，有待于进一步优化。

发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高效、低成本的变温发酵制取乙醇的方法，以使其满足使用要求。
技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种变温发酵制取乙醇的方法，包括纤维原料预处理、酶水解、水解物固液分离、清液浓缩发酵和酶解渣发酵步骤；在所述的酶解渣发酵步骤中，酶解渣不经过洗涤分离糖，直接用酿酒酵母固体变温发酵成乙醇。所述的固体变温发酵为:用酿酒酵母于28-30°C条件下厌氧发酵18-36h，再变温至32-38 °C下继续厌氧发酵36-48h。在所述的固体变温发酵中，酿酒酵母的用量为4X 105 2X 106个/g酶解残渣。所述的植物纤维原料预处理指以提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及度所采用的物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的方法。在所述的酶水解中，所用的酶为纤维素酶，是以木霉曲霉(AspergiBy1S)或细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的一种或多种酶的复合物。上述的变温发酵制取乙醇的方法，具体步骤如下:
(1)先粉碎、酸处理、蒸汽爆破处理纤维原料，再水洗、挤干，得酶解底物；
(2)混合酶解底物和纤维素酶底物浓度10-15%，控制pH4.0-6.0，45-55°C条件下酶解反应48-72h ;其中，反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为10-25FPIU/g ；
(3)酶水解反应结束后将水解物离心固液分离，得清液和酶解渣； (4)清液经减压蒸发浓缩至糖液中葡萄糖浓度为160-250g/L，在浓缩糖液中添加营养盐后，用酿酒酵母于28-35 °C条件下厌氧发酵24-48h ；
(5)在酶解渣中添加营养盐，用酿酒酵母于28-30°C条件下厌氧发酵18-36h，再变温至32-38 °C下继续厌氧发酵36-48h。本发明的方法，首次提出植物纤维原料在较低底物浓度下进行高效水解，水解结束固液分离后清液浓缩到较高糖浓度进行清液发酵，固液分离后的酶解渣不洗涤直接固体变温发酵的酶解发酵工艺。该法既避免了低底物浓度酶解、发酵分开进行工艺中酶解渣洗涤耗用大量水和能耗高的问题；又避免了高底物浓度酶解、水解物直接发酵工艺中酶水解得率低、能耗高、不能实现高糖发酵和酵母回收循环利用的问题；同时酶解渣的固体变温发酵也具有同步糖化发酵的作用。有益效果:与现有技术相比，本发明的变温发酵方法，纤维素在低底物浓度下(10-15%)水解可以获得较高的水解得率，水解后糖液和水解渣分离可以实现清液浓缩后的高糖(160-250g/L)发酵且工业规模上无需搅拌，高糖发酵获得的高乙醇浓度的醪液可降低后续乙醇蒸馏的蒸汽消耗，固液分离后的水解渣直接固体发酵可以避免从水解渣中洗涤糖分过程，降低了水耗和后续糖液浓缩的能耗，并避免了由洗涤造成的糖分损失。同时本发明采用的固体渣变温发酵技术分为两段发酵，前一段采用28-30°C发酵保证酿酒酵母能快速将全部葡萄糖转化为乙醇，后一段采用32-38°C发酵促进固体发酵中的同步糖化发酵作用，进一步提闻乙醇广量。


图1是15%底物浓度下预处理玉米秸杆纤维素酶水解历程；
图2是浓缩水解糖液乙醇发酵历程；图3是30%底物浓度酶水解后带渣乙醇发酵历程。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得，或采用常规方法制备。实施例1:玉米秸杆的预处理
取玉米秸杆粉碎至3-5cm，用质量分数为0.50-1.00%的稀硫酸浸泡2h，控压1.5-2.2MPa、停留时间2-6min条件下蒸汽爆破预处理，得稀酸蒸汽爆破物料，用1:7.5-15的水洗涤，挤干物料，作为后续酶水解的底物。分析底物的水分、葡聚糖和木聚糖含量。结果表明，玉米秸杆经稀酸蒸汽爆破预处理、洗涤、挤干后，物料中水分含量为68.44%，葡聚糖和木聚糖质量分数分别为52.34%和4.49% (干基)。实施例2:底物浓度对玉米秸杆纤维素酶水解的影响
(I)称取稀酸蒸汽爆破洗涤物料(实施例1制备)绝干重分别为5.0g、7.5g、10.0g、
12.5g、15.0g于5个250mL三角瓶中，在每个三角瓶中加入lmol/L柠檬酸缓冲液2.5mL、按17.5FPIU/g纤维素的酶加量分别在每个三角瓶中加入相应的纤维素酶，在每个三角瓶中添加适量的蒸馏水使酶解体系中水分总体积为50mL，用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖子，于150转/分、50°C的恒温摇床中酶解72h。(2)水解结束后，分别将上述水解物用离心机于4000转/分条件下离心lOmin，取上清液适当稀释后测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度，并计算酶水解得率。底物浓度对玉米秸杆纤维素酶水解得率 的影响作用结果见表I。葡萄糖和纤维二糖浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下:色谱仪:Agillentll00 高效液相色谱仪；色谱柱:Bio_Rad Aminex HPX-87H ;流动相:0.005mol/L硫酸，流速:0.6mL/min ;柱温:55°C ;检测器:示差折光检测器；进样量:10y L。外标法测定。葡聚糖酶水解得率(％)=[ (C1X0.9+ C2X0.95) X0.05/ (WX 0.5234) ] X 100% 式中:
Cl:水解液稀释后葡萄糖浓度，g/L ；
C2:水解液稀释后纤维二糖浓度，g/L ；
0.9:葡萄糖与葡聚糖的转换系数；
0.95:纤维二糖与葡聚糖的转换系数；
0.05:水解糖液体积，L ；
0.5234:原料中葡聚糖含量，% ；
W:底物绝干重，go表I底物浓度对玉米秸杆纤维素酶水解得率的影响
底物浓度(％)IlO |15 |20 |25 |30
酶水解得率(％) |81.7 \72.8 |66.2 \&2.8 丨49.3
结果表明，底物浓度对稀酸蒸汽爆破预处理玉米秸杆的纤维素酶水解影响较大,在每
克纤维素的酶用量相同的条件下，当底物浓度10.0%-15.0%时可以获得较高的酶水解得率。
实施例3:15%底物浓度(固液比1:6.67)下预处理玉米秸杆的纤维素酶水解；
1、取4640.8mL蒸馏水于121°C灭菌15min，冷却后加入已空罐灭菌的IOL生化反应器中。2、取实施例1的玉米秸杆酸性蒸汽爆破洗涤物料3327g (绝干重1050g，水分2277g，葡聚糖549.57g)在搅拌的情况下加入IOL生化反应器中，充分搅拌后用少量固体氢氧化钠中和至pH值为4.8。3、将反应体系升温至50°C，加入纤维素酶82.20g (按17.5FPIU/g葡聚糖的酶加量)，整个酶解体系为7000mL，于48-50°C条件下水解72h。水解过程中前12h每隔6h取样一次、12h后每隔12h取样，样品于4000转/分条件下离心IOmin后取上清液用HPLC测定水解液中葡萄糖和纤维二糖浓度。并计算酶水解得率。水解历程如图1。4、水解72h，将水解物于4000转/分条件下离心IOmin (离心管事先灭菌)，上清液用于后续水解糖液的浓缩发酵，离心固体渣用于后续酶解渣的固体变温发酵。结果表明，稀酸蒸汽爆破预处理的玉米秸杆在底物浓度15%、酶用量17.5FPIU/g纤维素、pH4.8条件下经纤维素酶水解72h，水解糖液中葡萄糖浓度为60.68g/L，纤维二糖浓度为0.90g/L,纤维素水解得率为70.65%。实施例4:水解糖液的浓缩、浓缩糖液的发酵
1、取实施例3的蒸汽爆破预处理玉米秸杆经纤维素酶水解、水解物的离心上清液3000mL，在旋转蒸发器上于70°C、160mbar下真空浓缩至IOOOmL (浓缩3倍)，用HPLC分析浓缩糖液中的葡萄糖浓度为170.69g/L。 2、取上述浓缩糖液IOOOmL于2L发酵罐中，加入0.24g尿素、0.08g硫酸镁、0.08g氯化锌、0.20g氯化钙，4.0g活性酿酒酵母干粉，于100转/分、30°C发酵48h，每隔8h取样于4000转/分条件下离心lOmin，取上清液适当稀释后用HPLC测定葡萄糖和乙醇浓度，并计算糖利用率和乙醇得率。浓缩水解糖液发酵结果如图2。葡萄糖和乙醇浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下:色谱仪:AgillentllOO高效液相色谱仪；色谱柱:Bio_Rad Aminex HPX-87H ;流动相:0.005mol/L硫酸，流速:0.6mL/min ;柱温:55°C ;检测器:示差折光检测器；进样量:10y L。外标法测定。葡萄糖利用率计算如下:
葡萄糖利用率(％)= [ (170.69 - C3)/170.69] XlOO ；
式中:
C3:发酵液稀释后葡萄糖浓度，g/L ;
170.69:初始葡萄糖浓度，g/L。乙醇得率计算如下:
乙醇得率(％)= [C4/ (170.69- C3) X0.51] XlOO 式中:
C3:发酵液稀释后葡萄糖浓度，g/L ;
C4:发酵液稀释后乙醇浓度，g/L ；
170.69:初始葡萄糖浓度，g/L ；
0.51:葡萄糖和乙醇的理论糖醇转化率。结果表明，葡萄糖浓度为170.69g/L的浓缩水解糖液经酿酒酵母48h发酵，发酵醪液中葡萄糖浓度为1.81g/L、乙醇浓度为80.67g/L，糖利用率和乙醇得率分别为98.94%和93.66%o实施例5:酶解渣的固体变温发酵
1、取实施例3蒸汽爆破预处理玉米秸杆经纤维素酶水解、水解物离心得到的沉淀酶解渣2g，测定水分含量为71.85%。2、取实施例3得到的酶解渣5g于烧杯中，加入70mL蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌后于4000转/分条件下离心lOmin，取上清液用HPLC测定其中葡萄糖浓度，并换算成每克渣所含的葡萄糖量。结果表明，每克渣所含葡萄糖的量为43.6mg。3、分别取实施例3得到的酶解渣75g于4个250mL事先灭菌的圆底烧瓶中，加入ImL营养盐(尿素12g/L、硫酸镁4g/L、氯化锌4g/L、氯化钙10g/L)，加入适量活性酿酒酵母悬浮液，使酵母含量为2.0X IO6个/g酶解渣。将烧瓶浸于30°C水浴锅中，于搅拌转速80转/分的条件下发酵32h，当体系中的游离葡萄糖被耗尽后，再将温度分别升至32、34、36、38 °C继续发酵至72h。4、发酵72h后，分别将发酵曲取出置于IOOOmL烧杯中，在每个发酵曲中加入450mL蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌后于4000转/分条件下离心lOmin，取上清液测定乙醇浓度和葡萄糖浓度，并计算糖利用率和乙醇得率。酵母浓度对酶解渣固体发酵的影响作用表2。表2酵母浓度对酶解渣固体发酵的影响
权利要求
1.一种变温发酵制取乙醇的方法，包括纤维原料预处理、酶水解、水解物固液分离、清液浓缩发酵和酶解渣发酵步骤；其特征在于:在所述的酶解渣发酵步骤中，酶解渣不经过洗涤分离糖，直接用酿酒酵母固体变温发酵成乙醇。
2.根据权利要求1所述的变温发酵制取乙醇的方法，其特征在于:所述的固体变温发酵为:用酿酒酵母于28-30°C条件下厌氧发酵18-36h，再变温至32_38°C下继续厌氧发酵36-48h。
3.根据权利要求1或2所述的变温发酵制取乙醇的方法，其特征在于:在所述的固体变温发酵中，酿酒酵母的用量为4X 105 2 X 106个/g酶解残渣。
4.根据权利要求1所述的变温发酵制取乙醇的方法，其特征在于:所述的植物纤维原料预处理指以提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及度所采用的物理、化学、生物或以上几种方法联合应用的方法。
5.根据权利要求1所述的变温发酵制取乙醇的方法，其特征在于:在所述的酶水解中，所用的酶为纤维素酶，是以木霉、曲霉或细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的一种或多种酶的复合物。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的变温发酵制取乙醇的方法，其特征在于，具体步骤如下:(1)先粉碎、酸处理、蒸汽爆破处理纤维原料，再水洗、挤干，得酶解底物；(2)混合酶解底物和纤维素酶底物浓度10-15%，控制pH4.0-6.0，45-55°C条件下酶解反应48-72h ;其中，反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为10-25FPIU/g ；(3)酶水解反应结束后将水解物离心固液分离，得清液和酶解渣； (4)清液经减压蒸发浓缩至糖液中葡萄糖浓度为160-250g/L，在浓缩糖液中添加营养盐后，用酿酒酵母于28-35 °C条件下厌氧发酵24-48h ；(5)在酶解渣中添加营养盐，用酿酒酵母于28-30°C条件下厌氧发酵18-36h，再变温至32-38 °C下继续厌氧发酵36-48h。
全文摘要
本发明公开了一种变温发酵制取乙醇的方法，包括纤维原料预处理、酶水解、水解物固液分离、清液浓缩发酵和酶解渣发酵步骤；在所述的酶解渣发酵步骤中，酶解渣不经过洗涤分离糖，直接用酿酒酵母固体变温发酵成乙醇。该方法的纤维素在较低底物浓度下(10-15%)进行较高得率的水解，水解后糖液和水解渣分离，清液浓缩进行高糖(160-250g/L)发酵，酶解渣直接固体变温发酵，既避免了低底物浓度酶解、发酵分开进行工艺中酶解渣洗涤耗用大量水和能耗高的问题；又避免了高底物浓度酶解、水解物直接发酵工艺中酶水解得率低、能耗高、不能实现高糖发酵和酵母回收循环利用的问题；同时酶解渣的固体变温发酵也具有同步糖化发酵的作用，具有很好的实用性。
文档编号C12R1/865GK103146764SQ20121031454
公开日2013年6月12日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者勇强, 余世袁, 储秋露, 马斌, 徐勇, 朱均均, 李鑫 申请人:南京林业大学