专利名称：一种链格孢菌培养基及其制备方法
技术领域：
本发明属于植物病原菌室内培养技术领域，具体涉及ー种链格孢菌培养基及其制备方法。
背景技术：
烟草赤星病是ー种广泛发生于世界各烟区的严重病害，主要在烟叶近成熟时开始发生，在烟株打顶后，随着叶片的成熟，烟草赤星病从烟株下部叶片开始向上逐步发展。主要危害部位是叶片，茎杆、花梗、蒴果也会受危害。赤星病不仅使烟叶残缺不全，在烘烤过程中病斑扩大，使烘烤叶片颜色不匀、叶片厚薄不均，等级下降，而且由于内在品质不协调，如总氮、蛋白质升高，总糖、还原糖降低，糖碱比值下降，使吃味变差，降低了エ业使用价值。烟草赤星病的病原为链格抱菌(Alternariaalternata (Fries) Keissler),属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、链格孢属。链格孢菌生长的最适温度是25 30 V，链格孢菌对酸碱度的适应范围广，生长的PH范围为3 10. 2，最适pH为5. 5^7. 5。室内培养链格孢菌是在黑暗条件下，这样有利于产孢，但是孢子萌发率低，也抑制菌丝生长，因为光照有利于孢子萌发和菌丝生长。目前，室内培养链格孢菌的培养基主要是PDA培养基(用马铃薯、葡萄糖或蔗糖、水和琼胶配制)。此培养基虽然经济，但菌丝生长慢，产孢量小，难以满足研究的需要。因此，开发ー种能加快菌丝生长速度，提高产孢量的链格孢菌培养基是非常必要的。
发明内容
本发明的第一目的在于提供ー种能加快菌丝生长、提高产孢量的链格孢菌培养基，第二目的在于提供该培养基的制备方法。本发明的第一目的是这样实现的，所述培养基包括烟叶汁、甜白酒和琼脂，以IOOOml计，所述培养基中含烟叶汁l(T30ml，甜白酒2(T32ml，琼脂l(T25g，以水作为培养基调配剂调配至额定量；所述的培养基的PH值为5. 5^7. 5。本发明的第二目的是这样实现的，包括前处理、培养基料制备、培养基制备、后处理步骤，具体包括
A、前处理按配方备料，按技术要求对分别对各组分料进行加工处理按配方量取燕麦加入沸水中熬煮至少3min，过滤取滤液备用；取成熟鲜烟叶片经清洗、晾除表面水分后压榨、过滤所得到的烟叶原汁备用；
B、培养基料制备按配方比例取烟叶汁、甜白酒，以水或燕麦汁作为调配剂进行调配混合均匀得培养基料；
C、培养基制备取培养基料，加入配方量的琼脂，然后加热使其完全溶解得到目标培养
基;
D、后处理将目标培养基进行分装，经灭菌处理制得成品链格孢菌培养基。甜白酒就是醪糟，是以大米、玉米、粟等粮食作物为原料，经清水浸泡或煮熟，再蒸透，之后撒上甜酒曲，淋少许凉水，搅拌均匀，放置在温暖干燥处发酵；夏季约广2天、冬季约需:T5天即成甜白酒。生活中的甜白酒是将液体和固体部分一起服用，本发明所使用的甜白酒的液体部分，含こ醇量约8 15 %。本发明是根据链格孢菌的生长特性，所设计的更为适合链格孢菌生长的培养基，简称JCA培养基。该培养基是以燕麦汁和琼脂为基础成分，加入烟叶汁和甜白酒制成。烟叶汁和甜白酒的使用，为链格孢菌提供了关键的营养物质，从而促进其菌丝生长、提高产孢量。成熟的烟叶中含淀粉约1(T30% (淀粉在发酵过程中会转化为单糖、双糖及糊精)、含蛋白质约5 15% (蛋白质中氮元素的平均含量为16%)、烟碱(杀虫活性高，广谱，且有一定的杀卵作用)，还含有有机酸和矿物质等，烟叶汁中集合了上述成份，能为链格孢菌生长创造非常理想的营养环境。甜白酒富含こ醇和多糖，在链格孢菌对数生长期快结束时，其呼吸途径转变，こ醇或こ酸可以诱发其发生减数分裂，从而产生孢子；多糖有利于链格孢菌进行有性繁殖，促进孢子生成。试验证明本发明的培养基明显加快了链格孢菌的菌丝生长速度，提高了产孢量，降低了细菌污染率，且该方法操作简便，成本低廉，具备良好的市场应用前景。
图I为本发明的エ艺流程图。
具体实施例方式下面结合实例对本发明作进ー步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。本发明所述培养基包括烟叶汁、甜白酒和琼脂，以IOOOml计，所述培养基中含烟叶汁l(T30ml，甜白酒2(T32ml，琼脂l(T25g，以水作为培养基调配剂调配至额定量；所述的培养基的PH值为5. 5 7. 5。所述培养基以水基燕麦汁代替水作为调配剤。所述水基燕麦汁为80(Tl000ml水中加入2(T50g燕麦经水沸煮3min以上并经过滤所得到的滤液。所述水基燕麦汁为90(T950ml水中加入2(T30g燕麦经水沸煮3min以上并经过滤所得到的滤液。所述的烟叶汁为成熟鲜烟叶片经压榨、过滤得到的烟叶原汁。本发明所述的链格孢菌培养基的制备方法，包括包括前处理、培养基料制备、培养基制备、后处理步骤，具体包括
前处理按配方备料，按技术要求对分别对各组分料进行加工处理按配方量取燕麦加入沸水中熬煮至少3min，过滤取滤液备用；取成熟鲜烟叶片经清洗、晾除表面水分后压榨、过滤所得到的烟叶原汁备用；
培养基料制备按配方比例取烟叶汁、甜白酒，以水或燕麦汁作为调配剂进行调配混合均匀得培养基料；
培养基制备取培养基料，加入配方量的琼脂，然后加热使其完全溶解得到目标培养
基;
后处理将目标培养基进行分装，经灭菌处理制得成品链格孢菌培养基。所述的燕麦汁由燕麦原粒、燕麦片或燕麦粉制备得到；所述的燕麦汁米取不少于3层的医用纱布或专用过滤材料过滤得到。所述的烟叶汁经过60、0目筛过滤得到。所述的灭菌方式采取湿热灭菌、干热灭菌中的任意ー种。所述的灭菌方式为121で下湿热灭菌20 401^11。
实施例I
取燕麦片30g、烟叶汁15ml、甜白酒20ml、琼脂12g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为8 % ;首先将燕麦片加入900ml沸水中，继续煮3min，滤去燕麦，将滤液冷却至室温，接着加入烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积1000ml，调PH值至6，加入琼脂加热溶解后分 装，在121°C下湿热灭菌20min，冷却即得。实施例2
取燕麦粉25g、烟叶汁20ml、甜白酒22ml、琼脂10g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为10 % ;首先将燕麦粉加入900ml沸水中，继续煮8min，滤去燕麦，将滤液冷却至室温，接着加入烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积1000ml，调PH值至6. 5，加入琼脂加热溶解后分装，在140°C下干热灭菌2h，冷却即得。实施例3
取燕麦片28g、烟叶汁25ml、甜白酒24ml、琼脂20g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为12 % ;首先将燕麦片加入900ml沸水中，继续煮5min，滤去燕麦，将滤液冷却至室温，接着加入烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积1000ml JfPH值至5. 5，加入琼脂加热溶解后分装，在121°C下湿热灭菌40min，冷却即得。实施例4
取燕麦片35g、烟叶汁28ml、甜白酒28ml、琼脂22g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为14 % ;首先将燕麦片加入900ml沸水中，继续煮8min，滤去燕麦，将滤液冷却至室温，接着加入烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积1000ml，调PH值至6. 8，加入琼脂加热溶解后分装，在180°C下干热灭菌lh，冷却即得。实施例5
取燕麦细粒20g、烟叶汁10ml、甜白酒26ml、琼脂15g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为15 % ;首先将燕麦细粒加入900ml沸水中，继续煮4min，滤去燕麦，将滤液冷却至室温，接着加入烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积IOOOml，调PH值至7，加入琼脂加热溶解后分装，在121°C下湿热灭菌30min，冷却即得。实施例6
取燕麦粉40g、烟叶汁30ml、甜白酒30ml、琼脂13g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为8 % ;首先将燕麦粉加入900ml沸水中，继续煮6min，滤去燕麦，将滤液冷却至室温，接着加入烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积1000ml，调PH值至7. 5，加入琼脂加热溶解后分装，在121°C下湿热灭菌40min，冷却即得。实施例7
取燕麦片33g、烟叶汁18ml、甜白酒32ml、琼脂25g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为10 % ;首先将燕麦加入900ml沸水中，继续煮7min，滤去燕麦，将滤液冷却至室温，接着加入烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积1000ml，调PH值至7. 2，加入琼脂加热溶解后分装，在160°C下干热灭菌I. 5h，冷却即得。实施例8
取烟叶汁30ml、甜白酒32ml、琼脂25g，并准备纯净水；所述的甜白酒こ醇含量为12 %；将烟叶汁、甜白酒，加纯净水至总体积1000ml，调PH值至6. 5，加入琼脂加热溶解后分装，在121°C下湿热灭菌20min,冷却即得。以实施例f 8制备的培养基与PDA培养基进行培养链格孢菌对比试验
I材料与方法
I.I材料 JCA培养基燕麦，烤烟汁，甜白酒，水，琼脂 PDA培养基马铃薯、葡萄糖、水和琼脂 赤星病菌菌株 1.2方法
JCA培养基制备方法如上述
具体实施例方式 PDA培养基制备将200g洗净去皮后的马铃薯切碎，加水IOOOml煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000ml，加入15g葡萄糖和20g琼脂，加热溶解，然后分装，121°C , 20min 灭菌。烟草赤星病菌菌丝生长和产孢量測定
将直径为7mm的赤星病菌菌碟在无菌条件下分别移入以PDA和JCA制备的平板上，置于25°C培养箱培养。以后逐日观察菌落形态，第4d、6d、8d、10d测定菌落直径，同时在第4d、6d、8d、10d用含0. 05%Tween-20的无菌水20ml刮下菌丝及孢子，装入广ロ瓶中充分摇匀，用两层纱布过滤得菌悬液，用血球计数器在显微镜下测定孢子数，计算出每皿产孢量。2结果分析
将烟草赤星病菌分别接种于PDA和JCA培养基上后，于4d、6d、8d、10d测量菌落直径并计数产孢量，然后进行差异显著性分析，结果如表I所示，在接种后4d和6d，在PDA和JCA培养基上，菌落直径在5%水平上均差异显著；在接种后8d和10d，在PDA和JCA培养基上，菌落直径在1%水平上均差异极显著。接种后4d，在PDA和JCA培养基上，产孢量5%水平上差异显著；接种后6d、8d和10d，在PDA和JCA培养基上，产孢量在1%水平上均差异极显著。综上所述，烟草赤星病菌在JCA培养基上的菌落直径和产孢量均显著大于在PDA培养基上的菌落直径和产孢量，且不同时间差异均达显著或极显著水平。表I链格孢菌在不同培养基上生长的菌落直径和产孢量差异显著性分析
权利要求
1.ー种链格孢菌培养基，所述培养基包括烟叶汁、甜白酒和琼脂，其特征在于以IOOOml计，所述培养基中含烟叶汁l(T30ml，甜白酒2(T32ml，琼脂l(T25g，以水作为培养基调配剂调配至额定量；所述的培养基的PH值为5. 5^7. 5。
2.根据权利要求I所述的链格孢菌培养基，其特征在于所述培养基以水基燕麦汁代替水作为调配剤。
3.根据权利要求2所述的链格孢菌培养基，其特征在干所述水基燕麦汁为80(Tl000ml水中加入2(T50g燕麦经沸煮3min以上并经过滤所得到的滤液。
4.根据权利要求2或3所述的链格孢菌培养基，其特征在于所述水基燕麦汁为90(T950ml水中加入2(T30g燕麦经水沸煮3min以上并经过滤所得到的滤液。
5.根据权利要求I所述的链格孢菌培养基，其特征在于所述的烟叶汁为成熟鲜烟叶片经压榨、过滤得到的烟叶原汁。
6.ー种制备权利要求I、任意一项所述链格孢菌培养基的方法，其特征在于包括前处理、培养基料制备、培养基制备、后处理步骤，具体包括 A、前处理按配方备料，按技术要求分别对各组分料进行加工处理按配方量取燕麦加入沸水中熬煮至少3min，过滤取滤液备用；取成熟鲜烟叶片经清洗、晾除表面水分后压榨、过滤所得到的烟叶原汁备用； B、培养基料制备按配方比例取烟叶汁、甜白酒，以水或燕麦汁作为调配剂进行调配混合均匀得培养基料； C、培养基制备取培养基料，加入配方量的琼脂，然后加热使其完全溶解得到目标培养基; D、后处理将目标培养基进行分装，经灭菌处理制得成品链格孢菌培养基。
7.根据权利要求6所述的链格孢菌培养基的制备方法,其特征在于所述的燕麦汁由燕麦原粒、燕麦片或燕麦粉制备得到；所述的燕麦汁采取不少于3层的医用纱布或专用过滤材料过滤得到。
8.根据权利要求6所述的链格孢菌培养基的制备方法，其特征在于所述的烟叶汁经过60、0目筛过滤得到。
9.根据权利要求6所述的链格孢菌培养基的制备方法，其特征在于所述的灭菌方式采取湿热灭菌、干热灭菌中的任意ー种。
10.根据权利要求6或9所述的链格孢菌培养基的制备方法，其特征在于所述的灭菌方式为121°C下湿热灭菌2(T40min。
全文摘要
本发明公开了一种链格孢菌培养基及其制备方法，所述培养基包括烟叶汁、甜白酒和琼脂，以1000ml计，所述培养基中含烟叶汁10~30ml，甜白酒20~32ml，琼脂10~25g，以水作为培养基调配剂调配至额定量；所述的培养基的pH值为5.5~7.5。所述的培养基配方为烟叶汁10~30ml，甜白酒20~32ml，琼脂10~25g，水1000ml，pH值为5.5~7.5。所述的制备方法，包括前处理、培养基料制备、培养基制备、后处理步骤，具体包括对各组分料进行加工处理，取烟叶汁、甜白酒，以水或燕麦汁作为调配剂进行调配混合均匀，加入琼脂，加热使其完全溶解分装，经灭菌处理制得成品链格孢菌培养基。试验证明本发明培养基明显加快了链格孢菌菌丝生长速度，提高产孢量，降低细菌污染，且操作简便，成本低廉。
文档编号C12N1/14GK102851217SQ20121031485
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者于海芹, 焦芳婵, 肖炳光, 李永平, 刘勇, 许美玲 申请人:云南省烟草农业科学研究院