黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法

专利名称：黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产葡萄糖酸钾的方法，具体是采用黑曲霉菌种利用淀粉及淀粉质原料通过双酶制糖、深层好氧发酵生产葡萄糖酸钾的方法。
背景技术：
葡萄糖酸钾作为营养增补剂，酸度调节剂，螯合剂，酵母食料等多用于固体饮料、蛋糕预混合粉、甜食预混合粉等。主要用作营养品、膳食添加剂，多价螯合剂。是一种有效的补钾剂，它能保持细胞内渗透力，调节人体酸碱平衡，对维持骨骼肌张力具有重要作用。是人体各种缺钾症的有效补钾剂，是钾的良好食品强化剂。在美国葡萄糖酸钾类药物类型较 多。目前生产葡萄糖酸钾的方法主要有两种一种是脱钙法，即利用黑曲霉发酵葡萄糖生产得到葡萄糖酸钙溶液，经过滤、蒸发、结晶、离心分离、烘干包装得到结晶葡萄糖酸钙，溶晶后加入硫酸生成葡萄糖酸和硫酸钙沉淀，将得到的葡萄糖酸加入氢氧化钾或碳酸钾反应得到葡萄糖酸钾溶液，再经蒸发、结晶离心分离、烘干得到葡萄糖酸钾产品；二是多相催化氧化法，该法系气、液、固三相在反应器内进行的反应，它是以结晶葡萄糖为原料，配制一定浓度的葡萄糖溶液，以多元金属/炭催化剂、钯/炭合金Pd ( Pt) / C为催化剂，空气为氧化剂，在30 -70 V下，将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，向反应器溶液中通入空气，并不断流加一定浓度的NaOH溶液来维持一定的pH值。反应后的溶液经冷却、抽滤、滤液减压浓缩、离心分离、结晶、烘干、包装后得到葡萄糖酸钠晶体。然后脱钠制取葡萄糖酸溶液，加入KOH得到葡萄糖酸钾溶液，再经蒸发、结晶离心分离、烘干得到葡萄糖酸钾产品。上述两种生产方法中，存在各自的不足。第一种方法脱钙法生产葡萄糖酸钾不足
1.生产成本高由于葡萄糖酸钙溶解度小于4%，致使发酵初糖浓度低(<15%)，反应终产物葡萄糖酸钙发酵液浓度低于15%，生产成本高；
2.造成环境污染同时生产加入硫酸产生固体废物硫酸钙，难以处理造成污染；
3.工艺线路长、投资大、能耗高先提取葡萄糖酸钙后，再溶晶加入KOH溶液进行反应后，提取葡萄糖酸钾，需两次蒸发、结晶、离心分离、烘干造成投资大、能耗高、生产成本高；
4.产生葡萄糖酸钙废母液。第二种方法多相催化氧化法缺点是
1.所用催化剂在循环使用一定次数后，催化效率下降，使葡萄糖转化率降低，反应时间延长甚至基本无催化活性，催化剂必须报废更新，相应提高了单位产品催化剂耗量，也使产品生产成本较高；
2.工艺线路长，成本高；
3.由于金属催化剂具有一定的毒性，其产品通常不能作为食品添加剂用于食品生产，不安全；因此，产品的应用受到一定的限制。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生产成本低、工艺线路短、环境污染少、应用安全的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法。为解决上述技术问题，本发明包括以下步骤
A、将淀粉及淀粉质原料加水调浆后，加入耐高温α-淀粉酶，经一次喷射得液化液，再加入复合糖化酶进行糖化，糖化后过滤制取葡萄糖溶液；
B、利用黑曲霉P12tl5X21菌种发酵葡萄糖溶液，发酵过程中流加离子膜KOH溶液，中和产生的葡萄糖酸生成葡萄糖酸钾溶液；
C、将葡萄糖酸钾溶液提纯得到葡萄糖酸钾成品。所述的步骤A中，淀粉与水的比例为I : 1-2 (ff/ V)，用硫酸或用KOH调节PH值为 6. 0—6. 5，按8— 20u/g干淀粉量加入高温α -淀粉酶，喷射温度控制在100_115°C，用稀硫酸调节PH值为4. 0-4. 5，按80— 180u/g干淀粉两加入复合糖化酶，灭酶终止糖化滤除蛋白。所述的糖化时间为50-60小时，酒检合格，DE值97%以上，升温至80_85°C，保温30-40分钟灭酶终止糖化。所述的步骤B中，利用黑曲霉菌种经斜面菌种驯化培养，摇床驯化筛选，得到黑曲霉P12C15X21菌种；再经麸曲菌种的放大培养后，制得孢子悬浮液；按麸曲300g/ m3接种量，采用火焰封口法将黑曲霉孢子悬浮液接入一级种子罐内进行培养，一级种子培养成熟后，转入二级种子罐培养；二级种子培养成熟后转入发酵罐发酵，在发酵过程中控制温度、压力、通风量，并通过自动加入离子膜KOH溶液维持PH值为4. 5—6. O,直至葡萄糖浓度O. 5—
O.8%时，发酵结束。所述的一级种子培养按以下条件进行采用火焰封口法将黑曲霉孢子悬浮液倒入罐内，控制罐压O. 08-0. 12MP、罐温35-38 °C、通风量O. 1-0. 2m3/m3. min、搅拌转速100—115rpm、PH值自然，当PH值为2. 9—3. I、总含酸量彡O. lg/100ml、种龄7_llh镜检无杂菌、菌丝健壮时转二级种子罐。所述的二级种子培养按以下条件进行一级种子罐的量为二级种子罐的量的10%，保持二级罐压力O. 08-0. 12MPa、罐温35-38°C、通风量O. 1-0. 2m3/m3· min、搅拌转速100rpm、PH值为2. 9—3. 1，当总含酸量彡O. lg/100ml、种龄5—8h镜检无杂菌、菌丝健壮时
转发酵罐。所述的发酵罐发酵按以下条件进行二级种子罐的量为发酵罐的量的10%，罐压 O. 08-0. 12MPa、罐温 35—41°C通风量 O. 1-0. 2m3/m3. min、初糖浓度 25—32%、搅拌转速80-100rpm、发酵过程中通过流加25— 40%离子膜KOH溶液，将发酵过程中产生葡萄糖酸中和成葡萄糖酸钾溶液，控制PH值为4. 5—6. O,发酵周期20— 30h，测残糖O. 5—0. 8%时停
止发酵。所述的葡萄糖酸钾溶液提纯按以下步骤进行将葡萄糖酸钾溶液利用高温冷凝水加热至70— 80°C，再经板框过滤去杂质；脱色、过滤；在多效蒸发结晶器内蒸发结晶，控制温度60_105°C，真空度-O. 09— - O. 03 MPa ;分尚、干燥。本发明的优点效果是具有原料丰富易得，且原料成本远远低于液体糖和结晶葡萄糖，种子培养及发酵培养基中均不含有机营养盐，不仅节约成本而且利于提取，成品杂质含量低；发酵初糖浓度高、周期短、控制温度高(浓度可达30%以上，周期20-30h，温度40°C )、发酵过程易于控制、产品易提取、易于大工业化生产，菌种在高浓度K+条件下正常发酵。同时具有成本低，发酵产物单一，产品质量高易控制，无废水废气产生等优点；无葡萄糖酸钙母液和硫酸钙废物产生，大大减少环境污染；工艺线路短，减少了制取葡萄糖酸钙时的蒸发、结晶、烘干等工序，能耗低。以淀粉、淀粉质(蔗糖)为原料经双酶法制糖，深层好氧发酵，在发酵过程中直接流加离子膜KOH溶液，得到葡萄糖酸钾溶液，避免了发酵过程中流加碳酸钙，生成葡萄糖酸钙后，加硫酸得到葡萄糖酸后再加入氢氧化钾，经提取后得到葡萄糖钾，致使生产线路长，成本高。采用一次喷射液化比二次喷射液化的双酶法制糖工艺，可以降低蒸汽消耗，同时糖液中的蛋白质比二次喷射时含量高，糖液中部分蛋白的存在使发酵过程中不再添加有机氮源，对后续提取更为有利。在葡萄糖酸钾溶液的提纯中，采用多效连续蒸发结晶的热结晶工艺，直接在多效蒸发结晶器内蒸发结晶，节约蒸汽、降低电耗，生产成本大幅度降低。


图I为本发明的生产工艺流程图。
具体实施例方式I.制取葡萄糖溶液
I)调浆
按淀粉及淀粉质原料与水I :1-2 (W/ V)的比例，将淀粉加入调浆罐中，用硫酸或用KOH调至PH值为6. 0-6. 5，按8 — 20u/g干淀粉加入高温α -淀粉酶；搅拌20-30分钟。2)喷射液化
采用一次喷射液化工艺，开启淀粉泵将浆液控制5-50m3/h流量进入喷射器进料压力大于蒸汽压力O. 02-0. 04Mpa，温度控制在100_115°C，将调浆液与蒸汽迅速混合进入承压罐,维持5-6分钟,进入闪蒸罐,将料温降至95—98 °C后,再进入维持罐,维持90-120分钟碘检合格后，经换热器将料温降至62-64°C进入PH调浆罐。3)糖化
用稀硫酸调PH值为4. 0-4. 5，按80— 180u/g干淀粉加入糖化酶，打入糖化罐，糖化50-55小时，测DE值> 97%，且不再明显上升，酒检合格，升温至80-85°C，保温30-40分钟灭酶终止糖化。4)过滤
用泵将糖化液打入板框压滤机，除去玉米蛋白，得到15%—35%的糖液。2.深层好氧发酵工艺
利用黑曲霉菌种经斜面菌种培养，摇床筛选驯化，筛选得到黑曲霉P12tl5X21菌种，经茄子瓶放大培养，麸曲菌种的培养，制得孢子悬浮液。按麸曲300g/ m3接种量，采用火焰封口法将黑曲霉孢子悬浮液接入一级种子罐内，进行一级种子培养成熟后，转入二级种子罐培养。二级种子培养成熟后转入发酵罐发酵，在发酵过程中控制温度、压力、通风量并通过自动加入离子膜KOH溶液维持PH=4. 5—6. O。直至葡萄糖浓度< O. 5%时发酵结束。其工艺控制过程是
培养基的制备I)平板、斜面菌种培养基采用察氏-多氏琼脂培养基，其成分(w/ν)是蔗糖2%、硝酸钠O. 3%、氯化钾O. 5°/ 、七水硫酸镁O. 5%0、琼脂2%、硫酸亚铁O. 01°/ 、琼脂2%，水余量，磷酸氢二钾用量在察氏一多氏琼脂培养基基础上由1°/ 提高至3%0，以提高菌种的耐高浓度钾离子。2)摇床培养基g/L:
葡萄糖 150-250NH4H2PO4 O. 4 - O. 8K2HPO4O. 04—0. 06
KH2PO4O. 2—0. 4
MgSO4 · 7H20 0.1—0.3。3)麸曲菌种培养基成分是小麦麸皮和自来水，比例I :0. 8—1. O。 4) 一级种子培养基g/L
葡萄糖150-250
NH4H2PO4O. 4 - O. 8
K2HPO4O. 04—0. 06
KH2PO4O. 2—0. 4
MgSO4 · 7H20 O. 1—0. 3 PH值自然。5) 二级种子培养基g/L
葡萄糖200— 250
NH4H2PO4O. 4 - O. 8
K2HPO4O. 04—0. 06
KH2PO4O. 2—0. 4
MgSO4 · 7H20 O. 1—0. 3 PH值自然。6)发酵培养基g/L:
葡萄糖250— 300
NH4H2PO4O. 4 - O. 8
K2HPO4O. 04—0. 06
KH2PO4O. 2—0. 4
MgSO4 · 7H20 O. 1—0. 3 PH 值4. 5 — 6. O。斜面菌种培养基、麸曲菌种培养基、一二级种子培养基、发酵培养基中，不添加蛋白胨、氨基酸、玉米浆、尿素等有机氮及其它营养物。解决了其他发酵培养基中加入有机氮及其它有机营养物造成的成本浪费问题。并且防止菌体疯长而产量下降。同时，不添加上述营养物，还便于提纯，进一步节约成本。平板、斜面菌种培养基中，磷酸氢二钾用量在察氏一多氏琼脂培养基基础上由1°/ 提高至3°/ ，以提高菌种的耐高浓度钾离子。防止发酵过程中流加KOH后K+浓度增高而导致菌体细胞渗透压升高影响发酵。3.菌种驯化筛选及扩大培养将黑曲霉菌种进行驯化，驯化目的是提高菌种的耐高浓度钾离子，驯化、筛选、扩培步骤如下
I)把所用物品及培养基包装好，115°c灭菌7分钟。2)倒板无菌操作条件下，将灭菌后冷却至60_70°C的平板培养基倒入培养皿内，均匀铺满板底，保持水平放置，凝固后备用。3)取黑曲霉菌种，制成孢子悬液于弹子瓶，打散、过滤到无菌三角瓶中。4)吸取菌悬液于无菌水管中做梯度稀释。5)用无菌吸管吸取孢子悬液两滴于培养皿中，涂布均匀。6)培养温度36_37°C，倒置培养3_4天，待孢子长出，移接于斜面培养基。
7)斜面放36_37°C恒温培养箱中培养6_7天，成熟后供菌种初筛。8)配制好的摇床培养基分装入三角瓶装，加塞包扎好115°C灭菌，自然冷却备用。9)接种无菌条件刮取斜面孢子接入装有摇床培养基的摇瓶中，纱布封口后送摇瓶间。10)摇床间36_37°C培养，培养过程流加离子膜Κ0Η，控制PH值4. 5—6. 0，培养2—3天。11)选取分析各菌株残糖，选取残糖低的菌株传代，36-37 °C，培养6-7天。经过以上步骤反复筛选制得黑曲霉P12tl5X21菌种，该菌种经斜面扩培，进行麸曲培养培养步骤如下
O配料按照用量准确称取所需要的麸皮量，按照麸皮水为I :0. 8—1. 0，加水拌匀，按每500ml三角瓶30g湿料装好，加塞包扎。2)灭菌将包扎好的瓶子装入灭菌锅，在O. IMpa, 121°C条件下灭菌20_30min。3)接种无菌操作条件下刮取斜面孢子，接种于制得的麸曲培养基中摇匀，36-37 °C 培养。4)接种6-7天，培养基内外都长满孢子后，培养结束，暂存间贮存。5)—级种子罐接种前，将成熟麸曲打散后移入盛水灭菌冷却后的孢子瓶中，制成孢子悬浮液备用。4. 一二级种子扩培
一二级种子扩培是将培菌室值得的麸曲孢子，在一、二种子罐内控制一定的温度、压力、通风量的条件下培养成为具有代谢能力的菌丝种子。其工艺控制过程是
I)一级种子培养
采用火焰封口法将黑曲霉孢子悬浮液倒入罐内，控制罐压O. 08-0. 12MP、罐温35-38°C、通风量 O. 1-0. 2m3/m3.min、搅拌转速 100—115rpm、PH 值自然。当 PH 值为 2. 9—
3.I、总含酸量> O. lg/100ml、种龄7_llh镜检无杂菌、菌丝健壮时转二级种子罐。2) 二级种子培养
一级种子罐的量为二级种子罐的量的10%，保持二级罐压力O. 08-0. 12MPa、罐温35-38 °C、通风量O. 1-0. 2m3/m3.min、搅拌转速IOOrpm, PH值为2. 9—3. 1，当总含酸量^ O. lg/100ml、种龄5 — 8h镜检无杂菌、菌丝健壮时转发酵罐。3)发酵罐发酵
二级种子罐的量为发酵罐的量的10%,罐压O. 08-0. 12MPa、罐温35 — 41°C通风量O.l-o. 2mVm3. min、初糖浓度25—32%、搅拌转速80_100rpm、发酵过程中通过自动流加25—40%离子膜KOH溶液，将发酵过程中产生葡萄糖酸中和成葡萄糖酸钾溶液，控制PH值为
4.5—6. O。发酵周期20— 30h，测残糖O. 5—0. 8%时停止发酵。5.葡萄糖酸钾溶液的提取
I)过滤
发酵成熟液中除含有主要产品葡萄糖酸钾之外，还含有菌丝体、蛋白质等固相杂质，除去这些固相杂质是保证成品质量的第一步。将发酵液用过程高温冷凝水加热至70— 80°C，再经板框过滤去菌体等杂质。使发酵液澄清透明，透光度>90%，过滤所得菌丝体外卖至饲料厂生产蛋白饲料。2)脱色过滤
过滤后的发酵液虽然澄清透明，但仍含有色素、有机物和胶体物质，如不进行脱色，发酵液的色泽会在蒸发后加深，致使成品呈黄褐色。本项目采用活性炭对发酵液进行脱色，发酵液中加入3-5%活性炭(物理炭、化学炭各50%)升温80°C保温30min脱色，脱色结束后发酵液经板框过滤除去活性炭，过滤至清液无色透明，透光度>99%，进入蒸发结晶工序。3)蒸发结晶
经脱色过滤后的葡萄糖酸钠发酵液浓度较低，不能直接结晶，必须进行浓缩提高发酵液中葡萄糖酸钠的浓度。常规的蒸发结晶工艺是间歇蒸发、降温结晶工艺，本方法采用多效连续蒸发结晶的热结晶工艺，直接在多效蒸发结晶器内蒸发结晶，控制温度60-105°C，真空度-O. 09——O. 03 MPa。当出现大量晶体后(晶体含量在35%以上)，控制发酵液波美度45Be’一46 Be’，母液波美度46-47 Be’时，关小出料泵回流阀，开启出料阀。该方法较常规方法节能70%。4)分离
多效蒸发结晶器放出的物料是葡萄糖酸钠结晶与母液的混合物，采用密闭式连续离心机将葡萄糖酸钠结晶和母液分离，分离过程中用去离子水洗掉晶体表面的杂质，用自动离心机将水分甩至3-5%以下时，湿晶体直接进入烘干工序，冲洗水和多数母液重新进入蒸发结晶工序，母液经过多次处理后，回收外卖至外部加工厂。本提取工艺不同于目前国内生产企业所使用的间歇蒸发、降温结晶、三足离心分离的提取工艺，而采用新型生产设备，从菌丝分离、料液蒸发到结晶分离，采用了节能、自动化设备，操作上实现了连续化、自动化，既缩短了操作周期，提高了工作效率，降低了劳动强度，又保证了产品质量。5)干燥、包装
离心分离后的葡萄糖酸钠晶体表面附有少量的游离水，采用新型HSVB系列低频高振幅振动流化床对湿晶体进行干燥，干燥好的产品经冷却控制温度< 75°C，水分< O. 5%时，后进入自动称重、包装设备，并取样检测，合格后入库。按以上步骤和条件实施的本发明的5个实例，具体实施条件如下
权利要求
1.ー种黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是包括以下步骤A、将淀粉及淀粉质原料加水调浆后，加入耐高温α-淀粉酶，经一次喷射得液化液，再加入复合糖化酶进行糖化，糖化后过滤制取葡萄糖溶液；B、利用黑曲霉P12tl5X21菌种发酵葡萄糖溶液，发酵过程中流加离子膜KOH溶液，中和产生的葡萄糖酸生成葡萄糖酸钾溶液；C、将葡萄糖酸钾溶液提纯得到葡萄糖酸钾成品。
2.根据权利要求I所述的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是所述的步骤A中，淀粉与水的比例为I :1-2 (W/ V)，用硫酸或用KOH调节PH值为6. O— 6. 5，按8— 20u/g干淀粉量加入耐高温α-淀粉酶，喷射温度控制在100_115°C，用稀硫酸调节PH值为4.0-4. 5，按80— 180u/g干淀粉量加入复合糖化酶，灭酶终止糖化滤除蛋白。
3.根据权利要求2所述的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是所述的糖化时间为50-60小时，酒检合格，DE值97%以上，升温至80_85°C，保温30-40分钟灭酶终止糖化。
4.根据权利要求I所述的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是所述的步骤B中，利用黑曲霉菌种经斜面菌种驯化培养，摇床驯化筛选，得到黑曲霉P12tl5X21菌种；再经麸曲菌种的放大培养后，制得孢子悬浮液；按麸曲300g/ m3接种量，采用火焰封ロ法将黑曲霉孢子悬浮液接入一级种子罐内进行培养，一级种子培养成熟后，转入ニ级种子罐培养；ニ级种子培养成熟后转入发酵罐发酵，在发酵过程中控制温度、压力、通风量，并通过自动加入离子膜KOH溶液维持PH值为4. 5—6. 0，直至葡萄糖浓度O. 5—0. 8%吋，发酵结束。
5.根据权利要求4所述的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是所述的ー级种子培养按以下条件进行采用火焰封ロ法将黑曲霉孢子悬浮液倒入罐内，控制罐压O.08-0. 1210\罐温 35-38で、通风量 O. 1-0. 2m3/m3· min、搅拌转速 100—115rpm、PH 值自然，当PH值为2. 9—3. I、总含酸量彡O. lg/100ml、种龄7_llh镜检无杂菌、菌丝健壮时转ニ级种子罐。
6.根据权利要求4所述的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是所述的ニ级种子培养按以下条件进行一级种子罐的量为ニ级种子罐的量的10%，保持ニ级罐压力O. 08-0. 12MPa、罐温 35-38 °C、通风量 O. 1-0. 2m3/m3· min、搅拌转速 IOOrpm, PH 值为 2. 9一3.1，当总含酸量> O. lg/100ml、种龄5 — 8h镜检无杂菌、菌丝健壮时转发酵罐。
7.根据权利要求4所述的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是所述的发酵罐发酵按以下条件进行ニ级种子罐的量为发酵罐的量的10%，罐压O. 08-0. 12MPa、罐温35—41°C通风量O. 1-0. 2m3/m3. min、初糖浓度25—32%、搅拌转速80_100rpm、发酵过程中通过流加25—40%离子膜KOH溶液，将发酵过程中产生葡萄糖酸中和成葡萄糖酸钾溶液，控制PH值为4. 5—6. O,发酵周期20— 30h，测残糖O. 5—0. 8%时停止发酵。
8.根据权利要求I所述的黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，其特征是所述的葡萄糖酸钾溶液提纯按以下步骤进行将葡萄糖酸钾溶液利用高温冷凝水加热至70— 80°C，再经板框过滤去杂质；脱色、过滤；在多效蒸发结晶器内蒸发结晶，控制温度60-105°C，真空度-O. 09一 - O. 03 MPa ;分尚、干燥。
全文摘要
本发明公开了一种黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钾的方法，利用淀粉及淀粉质原料采用一次喷射，双酶制糖；利用耐高浓度K+的黑曲霉P1205X21菌种发酵葡萄糖液，发酵过程中流加离子膜KOH溶液制得葡萄糖酸钾溶液；采用多效连续蒸发结晶的热结晶工艺，直接在多效蒸发结晶器内蒸发结晶得到葡萄糖酸钾成品。本发明原料丰富易得，具有成本低，发酵产物单一，产品质量高，易控制，无废水废气产生，无葡萄糖酸钙母液和硫酸钙废物产生，大大减少环境污染；工艺线路短，减少了制取葡萄糖酸钙时的蒸发、结晶、烘干等工序；节约蒸汽、降低电耗，生产成本大幅度降低。
文档编号C12P7/58GK102816802SQ20121031457
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者李贵伶, 崔光水, 徐月美, 张伟 申请人:山东凯翔生物化工有限公司