一种黑曲霉孢子悬浮液的制备方法及黑曲霉孢子的储存方法
【专利摘要】本发明公开了一种黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，其中，该方法包括将黑曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液，所述黑曲霉孢子悬浮液的pH值为1-2.5。本发明还公开了一种黑曲霉孢子的储存方法，其中，该方法包括将黑曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液，所述黑曲霉孢子悬浮液的制备方法为本发明提供的方法。采用本发明的方法，能够有效地降低黑曲霉孢子在储存期间的染菌率，从而能够提高黑曲霉种子液的质量，并提高柠檬酸的发酵水平。
【专利说明】一种黑曲霉孢子悬淳液的制备方法及黑曲霉孢子的储存方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，以及一种黑曲霉孢子的储存方 法。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸安全无毒，是目前世界上产量最大的发酵有机酸。大量应用于化工、医药、 环保、食品等领域，如作为酸味剂、调味剂及防腐剂、保鲜剂、缓冲剂、螯合剂。在化工行业、 化妆品行业及洗涤行业中可作抗氧化剂、增塑剂、洗涤剂。在医药行业中可作抗凝剂。
[0003] 发酵制备柠檬酸的工艺通常为：制备黑曲霉麸曲，再将黑曲霉麸曲接种到种子罐 的种子培养基中进行培养，得到黑曲霉种子液，再将该黑曲霉种子液接种到发酵罐的发酵 培养基中进行发酵，得到柠檬酸发酵液。
[0004] 由于受工艺的限制，通常无法使用新鲜的黑曲霉麸曲制备黑曲霉种子液，而是 先将制备好的黑曲霉麸曲置于一定的环境中进行储存(使用的黑曲霉麸曲一般需要储存 24-48小时)，待使用时再将其取出进行扩大培养制备黑曲霉种子液，并进行后续的柠檬酸 发酵。
[0005] 但现有工艺的缺点是：现有方法制备的黑曲霉麸曲在储存的过程中极易染菌，尤 其是在春夏季节其染菌率更高。而采用染菌的黑曲霉麸曲进行扩大培养，得到的种子液质 量较低，从而影响最终的柠檬酸发酵水平。杂菌过多时，甚至会出现倒罐的现象，将给生产 造成严重的损失。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有方法制备的黑曲霉麸曲在储存过程中易染菌的缺 陷，提供一种在储存过程中染菌率低的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，以及一种黑曲霉孢 子的储存方法。
[0007] 本发明的发明人发现，在柠檬酸发酵过程中，发酵水平较低的原因在于：传统的黑 曲霉麸曲在储存期间易滋生杂菌，将带有杂菌的黑曲霉麸曲接入种子罐中进行种子液的制 备时，杂菌会迅速生长，从而会消耗种子罐内的大量营养物质。在这种带有杂菌生长的环 境下生长的黑曲霉孢子，生长会受到极大的抑制，菌球形态松散，种子液的质量较低。当将 这样的种子液接入发酵罐中进行发酵时，一方面，带入的杂菌同样也会消耗发酵罐中的大 部分营养物质，使得柠檬酸的发酵转化率降低；另一方面，将带有杂菌的种子液接入发酵罐 后，发酵培养基的粘度会升高，使得发酵产酸变慢，从而会延长发酵周期；再一方面，生长状 态较差的黑曲霉种子无法进行高效的产酸，使得发酵的酸度降低。
[0008] 因此，降低黑曲霉麸曲在储存过程中的染菌率是提高柠檬酸发酵水平的关键。本 发明的发明人首先想到的是，一方面，在允许的范围内增加用于制备黑曲霉孢子的原料的 灭菌时间和灭菌温度，以将原料中的杂菌充分致死；另一方面，对用于储存黑曲霉孢子的容 器采用多种方法或多种方法相结合进行灭菌，如，高温蒸汽灭菌、酒精消毒、干热灭菌；再一 方面，保证储存环境的无菌性。但结果却都收效甚微。
[0009] 本发明的发明人意外的发现，将黑曲霉孢子在无菌水中制备成黑曲霉孢子悬浮 液，并以黑曲霉孢子悬浮液的形式进行储存能够在一定程度上降低染菌率，但结果仍不理 想。由于黑曲霉孢子在种子培养基中吸水膨胀萌发的最适PH值为5-7. 5,而无菌水本身的 pH值也在此范围内，因此，为了不对黑曲霉孢子造成损伤，并使得储存的黑曲霉孢子能够较 快的适应种子培养基的环境以及节省操作步骤，故一般不对黑曲霉孢子悬浮液的PH值进 行调节。然而，本发明的发明人却意外的发现，将黑曲霉孢子悬浮液的PH值调节至1-2.5， 在储存过程中不但能够进一步有效地降低染菌率，而且也不会影响黑曲霉孢子的存活率， 低PH值下储存的黑曲霉孢子对黑曲霉种子的培养周期也不会造成影响。因此，将黑曲霉麸 曲制备成黑曲霉孢子悬浮液，并将黑曲霉孢子悬浮液的PH值调节至1-2. 5,能够有效地降 低黑曲霉孢子在储存期间的染菌率，从而能够提高黑曲霉种子液的质量，并提高柠檬酸的 发酵水平。
[0010] 基于以上发现，一方面，本发明提供了一种黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，其中， 该方法包括将黑曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液，所述黑曲霉孢子悬浮液的PH值为 1-2. 5。
[0011] 优选地，所述黑曲霉孢子悬浮液的pH值为2-2. 5。
[0012] 另一方面，本发明还提供了一种黑曲霉孢子的储存方法，其中，该方法包括将黑曲 霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液，所述黑曲霉孢子悬浮液的制备方法为本发明提供的方 法。
[0013] 采用本发明的方法，将黑曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液，将黑曲霉孢子悬浮 液的PH值调节至1-2. 5,优选调节至2-2. 5,并将该黑曲霉孢子以悬浮液的形式进行储存， 不但抑制了多数中性及碱性细菌的生长，而且还能有效抑制酸性细菌的生长，因此，能够有 效地降低黑曲霉孢子在储存期间的染菌率，从而能够提高黑曲霉种子液的质量，并提高柠 檬酸的发酵水平。
[0014] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【具体实施方式】
[0015] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0016] 一方面，本发明提供了一种黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，其中，该方法包括将黑 曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液，所述黑曲霉孢子悬浮液的PH值为1-2. 5。
[0017] 通常在发酵生产上，当发酵受到杂菌污染时，一般会对用于发酵的原料(例如，种 子液、发酵培养基等）及设备(例如，发酵罐等)，甚至发酵的环境等进行逐一并逐级的检查， 直至寻找到杂菌的污染源头。
[0018] 通过采用上述方法发现，在柠檬酸发酵过程中的杂菌污染主要源于黑曲霉麸曲。 主要原因为：由于受现有工艺的限制，在发酵过程中无法使用新鲜的黑曲霉麸曲制备黑曲 霉种子液，而在黑曲霉麸曲储存的过程中，极易污染杂菌。
[0019] 但本发明的发明人发现，发现污染源后，采用通常的处理方法，即对用于制备黑曲 霉麸曲的原料，储存黑曲霉麸曲的容器，以及黑曲霉的储存环境等的灭菌状况进行了严格 的控制，但仍不能有效地抑制杂菌的污染。
[0020] 本发明的发明人意外的发现，将黑曲霉麸曲中的黑曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬 浮液，并以黑曲霉孢子悬浮液的形式进行储存，能够在一定程度上降低储存过程中黑曲霉 孢子的染菌率。本发明的发明人又意外的发现，将黑曲霉孢子悬浮液的PH值调节至1-2. 5， 不但能够进一步有效地降低储存过程中黑曲霉孢子的染菌率，而且不会影响黑曲霉孢子的 存活率，低PH值下储存的黑曲霉孢子对黑曲霉种子的培养周期也不会造成影响。
[0021] 更优选地，所述黑曲霉孢子悬浮液的pH值为2-2. 5。当将黑曲霉孢子悬浮液的pH 值调节至2-2. 5时，储存过程中黑曲霉孢子能够更好的存活，且在制备种子液时，黑曲霉孢 子能更好的适应黑曲霉种子培养基的环境。从而能够进一步提高发酵效率。
[0022] 根据本发明的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，调节pH值的方法可以为本领域常 用的方法，例如用酸性试剂调节；所述酸性试剂可以是本领域常用的各种酸性试剂，只要不 影响黑曲霉孢子的存活就可以，优选地，所述酸性试剂选自柠檬酸、盐酸和硫酸中的一种或 多种。由于该孢子悬浮液之后用于生产柠檬酸，因此，更优选地，所述酸性试剂为柠檬酸。
[0023] 根据本发明的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，将黑曲霉麸曲中的黑曲霉孢子制成 孢子悬浮液的方法可以采用本领域技术人员公知的各种方法，例如，可以直接将黑曲霉麸 曲与无菌水混合、搅拌，使黑曲霉悬孢子悬浮于无菌水中制得孢子悬浮液。
[0024] 根据本发明的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，为了使黑曲霉孢子充分从麸曲中 游离出来，并且能够得到均匀分散的孢子悬浮液。优选地，将黑曲霉在无菌水中进行分散 得到孢子悬浮液的方法还包括：将黑曲霉分散到无菌水中，在300-1000rpm条件下，搅拌 30-60min ;然后在20000-40000频率下，超声处理20-40min。
[0025] 根据本发明，对调节所述黑曲霉孢子悬浮液的pH值的时机没有特别的限制。例 如，可以先调节所述无菌水的PH值，然后再将黑曲霉麸曲与无菌水进行混合制得黑曲霉孢 子悬浮液；或者可以先将黑曲霉麸曲与无菌水进行混合制得黑曲霉孢子悬浮液，再调节所 述黑曲霉孢子悬浮液的PH值。优选的情况下，采用第一种方法制备黑曲霉孢子悬浮液。当 采用第一种方法调节黑曲霉孢子悬浮液的PH值时，为了避免在无菌水中加入黑曲霉麸曲 后会影响最终悬浮液的PH值，可以将所述无菌水的pH值调节至比上述范围稍低的范围，以 保证加入黑曲霉麸曲后所得的黑曲霉孢子悬浮液的PH值在本发明的范围内。本领域技术 人员可以通过在加入黑曲霉麸曲的过程中间隔性的检测悬浮液的PH值，以保证最终所得 黑曲霉孢子悬浮液的PH值在本发明的范围内。
[0026] 另外，本领域技术人员公知，在进行高温蒸汽灭菌时，所灭菌的物质的pH值一般 会下降0. 3-0. 5,因此，本领域技术人员能够根据实际情况对灭菌前无菌水的pH值进行调 节，以保证灭菌并加入黑曲霉麸曲后能够使黑曲霉孢子悬浮液的PH值在本发明的范围内。
[0027] 根据本发明的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，对于所述孢子悬浮液中的黑曲霉的 孢子的含量没有特别的限制，但是为了使黑曲霉孢子更好地分散并为了后续扩大培养时接 种量的需要，优选地，所述孢子悬浮液中黑曲霉孢子的含量为IX 1〇8_7 X IO8个孢子/ml，更 优选I X 108-2 X IO8个孢子/ml。由于在制备黑曲霉孢子悬浮液的过程中，黑曲霉孢子已经 充分从麸曲中游离出，并且游离出黑曲霉孢子后的麸曲由于密度较大会沉于容器的底部， 因此，可以直接取容器上部的黑曲霉孢子悬浮液进行黑曲霉孢子的计数。
[0028] 需要注意的是，尽管将黑曲霉孢子悬浮液的pH值调节至本发明的范围内，既能够 有效地降低在储存过程中孢子悬浮液的染菌率。但为了进一步降低染菌的可能性，优选，制 备孢子悬浮液的整个过程在无菌条件下进行。
[0029] 第二方面，本发明提供了一种黑曲霉孢子的储存方法，其中，该方法包括将黑曲霉 孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液，所述黑曲霉孢子悬浮液的制备方法为本发明提供的方法。
[0030] 由于本发明的发明点在于所述黑曲霉孢子悬浮液的制备，因此，对所述黑曲霉孢 子悬浮液进行储存的条件可以为常规的用于储存黑曲霉孢子的条件。例如，储存的温度可 以为 4-25 °C。
[0031] 由于采用了本发明的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，并将黑曲霉孢子以黑曲霉孢 子悬浮液的形式进行储存，能够有效地降低在储存过程中的染菌率，因此，所述黑曲霉孢子 悬浮液的储存时间要远长于采用现有技术制备的黑曲霉麸曲的储存时间。例如，采用本发 明的方法制备的黑曲霉孢子在储存72小时时仍没有观察到明显的染菌，而现有技术制备 的黑曲霉麸曲在储存24小时时就已经出现了严重的染菌。
[0032] 优选地，存储的环境为无菌环境。所述无菌环境的形成可以按照本领域常规的方 法形成，例如，可以采用紫外灯照射储存环境后，再将所述黑曲霉孢子悬浮液置于此环境中 进行储存。严格的无菌环境是指储存环境经过严格的灭菌处理，处理的方法为本领域技术 人员所公知，例如，可以通过紫外线照射和喷洒消毒液相结合的方法。
[0033] 根据本发明的黑曲霉孢子的储存方法，在对所述黑曲霉孢子悬浮液进行储存的过 程中，需要每隔一段时间对所述黑曲霉孢子悬浮液进行取样，以检测其染菌状况。所述检测 的方法可以采用本领域常规的用于检测是否染有杂菌的方法，例如，采用镜检的方法。所述 镜检的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。对于取样的时间间隔可以根据实际 需要进行调整，例如，可以为10-20小时。
[0034] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0035] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0036] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
[0037] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中用于镜检所述黑曲霉孢 子悬浮液的显微镜型号X-18-202双目。
[0038] 发酵转化率：转化率（％) =发酵液的浓度(简称酸度）X发酵液的体积/总糖的重 量X 100%，其中，总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量，总糖的测定根据GB/ T5009. 7-2003标准中的酸法总糖检测方法进行检测。酸度根据GB1987-2007标准进行检 测。
[0039] 发酵粮耗指单位质量的柠檬酸所消耗的玉米原料的质量。
[0040] 还原糖的浓度采用菲林试剂法进行测定。
[0041] 染菌率为单位体积内的所述黑曲霉孢子悬浮液中杂菌的个数。
[0042] 实施例I
[0043] 本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法和黑曲霉孢子的 储存方法。
[0044] (1)在IOOOmL三角瓶中装入600mL去离子水，使用柠檬酸调节其pH值为2. 4,将 调节PH值后的去离子水、接种钢瓶进行高温蒸汽灭菌，灭菌的压力为0. 15Mpa，灭菌的温度 为121°C，灭菌60min。制得pH值为2.0的无菌水，以及无菌接种钢瓶。自然冷却后备用。
[0045] (2)在无菌的条件下，将300ml步骤（1)中备用的无菌水倒入麸曲三角瓶中（含有 麸曲20g，用于制备麸曲的麸皮在0. 13Mpa，121°C条件下，灭菌60min)，并在800rpm条件下， 搅拌45min ;然后在30000频率下，超声处理30min，得到分散均匀的孢子悬浮液，所述孢子 悬浮液的PH值为2. 5。取上层孢子悬浮液进行黑曲霉孢子计数，孢子浓度为2. OX IO8个孢 子/ml悬浮液。
[0046] (3)在无菌的条件下，将步骤（2)中得到的孢子悬浮液倒入步骤（1)中备用的无菌 钢瓶中。于20°C下在无菌环境中储存所述孢子悬浮液。以将孢子悬浮液倒入无菌钢瓶中的 时刻记为0小时，并每隔12小时取样镜检所述悬浮液的染菌状况，计算染菌率。检测至72 小时。结果见表1。
[0047] 实施例2
[0048] 本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法和黑曲霉孢子的 储存方法。
[0049] (1)在IOOOmL三角瓶中装入600mL去离子水，使用柠檬酸调节其pH值为2. 1。将 调节PH值后的去离子水、接种钢瓶进行高温蒸汽灭菌，灭菌的压力为0. 15Mpa，灭菌的温度 为121°C，灭菌60min。制得pH值为1.8的无菌水，以及无菌接种钢瓶。自然冷却后备用。
[0050] (2)在无菌的条件下，将300ml步骤（1)中备用的无菌水倒入麸曲三角瓶中（含有 麸曲20g，用于制备麸曲的麸皮在0. 13Mpa，121°C条件下，灭菌60min)，并在300rpm条件下， 搅拌60min ;然后在40000频率下，超声处理20min，得到分散均匀的孢子悬浮液，所述孢子 悬浮液的PH值为2. 0。取上层孢子悬浮液进行黑曲霉孢子计数，孢子浓度为I. 5 X IO8个孢 子/ml悬浮液。
[0051] (3)在无菌的条件下，将步骤（2)中得到的孢子悬浮液倒入步骤（1)中备用的无菌 钢瓶中。于20°C下在无菌环境中储存所述孢子悬浮液。以将孢子悬浮液倒入无菌钢瓶中的 时刻记为0小时，并每隔12小时取样镜检所述悬浮液的染菌状况，计算染菌率。检测至储 存后的72小时。结果见表1。
[0052] 实施例3
[0053] 本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法和黑曲霉孢子的 储存方法。
[0054] (1)在IOOOmL三角瓶中装入600mL去离子水，使用柠檬酸调节其pH值为2. 3。将 调节PH值后的去离子水、接种钢瓶进行高温蒸汽灭菌，灭菌的压力为0. 15Mpa，灭菌的温度 为121°C，灭菌60min。制得pH值为1.9的无菌水，以及无菌接种钢瓶。自然冷却后备用。
[0055] (2)在无菌的条件下，将300ml步骤（1)备用中的无菌水倒入麸曲三角瓶中（含有 麸曲20g，用于制备麸曲的麸皮在0. 13Mpa，121°C条件下，灭菌60min)，并在IOOOrpm条件 下，搅拌30min ;然后在20000频率下，超声处理40min，得到分散均匀的孢子悬浮液，所述孢 子悬浮液的pH值为2. 2。取上层孢子悬浮液进行黑曲霉孢子计数，孢子浓度为I. O X IO8个 孢子/ml悬浮液。
[0056] (3)在无菌的条件下，将步骤（2)中得到的孢子悬浮液倒入步骤（1)中备用的无菌 钢瓶中。于20°C下在无菌环境中储存所述孢子悬浮液。以将孢子悬浮液倒入无菌钢瓶中的 时刻记为〇小时，并每隔12小时取样镜检所述悬浮液的染菌状况，计算染菌率。检测至储 存后的72小时。结果见表1。
[0057] 实施例4
[0058] 本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法和黑曲霉孢子的 储存方法。
[0059] 按照实施例1的方法进行黑曲霉孢子悬浮液的制备和储存。不同的是，步骤（1) 中，将灭菌前将去离子水的PH值调节至1. 3,使得最终制备的黑曲霉孢子悬浮液的pH值为 1。与实施例1相同的储存时间下镜检所述悬浮液的染菌状况。计算染菌率。结果见表1。
[0060] 对比例1
[0061] 本对比例用于说明参比的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法和黑曲霉孢子的储存方 法。
[0062] 按照实施例1的方法进行黑曲霉孢子悬浮液的制备和储存。不同的是，步骤（1) 中，将灭菌前将去离子水的PH值调节至3. 5,使得最终制备的黑曲霉孢子悬浮液的pH值为 3。与实施例1相同的储存时间下镜检所述悬浮液的染菌状况。计算染菌率。结果见表1。
[0063] 对比例2
[0064] 本对比例用于说明参比方法提供的黑曲霉孢子悬浮液的制备方法和黑曲霉孢子 的储存方法。
[0065] 按照实施例1的方法进行黑曲霉孢子悬浮液的制备和储存。不同的是，步骤（1) 中，不调节所述去离子水的PH值（pH值为7. 0左右)。与实施例1相同的储存时间下镜检 所述悬浮液的染菌状况。计算染菌率。结果见表1。
[0066] 对比例3
[0067] 本对比例用于说明现有技术提供的黑曲霉麸曲的储存方法。
[0068] 按照实施例1的方法进行黑曲霉孢子的储存。不同的是，黑曲霉孢子以黑曲霉麸 曲的形式进行储存，而不制备成黑曲霉孢子悬浮液。其中，用于制备麸曲的麸皮以及接种钢 瓶在0. 15Mpa，123°C条件下，灭菌90min，并将置于接种钢瓶中的麸曲在严格的无菌环境中 进行储存。与实施例1相同的储存时间下取黑曲霉麸曲，并使用无菌水制备成孢子悬浮液 镜检所述麸曲的染菌状况。计算染菌率。结果见表1。
[0069] 表 1
[0070]
【权利要求】
1. 一种黑曲霉孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，该方法包括将黑曲霉孢子制备成 黑曲霉孢子悬浮液，所述黑曲霉孢子悬浮液的pH值为1-2. 5。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述黑曲霉孢子悬浮液的pH值为2-2. 5。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述黑曲霉孢子以黑曲霉麸曲的形式存在， 将黑曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液的方法包括：将黑曲霉麸曲中的黑曲霉孢子分散于 无菌水中，得到黑曲霉孢子悬浮液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，将黑曲霉孢子分散于无菌水中的方法包括，将黑 曲霉麸曲与无菌水混合，并在300-1000rpm的条件下，搅拌30-60min ;然后在20000-40000 的频率下，超声处理20-40min。
5. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述黑曲霉孢子悬浮液中黑曲霉孢子的含量为 1 X 108-7X 108 个孢子 /ml。
6. -种黑曲霉孢子的储存方法，该方法包括将黑曲霉孢子制备成黑曲霉孢子悬浮液， 其特征在于，所述黑曲霉孢子悬浮液的制备方法为权利要求1-5中任意一项所述的方法。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述储存的条件包括：储存的温度为4-25°C。
【文档编号】C12N1/14GK104277977SQ201310273323
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月1日 优先权日:2013年7月1日
【发明者】熊结青, 卢宗梅, 钟华, 刘梦涵 申请人:中粮生物化学（安徽）股份有限公司