专利名称：运动机能基因actn3荧光检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种运动机能基因ACTN3荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是历史必然、大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。
研究发现，ACTN3基因确与肌肉爆发力相关，能在早期对运动员的爆发力发展有准确的预测。将ACTN3基因技术应用在运动员选材领域，不仅能够提高选材的准确率，还能大大减少优秀运动员的培养成本，更重要的是实现早期训练项目定位，即能有效地提高成材率。ACTN(a_辅肌动蛋白)是肌动蛋白的结合蛋白，主要分布于肌纤维Z线附近(类似致密体)帮助定位肌原纤维肌动蛋白微丝。ACTN有ACTN1、2、3、4种存在形式，人类只有ACTN2和ACTN3。ACTN2存在于骨骼肌和心肌中，ACTN3仅存在于骨骼肌快肌纤维中。已证实，ACTN3基因16号外显子的1747核苷酸发生C — T突变而产生终止密码子，取代577R氨基酸残基的精氨酸，形成577X，使得ACTN3蛋白缺失，影响肌肉拉伸速度，降低爆发力，约16%的人存在此多态。ACTN3T等位基因阻止该蛋白质的完全制造。有两个T等位基因的人将不能在他们的快缩肌纤维中制造α肌动蛋白3，因而在爆发力方面处于劣势，那些CT基因型因为有一个功能性的基因，因而还能制造α肌动蛋白3。而CC基因型则由于拥有两个ACTN3基因而拥有其他人无法比拟的基因条件。ACTN3基因多态性与爆发力素质有相关性，CC纯合型速度素质优于CT、TT型，研究者认为577R可以作为爆发力相关项目运动员的基因选材指标。目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing, DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)> 变性高效液相色谱分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带不同荧光标记物的引物对运动机能相关基因ACTN3特异性的扩增，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对该运动机能相关基因位点的检测，灵敏度高、判读清晰准确、采样方便。
发明内容
本发明的目的是提供一种运动机能基因ACTN3荧光检测试剂盒及检测方法。本发明所述的检测运动机能相关基因ACTN3荧光检测试剂盒，包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括内标和用于基因分型的基因分型标准物；使用所述的试剂盒进行PCR扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为8. 0-9. 0，镁离子浓度为I. 5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300 μ Μ, Taq酶的用量为O. 1-0. 4U/μ L，引物终浓度为O. 2-0. 4 μ M0用于ACTN3基因检测的引物为SEQ NO. I :5’ -TTT CTG TTG CCT GTG GTAAGT GG-3’ ；
SEQ NO. 2 :5’ -GTTAGAT GGC ACC TCG CTC TCA-3’SEQ NO. 3 :5，-GAT GGC ACC TCG CTC TCG-3’ ；所述的引物中SEQ NO. I的5’端进行荧光染料标记，内标所用的荧光染料为不同
的荧光素。所述扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。采用所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，是通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因ACTN3 ;用于ACTN3检测的引物为SEQ NO. I、SEQNO. 2、SEQ NO. 3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液。使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序:94-980C l-5min ;26_32 个循环的 94-98°C 15-60s, 55-65 °C 15-60s,72°C 15_60s ；60 °C 30-60min。本发明的有益效果如下本发明以ACTN3基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，大大节约了人力物力和时间。
图I是本发明试剂盒对71-2号样本ACTN3基因个体DNA扩增后的分型结果图；图2是本发明试剂盒对73-4号样本ACTN3基因个体DNA扩增后的分型结果图；图3是本发明试剂盒对87号样本ACTN3基因个体DNA扩增后的分型结果图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步描述。实施例I本发明的试剂盒检测40个不同个体的DNA样本。用于运动机能相关基因检测的引物采用蓝色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。I、待测样本40份，下文列举的是不同基因型个体3份的结果。相关样本都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对ACTN3进行过测序检测。其中，71_2号、73_4号、87号样本的分型结果依次为C/T、T/T、C/C。2、检材的基因组DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL离心管中，加入SdH2O ImL,振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5%Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 μ L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min,上清中为提取的DNA。3、扩增和扩增产物的检测分析3. IPCR 扩增体系
组分体积(μι) 组分说明
Reaction Mix 10含 pH 为 8.3 的 2.5xPCR 缓冲液、
7.5 πιΜ 的 MgCl2 >750 μΜ dNTP ___Mix_Taq 酶
(5υ/μΡ_____
Primers5本发明的引物对(0.2uM)
模板^ 0.2-5.0ng
orfTT π补足至
SdH2O
__25.0μ^__3. 2PCR 扩增程序
初始热循环终延 变性___1Ψ_95V30 个循环:60V—
5mill98°C 30s, 59°C 30s, 72°C 60min
_[30s__4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔(0.2yL分子量内标)X (进样数)+(9. SyL去离子甲酰胺)X (进样数)〕。将IOyL上样混合物与I μ L扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95°C变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。5、结论本发明分型完整清晰，结果如图1-3所示图I :71-2号样本ACTN3基因分型位置出现127bp峰值约1200H、131bp峰值约1450H的双峰，检为C/T杂合，与测序结果一致。图2 73-4号样本ACTN3基因分型位置出现131bp峰值约2100H的单峰，检为T/T
纯合，与测序结果一致。图3 87号样本ACTN3基因分型位置出现127bp峰值约2600H的单峰，检为C/C纯合，与测序结果一致，提示该个体具有较好的爆发力。
以上实施例中所用的不同pH的2. 5XPCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配制，I XPCR缓冲液中 的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM ;本发明中所用的Taq聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。
权利要求
1.一种运动机能基因ACTN3荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增基因的引物、内标及基因分型标准物。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于 用于ACTN3基因检测的引物为SEQ NO. I :5’ -TTT CTG TTG CCT GTG GTAAGT GG-3’SEQ NO. 2 :5’ -GTTAGAT GGC ACC TCG CTC TCA-3’SEQ NO. 3 :5’ -GAT GGC ACC TCG CTC TCG-3’。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述的用于ACTN3基因扩增的引物，其中，引物SEQ NO. I的5’端进行荧光染料标记，内标选用不同于上述的荧光染料标记。
4.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述ACTN3基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
5.一种采用权利要求I所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因ACTN3 ;用于ACTN3检测的引物为SEQ NO. USEQ NO. 2,SEQ NO. 3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种检测运动机能相关基因ACTN3荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增ACTN3基因热点突变的引物混合物；所述扩增后试剂包括基因分型标准物和内标。本发明以上述基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，大大节约了人力物力和时间。
文档编号C12Q1/68GK102796822SQ20121031683
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者步迅, 夏子芳 申请人:山东百福基因科技有限公司, 步迅, 夏子芳