专利名称：基于rna与dna含量比的微囊藻生长速率实测方法
技术领域：
本发明涉及藻类生长速率的测定方法，具体涉及一种基于RNA与DNA含量比的微囊藻生长速率实测方法。
背景技术：
微囊藻水华造成一系列的生态及环境问题。微囊藻水华是微囊藻细胞生长和聚集综合的作用，微囊藻原位生长速率测定对微囊藻水华爆发机理的研究以及水华的预报和防治有着重要的作用。由于微囊藻水平及垂向迁移，造成微囊藻原位生长速率无法通过藻细胞密度直接计算获得。国际上一些研究者建立了一系列的方法和模型，诸如原位围隔水柱法、FDC法、同位素法等。但围隔水柱本身改变了原位的水流、化学及光照等条件，再加上浮游动物捕食、深水湖泊中围隔建立比较困难等原因，造成此方法很难得以实施用来测定真 实的生长速率。FDC法需要连续24小时采样观测，工作量巨大，而且采集的样品本身也受微囊藻迁移的影响。同位素法测定复杂而且昂贵，因而无法普遍使用。建立一种快速，能够通过简单测试就能够获得微囊藻原位生长速率的方法在微囊藻水华爆发机理的研究以及水华的预报和防治中都极为重要的。微囊藻细胞分裂与DNA的复制是高度统一的，但是仅有当微囊藻细胞中蛋白质等构成细胞的基本有机物质达到一定量时才能够进行DNA的复制从而实现细胞分裂。控制蛋白质的合成的主要物质是RNA，RNA越多，蛋白质合成越快，细胞分裂越快，反之亦然。在微囊藻生长的过程中，RNA的含量能够反映微囊藻细胞中蛋白质合成的快慢，从而表征微囊藻的生长速率，微囊藻生长率和RNA含量存在一定的相关关系。由于实际湖泊中的微囊藻经常出现细胞大小的差异，为了消除细胞大小的差异造成利用RNA绝对含量测定微囊藻生长率时出现的误差，导入单位生物量中RNA含量一RNA相对含量，这一概念应该能够更为准确地测定生长率。DNA是藻细胞遗传物质的基础，细胞中DNA的含量和细胞的大小直接相关并且环境因子对其含量的影响很小，因此可以用RNA与DNA含量比表征RNA的相对含量，通过其与微囊藻生长速率的关系计算微囊藻的原位生长速率。
发明内容
本发明的目的是建立一种简易、快速的准确测定微囊藻原位生长速率的方法，在实际湖泊中进行一次采样，在室内通过简单的检测藻细胞中RNA和DNA含量，利用RNA与DNA含量比的值可以获得较为准确的实际湖泊中微囊藻的原位生长速率。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种基于RNA与DNA含量比的微囊藻生长速率实测方法，其特征在于包括如下步骤
1)、采集微囊藻样品；
2)、提取并测定微囊藻细胞中的RNA与DNA的含量；
3)、计算步骤2)中RNA与DNA含量的比值，x为RNA与DNA的含量比，代入标准曲线y=a*ln(x)-b中，得到微囊藻原位生长速率y,其中a=0. 720, b=l. 540。
步骤3)中标准曲线是采用如下方法绘制的测定t、t+1时刻微囊藻细胞密度Ct、ct+1，根据公式yt+1=ln(Ct+1/Ct)得到藻密度生长率μ t+1 ；
同时提取并测定微囊藻细胞中的RNA与DNA的含量CKNA、Cdna,计算每组CKNA/CDNA的值；以μ t+i作为纵坐标，CfflA/CDNA为横坐标，拟合得到标准曲线y=a*ln (x) -b,其中a=0. 720，b=l. 5400步骤I)中采集的微囊藻样品首先通过显微镜，将非微囊藻颗粒物或其他藻类挑出，获得较纯的微囊藻藻液，然后用玻璃纤维膜过滤获得藻样。步骤2)中微囊藻细胞中的RNA与DNA采取相同的提取方法，提取过程为取藻样到离心管内，用高速冷冻离心机，离心，弃掉上清液，往离心管中加入高氯酸，8(TlO(TC恒温水浴下保存2(T40min，冷却至常温后在离心机1400(Tl8000 r/min的转速下运行l(T20min，第一次取得上清液保存；在离心管内藻团中继续加入高氯酸，同上处理，再次取 得上清液，与第一次的上清液相混合，在混合液中加入浓度为8 12%的三氯乙酸，留作步骤3)测定RNA和DNA的含量。微囊藻细胞中的RNA含量测定采用地衣酚-盐酸显色法，DNA含量的测定采用二苯胺法。本发明提供的一种基于RNA与DNA含量比的微囊藻生长速率实测方法与现有技术相比，具有如下优势
1)、现场采样简易，一次采集，不需要一整天连续取样；
2)、室内分析方法简单、快速；
3)、反映微囊藻生长和衰减两方面的结果。测定出来的生长率有负值，负值能够体现衰减，一般的生长率测定方法只能测定出正值，不能反映衰减。
图I :标准曲线。
具体实施例方式
实施例I、DNA与RNA的提取及检测
取藻样15ml到50mL离心管内，用高速冷冻离心机,16000r/min离心15分钟,弃掉上清液，往离心管中加入10%的高氯酸7ml，90°C恒温水浴下保存30min，冷却至常温后在离心机16000 r/min的转速下运行15min,第一次取得上清液保存；在离心管内藻团中继续加入10%的高氯酸4. 5ml，处理方法同上，后再次取得上清液，与第一次的上清液相混合，在混合液中加入ImL浓度为10%三氯乙酸，留作试样分析。DNA与RNA分别采用二苯胺法(赵学勤，焦成久，苏学良，张镜宇，任秉煌.细胞中DNA含量测定I.改进的二苯胺法.天津医药.1991. 562-564.)和地衣酚+盐酸显色法(朱哲保，高盛科，潘红春.地衣酚法测定RNA的条件试验.四川轻化工学院学报.1994. 7: 8-11.)进行检测。实施例2 :标准曲线绘制
BG-Il培养基和M-Il培养基配方参照文献胡小贞，马祖友，易文利，葛新华，郑朔方.4种不同培养基下铜绿微囊藻和四尾栅藻生长比较.环境科学研究.2004. 17s:55-57.配制。分别用BG-Il培养基和M-Il培养基在2L锥形瓶中培养铜绿微囊藻，接种密度5X IO4Cells · mL—1，培养温度25°C，光照35001ux，光暗比12 :12小时。每天测定微囊藻细胞密度，直到微囊藻进入衰亡期，通过每天获得的藻密度计算生长率，计算公式为μ t+1=ln(Ct+1/Ct),同时每天取10_80mL藻液(根据藻密度大小而定，确保藻细胞含量在4 X IO8个左右)，提取DNA和RNA并检测。DNA与RNA的提取及检测见实施例I。以μ t+1作为纵坐标，RNAt/DNAt为横坐标,拟合,绘制对应曲线,如图I所示,获得生长率计算的标准曲线 y=a*ln(x)_b 中，其中 a=0. 720, b=l. 540, x=CKNA/CDNA。实施例3 :测定太湖中微囊藻的原位生长速率
在太湖中，用63 μ m浮游植物网采集浮游植物样品，装于500mL塑料瓶中，立即用3%的福尔马林溶液固定后冷藏带回实验室进行分析。野外采集的样品首先通过显微镜，将非微囊藻颗粒物或其他藻类挑出，获得较纯的微囊藻藻液，用玻璃纤维膜过滤获得藻样放入50mL离心管，然后通过实施例I中所描述的DNA与RNA的提取及检测进行处理，测定RNA和DNA的含量，获得RNA与DNA的比值，带入到计算公式y=0. 7201η (χ)-I. 540，进行湖泊中微囊藻原位生长速率的计算。表I为此方法与水柱法测定微囊藻原位生长速率的比较，尽管 水柱法测定工作量很大，但水柱法测定结果能够很好地反映真实生长率，从表I中可以看出，本法测定结果与水柱法测定结果基本吻合，其中28日测定结果偏差不到4%，可见此法能够反映微囊藻生长的实际情况。表2为太湖实际湖泊中秋季某天微囊藻原位生长速率测定结果，通过计算获得结果为-O. 125 O. 159/天。表I:
Irna/dna法 I水柱法- 9 月 27 日-—O. 219—O. 183 '
9 月 28 曰 1-0. 600 1-0. 578 '
表2
Β点号 \DNA(u g/mL) \RNA(ug/mL) \RNA/DNA(/^ )
07398_ 3.510 一 8.830 0.094 一
2[458.14.048 —9.639 O. 159 —
307928.7.370 —7.947 0.015 —
4[385_ 15. 738 —6.599 -0.125 —
5[120~19.481 —9.189 O. 124 —
6[988.13.183 —6.633 —0.121 一
7T7q60.8.213 —7. 748 -0.004 —
807928~6.406 一 6.907 -0.091 一
907398.3.622 —9.112 O. 117 —
1007662.4.398 —6.638 —0.120 —
1107530_ 3.603 一 6. 799 -0.102 一
12|l. 855|l2. 836丨6· 920 |-O. 089
权利要求
1.一种基于RNA与DNA含量比的微囊藻生长速率实测方法，其特征在于包括如下步骤 1)、采集微囊藻样品； 2)、提取并测定微囊藻细胞中的RNA与DNA的含量； 3)、计算步骤2)中RNA与DNA含量的比值，x为RNA与DNA的含量比，代入标准曲线y=a*ln(x)-b中，得到微囊藻原位生长速率y,其中a=0. 720, b=l. 540。
2.根据权利要求I所述的基于RNA与DNA含量比的微囊藻生长速率实测方法，其特征在于步骤3)中标准曲线是采用如下方法绘制的测定t、t+l时刻微囊藻细胞密度Ct、Ct+1，根据公式μ t+1=ln(Ct+1/Ct)得到藻密度生长率μ t+1 ;同时提取并测定微囊藻细胞中的RNA与DNA的含量CKNA、CDNA，计算每组CKNA/CDNA的值；以μ t+1作为纵坐标，CENA/CDNA为横坐标，拟合得到标准曲线 y=a*ln(X)_b,其中 a=0. 720, b=l. 540。
全文摘要
一种基于RNA与DNA含量比的微囊藻生长速率实测方法，采集微囊藻样品；提取并测定微囊藻细胞中RNA与DNA的含量；将RNA和DNA的含量比值，代入公式y=a×ln(x)-b中，其中a为0.720，b为1.540，x=CRNA/CDNA，计算的结果y即为微囊藻原位生长速率。本方法的优点在于现场采样简易，不需要一整天连续取样，而且室内分析方法简单、快速，能够快速准确地测出微囊藻的生长速率，并反映微囊藻生长和衰减两方面的结果。
文档编号C12Q1/02GK102808035SQ201210316508
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者朱伟, 李明, 肖曼, 罗永刚, 代晓炫, 郭丽丽 申请人:河海大学