专利名称：小鼠胎肝细胞pl08及其建立方法和在红细胞前体细胞培养与增殖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用一种新细胞系，特别是小鼠胎肝细胞PL08[保藏日期2012年8月3日、保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、保藏编号C201297]及其建立方法和应用。
背景技术：
红细胞前体细胞(erythroid progenitors)由造血干细胞分化而来,可以继续分化为成熟的红细胞。红细胞前体细胞在应急性输血和治疗贫血症等临床应用上有广泛需求。人类的红细胞前体细胞(或称为有核红细胞)，其主要表面标记分子为GPA和⑶71。目前，脐带血红细胞前体细胞的体外培养仍然十分困难。找到有效的方法在体外扩增和培养脐带血红细胞前体细胞是当前该领域研究的一个热点。
发明内容
本发明的目的为提供一种新的小鼠胎肝细胞系PL08及其建立方法，以及该细胞系在体外培养和增殖脐带血红细胞前体细胞。技术方案为使用PL08细胞系作为基质细胞，与脐带血红细胞前体细胞共培养。PL08细胞系是发明人建立的一株小鼠胎肝细胞系。其建立的过程如下取C57/BL6小鼠第11天的胎肝，用带有27G针头的无菌注射器反复吹打，以使组织解离，分散为单个细胞。用红细胞裂解液去除红细胞后，将细胞培养在O. I %明胶包被过的细胞培养板上，培养基成分为aMEM培养基，添加15 %的胎牛血清。经过4到5天的培养，去除上清，将贴壁细胞用O. 05%的胰酶消化下来，常规方法扩大培养、传代，每次传代过程中保留30%的原培养液，添加70%的新鲜培养液。在本实验室，PL08细胞系已经稳定传代60代以上，培养时间超过I年，细胞大小均一，生长速度稳定。PL08细胞系为亚三倍体核型，染色体条数为58-62条(见图I)。该细胞系在添加10%胎牛血清的aMEM培养基中生长良好，接种后I至2天的细胞群体倍增时间为22. 4小时，最适生长温度为37摄氏度，最适生长PH值为7. 2。经实验证实，PL08细胞系可以很好的支持脐带血红细胞前体细胞的生长，在体外培养红细胞前体细胞的研究中有巨大的应用价值。
图I为该细胞系124代核型分析图像。图2是培养细胞显微图像。图3是脐带血红细胞前体细胞在普通培养条件下和与PL08共培养条件下，在不同的培养时间段做流式细胞分析的结果。图4是脐带血红细胞前体细胞在普通培养条件下和与PL08共培养条件下培养12天，细胞形态比较结果。小鼠胎肝细胞PL08保藏日期2012年8月3日；保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC);保藏编号C201297。
具体实施例方式下述实施例中，所用试剂材料及其来源包括PL08细胞系由李鹏博士构建。脐带血由广州脐带血干细胞库提供。流式抗体GPA/CD71为eBioscience产品。StemSpan无血清培养基为STEMCELL公司产品。细胞因子 human Insulin-like growth factor(hIGF)、Human Erythropoietin(hEPO)、humanstem cell factor (hSCF)、human interleukin 3 (hIL3)为 PeproTech 公司产品。Lipids和Dexametasone为Sigma-Aldrich公司产品。细胞培养板为Corning Costar公司产品。 Lymphoprep淋巴细胞分离液为Axis-shield公司产品。实施例1PL08作为基质细胞在红细胞前体细胞体外培养中的应用脐带血解冻后，重悬于20ml PBS缓冲液中。使用Lymphoprep淋巴细胞分离液分离白细胞，随后对分离到的细胞进行计数。得到的细胞分两组培养第一组作为对照组，培养在stemspan培养基中，添加的细胞因子及浓度如下lipids (40ug/ml),Dexametasone (Ium)，hEPO (20ng/ml)，hSCF (100ng/ml)，hlGFl (40ng/ml)，hlL3 (lOng/ml)。第二组作为实验组，与PL08基质细胞共培养，培养基及细胞因子成分与第一组相同。如图3流式细胞数据所示，实验组在培养12天，18天时仍有大量的红细胞前体细胞，而对照组的在第12天就已经全部分化，具体表现为不能通过流式细胞技术检测到GPA+/⑶71+细胞。如图4，对照组细胞(图4A)大量死亡，试验组细胞(图4B)生长良好，显示PL08细胞系对红细胞前体细胞生长的良好支持作用。
权利要求
1.小鼠胎肝细胞PL08CCTCC No.C201297。
2.小鼠胎肝细胞PL08的建立方法 a.取C57/BL6小鼠第11天的胎肝，用带有27G针头的无菌注射器反复吹打，以使组织解离，分散为单个细胞； b.用红细胞裂解液去除红细胞后，将细胞培养在0.I %明胶包被过的细胞培养板上，培养基成分为aMEM培养基，添加10% -15%的胎牛血清； c.经过4到5天的培养，去除上清，将贴壁细胞用0.05%的胰酶消化下来，常规方法扩大培养、传代，每次传代过程中保留30%的原培养液，添加70%的新鲜培养液。
3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于细胞培养、传代的温度为37摄氏度，PH值为7. 2。
4.小鼠胎肝细胞PL08在脐带血红细胞前体细胞体外培养中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于在体外培养和增殖脐带血红细胞前体细胞。
全文摘要
本发明公开了一种新的小鼠胎肝细胞系PL08(CCTCC NO:C201297)在红细胞前体细胞体外培养与增殖中的应用。该细胞系作为基质细胞，能很好地支持脐带血红细胞前体细胞的体外培养与增殖，为临床脐带血红细胞前体细胞提供更丰富的细胞资源。
文档编号C12N5/073GK102965334SQ20121031658
公开日2013年3月13日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者李鹏, 刘志新 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院