一种小鼠胰岛细胞的分离纯化方法

文档序号:416050阅读:884来源:国知局
专利名称:一种小鼠胰岛细胞的分离纯化方法
技术领域
本发明属于细胞分离技术领域,特别涉及一种小鼠胰岛细胞的分离方法。
背景技术
糖尿病已成为威胁人类健康的第三大杀手,糖尿病病人的高血糖状态,有利于细菌在体内生长繁殖,同时也抑制了白细胞吞噬细菌的能力,使病人的抗感染能力下降。常见的有泌尿道感染、呼吸道感染、皮肤感染、神经细胞、神经纤维易产生病变等。糖尿病人发生冠心病的机会是非糖尿病病人的2 3倍,视网膜病变也是糖尿病人的常见病。目前在国内9000多万的糖尿病患者中,I型糖尿病的患者占到了约5%左右,而胰岛细胞移植是治疗I型糖尿病最有效的途径之一。 小鼠具有品系纯正、可重复性好、繁殖力强、科研周期短和可进行基因调控等诸多优点,已广泛应用于胰岛移植和糖尿病研究领域。但小鼠由于体积小,胰岛结构细微,这对小鼠胰岛细胞团分离操作造成一定的难度。传统的小鼠胰岛分离方法主要包括三步用胶原酶充盈小鼠胰腺,胰腺消化和胰岛纯化。其中最为关键的步骤在于胰腺是否可以被胶原酶充盈,充盈的程度决定了所分离胰岛的数量和质量。但是,在实际的分离过程中,某些小鼠模型或者小鼠胰腺胰管解剖结构变异的情况下,传统的分离方法无法正常分离胰岛。1976年Lacy团队第一次提出一种基于胶原酶的胰岛分离方法,此方法的提出极大的推动了胰岛相关的体内体外实验研究的开展。在这种方法中,胰腺从麻醉的动物上取下并剪成碎片,这样做可以增加组织的表面积,使胶原酶更加充分的发挥消化作用。接下来,剪成碎片的胰腺组织放入胶原酶溶液中进行消化,同时不断的搅拌和摇晃加速消化过程。后来的Gotoh对此方法进行了改良(称为CBD法):胶原酶通过胆总管注射至胰腺,然后将充盈好的胰腺放至37°C中静置消化,而不需要将胰腺剪成碎块。显然,从胰岛的质量和数量角度考虑,Gotoh改良后的方法更加有效。但是,对于胰管走形变异的小鼠、幼鼠、高脂喂养的小鼠、胰腺炎及胰岛新生小鼠模型无法使用CBD法进行胰岛分离。

发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠胰岛细胞的分离方法,该方法丰富了小鼠胰岛细胞分离的可选技术,提高了分率成功率,也更好地遵从了动物福利原则。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其步骤包括(I)胰腺充盈将小鼠麻醉、皮肤消毒后沿腹正中切开,充分暴露胰腺;剪断与脾部胰腺相连接的韧带组织,将脾静脉和脾交界处夹闭并剪破心脏,在脾静脉与门静脉交汇处进针至脾静脉,注射胶原酶充盈液;将充盈好的脾部胰腺从腹腔中游离下来后浸溃在胶原酶溶液中;(2)胰腺消化将步骤(I)中得到的胰腺胶原酶溶液水浴消化,并加入Hank’ s液后离心分离,取沉降物。
(3)分离纯化在步骤(2)中得到的沉降物经过重悬沉淀、过滤、离心处理后得到小鼠膜岛细胞。所述步骤(I)中,将小鼠麻醉所注射的麻药剂量与小鼠体重比为45-60mg :1kg。所述步骤(I)的胶原酶充盈液为含有XI型胶原酶的hank’s液,其中XI型胶原酶浓度为 O. 4-0. 5mg/mL。所述步骤(I)中的胶原酶充盈液注射量为l-2mL。所述步骤(2)中水浴温度为37°C -37. 5°C。所述步骤(2)中胶原酶溶液中XI型胶原酶的浓度为O. 4-0. 5mg/mL。所述步骤(3)中,将沉降物中加入Hank’s液后重悬沉淀、过滤,将滤液离心分离并取沉降物;在沉降物中加入梯度离心液重悬沉淀,加入Hank’ s液离心分离,取上清液离心 分离后在沉降物中加入分离液,手捡得到小鼠胰岛细胞。所述分离液为牛白蛋白与hank’ s液的混合液,该混合液中牛白蛋白的浓度为1%-1. 5%。胰岛在胰腺中的分布并非随机分布,超过71%的胰岛分布于脾部胰腺中。脾静脉和肠系膜上静脉相交后组成肝门静脉,小鼠的脾部胰腺血供相对单一,脾静脉是唯一支配小鼠脾部胰腺的静脉。由脾静脉、小静脉、毛细血管组成了一个相对封闭的管道系统。本发明就是利用这个封闭的管道系统作为胶原酶的充盈线路,达到了很好的分离胰岛效果,本发明的这种小鼠胰岛细胞的分离方法称为脾静脉法(以下简称SV法)。与现有技术相比,本发明的有益效果在于1、本发明的小鼠胰岛细胞分离纯化的方法在操作上简单易行,而且所用到的胶原酶的配置浓度低、胰腺消化时间短,所用整个分离纯化过程成本低、效率高;2、SV法所分离的胰岛在形态上和CBD法没有明显差异,而且大多数SV法所分离的胰岛可以正常贴壁。3、SV法所分离的胰岛在功能上和CBD法没有明显差别,而且SV法分离得到的胰岛在高糖刺激下胰岛素释放有增加的趋势,所用SV法完全可以作为CBD法的补充或者替代方法,特别适用于CBD法无法使用的小鼠,丰富了小鼠胰岛分离的可选技术,提高了分率成功率。


图1是小鼠胰岛细胞形态图,其中图1a为CBD法分离的胰岛细胞,图1b为SV法分离的胰岛细胞。图2是采用SV法分离出可以贴壁的胰岛细胞形态图。图3是采用SV法和CBD法分离得到的胰岛细胞的凋亡率对比图。图4是采用SV法和CBD法分离得到的胰岛细胞在高糖刺激下的胰岛素分泌能力对比图。图5是移植小鼠血糖水平对比图。图6是采用SV法和CBD法分离得到的胰岛细胞移植成活的免疫荧光图。
具体实施例方式下面结合实施例,对本发明作进一步说明实施例所用到的试剂
Hank,s 液Hank’ s 盐平衡液(HBSS, GIBCO, cat. no. 14025);胶原酶溶液胶原酶XI (Sigma, cat. no. C7657),浓度为 O. 4-0. 5mg/mL ;梯度离心液梯度离心液1077 (SIGMA, cat. No. 10771);麻药戊巴比妥钠;胶原酶充盈液将XI型胶原酶溶至hank’s液中至终浓度为O. 5mg/mL,并吸取ImL加入15mL离心管备用;分离液将牛白蛋白加入hank’ s液中,终浓度为1%。实施例所用到的器械设备解剖显微镜、37°C水浴箱、离心机(Eppendorf,5810R)、 5-mL 注射器套管针(BDIntima II,cat. No. 383408)、40 目筛网(Bel Ico Glass, Inc, Catno.1985-00040)。实施例1(I)手术操作小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉(45mg/kg体重),一旦充分麻醉,采用75%的酒精消毒皮肤,然后沿腹正中线做切口,充分暴露胰腺。(2)胰腺充盈剪断膈脾韧带和胃脾韧带以游离脾部胰腺,同时剪开降结肠和直肠与胰腺之间的韧带组织;将脾部胰腺从左侧水平翻转至右侧,可以清楚的看到位于胰腺背面且位置表浅的脾静脉。用止血钳在脾静脉和脾交界处夹闭防止胶原酶溶液灌入脾脏。切开横膈膜,并且把心脏剪破以终止胰腺的血供;在解剖显微镜下,在脾静脉与门静脉交汇处将24G套管针穿入脾静脉。缓慢注入1-2毫升胶原酶充盈液直至脾部胰腺完全充盈;将充盈好的脾部胰腺从腹腔中游离下来并放入预置了 I毫升胶原酶充盈液的15毫升离心管中。(3)胰腺消化将15毫升离心管放入37. 5°C水浴箱中静止消化15分钟。消化过程中用手振荡离心管2-3次。通过加入预冷的IOmL Hank’s液来终止消化。4°C下1000转离心30秒,弃上清。重新加入IOmL预冷的Hank’ s液,4°C下1000转离心30秒,弃上清。(4)胰岛纯化加入IOmL Hank’ s液重悬沉淀,并将重悬液通过40目筛网以除去脂肪等无法消化的大块组织。用15mL离心管收集滤液,4°C下1000转离心30秒,弃上清;用5mL梯度离心液重悬沉淀,吹打混勻。然后缓慢加入5mLHank’ s液,形成明显的上下分层。1500转离心20分钟(此时胰岛位于上清液中);将上清液转移至新的15mL离心管中,1000转离心30秒,弃上清,并加入5mL分离液至离心管中。(5)手捡在体式显微镜下,用20微升移液器手捡胰岛并培养。小鼠胰岛细胞对比测试结果采用以上实施例分离纯化小鼠胰岛细胞的方法(以下简称SV法)和传统的CBD法进行对比测试试验,具体如下(I)胰岛细胞形态图1为小鼠胰岛细胞形态图,其中图1a为CBD法分离的胰岛细胞,图1b为SV法分离的胰岛细胞,从图中可看成,使用SV法分离得到的胰岛在形态上与传统的CBD法所分离的胰岛没有明显差别。经过I天的体外培养,大多数SV法所分离的胰岛可以正常贴壁,如图2所示,表明胰岛可以从恶劣的胰岛分离步骤中恢复活性。(2)胰岛细胞的凋亡比率将分离到的胰岛打散成单个细胞,并通过流式细胞仪统计细胞的凋亡比率,结果如图3显示,采用CBD法和SV法两种方法所分离到的胰岛在凋亡比率上没有明显的差异。(3)胰岛细胞对高糖刺激的反应性
高糖刺激的胰岛素分泌实验是比较公认的检测胰岛分泌功能状态的实验方法,具体结果如图4所示,两种方法所分离的胰岛在对高糖刺激的反应性没有明显差异,而且实验结果表明,SV法分离得到的胰岛在高糖刺激下胰岛素释放有增加的趋势。(4)胰岛细胞移植测试为了观察SV法所分离的胰岛能否在胰岛移植中应用,将两种方法所分离的胰岛分别移植至STZ糖尿病小鼠的肾包膜下(n=4),在移植后第14天开始连续6天上午10点钟监测随机血糖。两组小鼠均可以恢复至正常血糖,各时间点均没有明显差异。具体如图5所示,两种方法分离出的胰岛细胞均可以有效的降低糖尿病小鼠的血糖。所以,当CBD法无法使用时,SV法成为最佳的替代方法,通过SV法可以同样获得高活性的小鼠胰岛,极大的提高了小鼠分离成功率。图6为免疫荧光图为肾组织切片,图中显示,采用CBD法和SV法两种方法所分离到的小鼠胰岛细胞均移植成活,并且两种方法分离的胰岛在肾包膜下的形 态没有明显差异。
权利要求
1.一种小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其步骤包括 (1)胰腺充盈将小鼠麻醉、皮肤消毒后沿腹正中切开,充分暴露胰腺;剪断与脾部胰腺相连接的韧带组织,将脾静脉和脾交界处夹闭并剪破心脏,在脾静脉与门静脉交汇处进针至脾静脉,注射胶原酶充盈液;将充盈好的脾部胰腺从腹腔中游离下来后浸泡在胶原酶充盈液中; (2)胰腺消化将步骤(I)中得到的胰腺用胶原酶溶液水浴消化,并加入Hank’s液后离心分离,取沉降物。
(3)分离纯化在步骤(2)中得到的沉降物经过重悬沉淀、过滤、离心处理后得到小鼠胰岛细胞。
2.根据权利要求1所述的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其特征在于所述步骤(I)中,将小鼠麻醉所注射的麻药剂量与小鼠体重比为45-60mg :1kg。
3.根据权利要求1所述的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其特征在于所述步骤(I)中的胶原酶充盈液为含有XI型胶原酶的hank’s液,其中XI型胶原酶浓度为O. 4-0. 5mg/mL。
4.根据权利要求3所述的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其特征在于所述步骤(I)中的胶原酶充盈液注射量为l_2mL。
5.根据权利要求1所述的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其特征在于所述步骤(2)中水浴温度为37°C -37. 5°C。
6.根据权利要求1所述的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其特征在于所述步骤(2)中胶原酶溶液中XI型胶原酶的浓度为O. 4-0. 5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其特征在于所述步骤(3)中,将沉降物中加入Hank’s液后重悬沉淀、过滤,将滤液离心分离并取沉降物;在沉降物中加入梯度离心液重悬沉淀,加入Hank’ s液离心分离,取上清液离心分离后在沉降物中加入分离液,手捡得到小鼠胰岛细胞。
8.根据权利要求6所述的小鼠胰岛细胞的分离纯化方法,其特征在于所述分离液为牛白蛋白与hank’ s液的混合液,该混合液中牛白蛋白的浓度为1%_1. 5%。
全文摘要
本发明属于细胞分离技术领域,特别涉及一种小鼠胰岛细胞的分离方法,将小鼠麻醉、皮肤消毒后沿腹正中切开,充分暴露胰腺;剪断与脾部胰腺相连接的韧带组织,将脾静脉和脾交界处夹闭并剪破心脏,在脾静脉与门静脉交汇处进针至脾静脉,注射胶原酶充盈液;将充盈好的脾部胰腺从腹腔中游离下来后浸渍在胶原酶充盈液中。将胰腺胶原酶溶液水浴消化,并加入Hank’s液后离心分离,取沉降物。将沉降物经过重悬沉淀、过滤、离心处理后得到小鼠胰岛细胞。本发明的小鼠胰岛细胞分离纯化的方法在操作上简单、易行,而且所分离到的胰岛细胞在形态上和功能上和CBD法没有明显差异,丰富了小鼠胰岛分离的可选技术,提高了分离功率。
文档编号C12N5/071GK103013907SQ20121056347
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者宁光, 李峰, 曹亚南, 姜秀丽 申请人:上海市内分泌代谢病研究所
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