专利名称：通过n端增加二硫键提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常温木聚糖酶(AoXynllA)基因进行热稳定性定向改造，杂合木聚糖酶工程菌的构建及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链,随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此对木聚糖酶耐热性的研究也引起了国内外研究的高度重视。开发耐热型木聚糖酶的研究主 要包括筛选超耐热的木聚糖酶生产菌和利用基因工程对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的亲睐。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型，可以用于极端条件下木聚糖酶催化模式系统及蛋白质分子折叠机理等的研究。基因工程技术、生物信息学以及计算机科学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用大规模高性能的计算机及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，加速木聚糖酶在各种领域中的应用过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，运用基因工程的方法构建杂合木聚糖酶工程菌以及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法。将源自A.oryzae CICC 40186的第11家族的木聚糖酶命名为AoXynllA，其相应的基因命名为AoxynllA ;采用的模板为同家族的超耐热木聚糖酶，将其命名为EvXynllTS,基因序列为本实验室合成基因Syxynll (GenBank accessionNO. JX459567);由定向改造得到的杂合木聚糖酶命名为AoXynIIA1，其相应的基因为AoXynllA1，其热稳定性有了一定的提高，而酶的活性较原酶而言没有下降，有较大的工业应用潜力以及经济价值。本发明的技术方案一种来源于A. oryzae CICC 40186的木聚糖酶基因(AoxynllA)在计算机辅助下进行理性设计,得到一种杂合木聚糖酶=AoXynllA1,其完整的DNA和氨基酸序列分别称为SEQID NO 1和SEQ ID NO :2。所述的重组木聚糖酶的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 5. 5、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为O. 5%的榉木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C预热IOmin,在A管中加入O. ImL 适当稀释的酶液，50°C准确反应IOmin;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS) 试剂，在B管中再补加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀； 540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖 (以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生 I μ mo I还原糖所需的酶量定义为I个木聚糖酶活性单位(IU)。
所述的耐热杂合木聚糖酶基因的设计、克隆及表达
(I)同源建模模拟AoXynllA的空间结构登录蛋白质结构数据库Protein data bank (http ://rcsb. org),经BLAST比对,找到与AoXynllA具有高度同源序列。本实验选择具有非常高的热稳定的EvXynllTS (Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为66. 49%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为AoXynllA构建空间结构。运用软件Verify 3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。
(2)利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因通过序列比较，我们把EvXynllTS前面5个氨基酸(NAQTC)添加到AoXynllA的N端，再把杂合酶的32 位T改为C，然后我们以EvXynlIts为模板，对杂合木聚糖酶进行同源建模，再运用分子动力学模拟方法分别对杂合酶和原酶进行总体能量及RMSD值计算，由结果我们得出杂合酶的总体能量和RMSD值相对于原酶而言较小，即热稳定性较好。
(3)杂合木聚糖酶工程菌的构建和表达方法
(I)杂合基因AoXynllA1表达质粒的构建根据GenBank上AoXynllA基因序列 (GenBank accessionNo. JQ326257)设计 3 个引物
Xynll-F :5，-CTCGAGAAAAGAAACGCTCAAACTTGTTCCACACCCAGTAGCACGG-3，含有 XhoI 酶切位点
Xynll-Rm :5，-GTATGAACCGCCGTTGCCGTTACAGTAAGTCACATCAC-3，
Xynll-R :5’ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3’，含有 Not I 酶切位点
采用大引物PCR技术对原基因进行定向诱变，主要分为三步以本实验室构建的携带AoxynlIA基因的重组质粒(专利申请号201110410412. 9)为模板，采用引物Xynll-F 和 Xynll-Rm，进行 PCR 首轮扩增(94 °C 5min ；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s, 30 个循环； 72°C IOmin);对该PCR产物核酸电泳并进行割胶回收，回收产物作为N端引物，C端引物为 Xynl 1-R，进行第二轮 PCR 扩增(94°C 5min ；94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 60s ;72°C延伸 IOmin)； 将第二轮PCR目的条带进行克隆、测序；测序正确的PUCm-T-A0XynllA1与pPIC9KM(已申请专利，专利号201110410391. O)质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在 T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPICgKM-AoXynllA1,并对重组表达质粒进行序列测定；
⑵GSlWAoxynllAi重组子的构建、表达及酶活的测定用Sac I对 PPICgKM-A0XynllA1进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GSlM/AoxynllAi ;该工程菌用I. 0%甲醇诱导96h，离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，对该酶和原酶的酶学性质进行比较在O. 5%的榉木木聚糖底物、反应时间为 IOmin的情况下,AoXynllA1的最适温度由原酶的55°C提高为58°C ;55°C预热下,AoXynllA1的半衰期由原酶的 4min升到 28min。本发明对米曲霉常温木聚糖酶进行了定向改造，在保持原酶活性的基础上，提高了该酶的热稳定性，使其具有更好的工业应用前景
图I :重组质粒pPICgKM-AoxynllAi的构建示意图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例I同源建模模拟AoXynllA及其杂合蛋白的空间结构
登录蛋白质结构数据库Proteindata bank(http://rcsb· org),经BLAST 比对，找到与AoXynllA具有高度同源序列。本实验选择具有非常高的热稳定的EvXynlIts(ProteinData Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为66. 49%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为AoXynllA构建空间结构。运用软件Verify 3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。实施例2利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因分别对通过同源建模获得的野生型AoXynllA的晶体结构和杂合型AoXynllA1进行分子动力学模拟。主要包括以下几步首先我们对空间结构进行预处理，使用GR0MACS中的pdb2gmx命令添加所有缺失的氢原子，并输出一个包含所有原子信息的.gro文件。该命令的格式为pdb2gmx-f llbs.pdb-o libs, gro-p libs, top-ignh-ter第二步利用GR0MACS中的editconf和genbox命令为AoXynllA空间结构添加适当的水溶液来模拟AoXynlIA在水溶液中的运动。其中溶剂采用TIP3P水模型，对于模拟的体系，在溶质外围加上I. 5nm的水分子层。其具体过程是首先使用editconf 命令定义盒子的大小，然后用genbox命令读入GR0MACS的结构文件,并读入水盒子的大小,输出文件包含分子文件和水盒子。同时genbox更改原来的top文件,使其含有水分子。该命令的格式为Editconf-f libs. gro~o llbs_box. gro-bt cubic-d I. 5Genbox-cp llbs_box. gro-cs-p libs, top-o llbs_water. gro第三步用金属离子平衡体系的电荷,命令格式为grompp-f em. mdp-c llbs_water_ion. gro-p libs, top-o minimize_water. tprgenion-s minimize_water. tpr_o Ilbs_water_ion. gro-p libs.top-pnameNa+-np 10-random-gtrp_ion. loggenion-s minimize_water. tpr_o llbs_water_ion. gro-p libs.top-nnameCL—nn 1-random-g trp_ion. log 并且需要手动对得到的 llbs_water_ion. gro 与 libs.top文件中的原子数目进行修改，与添加的金属离子相匹配。第四步分别利用grompp和mdrun两个命令进行能量最小化处理。首先约束溶质，用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步。然后去约束后再进行800步最陡下降法优化，1200步共轭梯度法优化。命令格式为
grompp-f emstl. mdp-c Ilbs_water_ion. gro-p libs.top-o minimize—water,tprmdrun-s minimize—water, tpr-o minimize—water, trr-c minimize—water, gro-eminimize—water, edr-gminimize—water, loggrompp-f emst. mdp-c minimize—water, gro-p libs, top-o minimize—water, tprmdrun-s minimize—water, tpr-o minimize—water, trr-c minimize—water2.gro-e minimize—water, edr-gminimize—water, log第五步分子动力学模拟分为两步，首先进行20ps的约束溶质的MD模拟，此时模拟温度从OK逐步升高到300K ;然后进行500ps的无约束 恒温MD模拟。命令格式为
grompp-fpr. mdp-c minimize—water2. gro-p libs, top-o minimize—waterL tprmdrun-s minimize—waterL tpr-o minimize—waterl. trr-c minimize—waterLgro-e minimize—waterL edr-g minimize—waterL loggrompp-f full, mdp-c minimize—waterL gro-p libs, top-o minimize—water2.tprmdrun-s minimize—water2. tpr-o minimize—water2. trr-c minimize—water3.gro-e minimize—water2. edr-g minimize—water2. log最后得到其总体能量，RMSD值及AoXynllA各个氨基酸的B_factor值。命令格式为g_rms-s minimize—waterL tpr-f minimize—waterL trr-o rms. xvgxmgrace-nxy rms. xvgg—rmsf-s minimize—water2. tpr-f minimize—water2. trr_b 400_e 600_o rmsf.xvg-oq I. pdbxmgrace-nxy rmsf. xvgg—energy-f minimize—water2-o energy, xvgxmgrace-nxy energy, xvg我们分别将MD得到的AoXynllA和AoXynllA1各个氨基酸的B-factor值导入到PDB文件中，使用B-FITTER软件导出各个氨基酸的B-factor值，由图可以看出AoXynllA1氮端序列中各氨基酸的柔性较小，波动幅度较为平均，而AoXynllA氮端序列较为不稳定，说明杂合酶的总体能量和RMSD值相对较小，即热稳定性较好。实施例3杂合基因AoXynllA1及其表达质粒的构建采用大引物PCR技术对原基因进行定向诱变，主要分为三步以原基因质粒为模板，采用引物Xynll-F和Xynl 1-Rm，进行PCR首轮扩增(94 V 5min ；94 V 30s，55°C 30s, 72°C 30s，30个循环；72°C IOmin);对该PCR产物核酸电泳并进行割胶回收，回收产物作为N端引物，C端引物为Xynll-R，进行第二轮PCR扩增(94°C 5min ；94°C 30s，45°C 30s, 72°C 60s ;72°C延伸IOmin);将第二轮PCR目的条带进行克隆、测序；测序正确的PUCm-T-AoxynllA1与pPIC9KM质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPICgKM-AoXynllA1,并对重组表达质粒进行序列测定；实施例AGSllS/AoxynllAi重组子的构建、表达及酶活的测定
用Sac I对PPICgKM-A0xynIlA1进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、 筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GSlM/AoxynllAi ;该工程菌用I. 0%甲醇诱导96h，离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，对该酶和原酶的酶学性质进行比较在O. 5%的榉木木聚糖底物、反应时间为IOmin的情况下，AoXynllA1的最适温度由原酶的55°C提高为58°C ； 55°C预热30min后，AoXynllA1的半衰期由原酶的 4min升到 28min。
权利要求
1.一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第11家族的常温木聚糖酶基因AoxynllA,以另一个同家族的超耐热木聚糖酶基因Syxynll (GenBankaccession NO. JX459567)模板，利用计算机技术及其相关软件，结合分子动力学模拟的方法，对AoXynllA分子进行理性设计,定向改造以提高热稳定性。
2.利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因 (1)同源建模模拟AoXynllA的空间结构登录蛋白质结构数据库Proteindatabank (http ://rcsb. org),经BLAST比对,找到与AoXynllA具有高度同源的序列；本实验选择热稳定非常高的EvXynlIts (Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为66. 49%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为A. oryzae常温木聚糖酶成熟肽构建空间结构；运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型； (2)利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因通过序列比较，我们把EvXynlIts前面5个氨基酸(NAQTC)添加到AoXynllA的N端，再把杂合酶的32位T改为C，然后我们以EvXynlIts为模板，对杂合木聚糖酶进行同源建模，再运用分子动力学模拟方法分别对杂合酶和原酶进行总体能量及RMSD值计算，由结果我们得出杂合酶的总体能量和RMSD值相对于原酶而言较小，即热稳定性较好。
3.杂合木聚糖酶工程菌的构建和表达方法 (I)杂合基因AoxynllA1表达质粒的构建根据GenBank上AoxynllA基因序列(GenBank accessionNo. JQ326257)设计 3 个引物Xynll-F :5’ -CTCGAGAAAAGAAACGCTCAAACTTGTTCCACACCCAGTAGCACGG-3，,含有 XhoI 酶切位点Xynll-Rm :5’ -GTATGAACCGCCGTTGCCGTTACAGTAAGTCACATCAC-3’Xynll-R :5’ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3’，含有 Not I 酶切位点 采用大引物PCR技术对原基因进行定向诱变，主要分为三步以原基因质粒为模板，采用引物 XynlI-F 和 Xynl 1-Rm，进行 PCR 首轮扩增(94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s,30个循环；72°C IOmin);对该PCR产物核酸电泳并进行割胶回收，回收产物作为N端引物，C 端引物为 Xynl 1-R，进行第二轮 PCR 扩增(94°C 5min ；94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 60s ；72°C延伸IOmin);将第二轮PCR目的条带进行克隆、测序；测序正确的PUCm-T-AoxynllA1与载体pPIC9KM(已申请专利，专利号201110410391. O)质粒均用Xho I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPICgKM-AoxynllA1,并对重组表达质粒进行序列测定； ⑵GSlM/AoxynllAi重组子的构建、表达及酶活的测定用Sac I对pPIC9KM-AoxynllAl进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GSlM/AoxynllAi ;该工程菌用I. O %甲醇诱导96h，离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，对该酶和原酶的酶学性质进行比较在O. 5%的榉木木聚糖底物、反应时间为IOmin的情况下，AoXynllA1的最适温度由原酶的55°C提高为58°C ;55°C预热下，AoXynllA1的半衰期由原酶的 4min升到 28min。
全文摘要
通过N端增加二硫键提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法。本发明提出了一种新型的利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行定向改造的方法，运用基因工程的方法构建具有高效表达能力的杂合木聚糖酶工程菌。将来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常温木聚糖酶基因进行热稳定性定向改造，获得了一种杂合木聚糖酶，其热稳定性有了一定的提高，相对于原酶而言活性没有降低，作为一种耐热型的酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N9/42GK102978223SQ201210562539
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者邬敏辰, 陈忠法, 胡蝶, 李剑芳 申请人:江南大学