专利名称：一种产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法
技术领域：
本发明涉及一种产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，主要用于制备酵母的有效降解产物(如核苷酸、肽类和氨基酸等)。
背景技术：
酵母富含蛋白质、氨基酸、多种维生素及微量元素，是食品工业中已长期使用的安全微生物。随着饲料工业的发展和蛋白质资源的日益匮乏，大规模培养酵母菌制备微生物蛋白质饲料已日显重要；饲用酵母中不仅蛋白质含量高(40％以上)，还含有酵母菌分泌的蛋白酶、消化酶、核苷酸、B族维生素等生理活性物质；而且酵母细胞壁的主成分是葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和几丁质，其中的活性成分葡聚糖和甘露寡糖具有刺激细胞免疫和体液免疫、促进有益菌生长、抑制有害菌生长的作用，因此酵母的深度开发利用潜力具大。
国内外饲用酵母的生产传统方法主要深层发酵法，深层发酵法的特点是机械化程度高，产品细胞多，杂菌少，产品质量稳定；但由于投资规模大，能源消耗大，还有三废污染。除此以外，固体发酵法的特点是设备投资小，技术简单，产品具有较高的生物活性，无三废污染；但由于生产时间长，各种条件不好，产品质量控制难以达到标准。于是最近又出现了液固两相法生产饲用酵母的方法。但一般制备酵母抽提物往往选择纯度相对高的深层发酵法生产的酵母。为了使酵母自溶产物有更多的风味物质(或前体)，本发明采用产蛋白酶系丰富的米曲霉与酵母共生培养来完成，多种微生物的协同作用即可得到多菌共生酶系互补，发生水解与发酵混合进行，以产生更多的风味物质和营养活性物质。
在此前的相关研究中，章亭洲等(申请号03142242.X)提出“高活性蛋白及多菌种液固联合发酵生产高活性蛋白技术”。以多种农副产品为原料，通过接种多菌种，并采用液固联合发酵工艺制得。其原料配方为麸皮，味精渣，啤酒渣，粉丝蛋白粉，玉米蛋白粉；其中发酵菌种采用解脂假丝酵母，米曲霉，解朊假丝酵母，黑曲霉，白地霉。该多菌种液固联合发酵工艺生产高活性蛋白的流程为(1)斜面菌种；(2)摇瓶培养；(3)发酵罐培养；(4)原料称重、混合、加水；(5)原料熟化；(6)接种液体菌种；(7)固体发酵；(8)烘干、粉碎；(9)计量、打包。
王加启等(申请号200410004551.1)提出了“一种反刍动物专用双效微生物饲料添加剂及其制备”，该发明是采用玉米为原料，经过粉碎、蒸煮、液化、糖化等步骤，制成玉米液化酶解液，作为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)的发酵原料，分别发酵制备成嗜酸乳杆菌和酿酒酵母培养物的活菌制剂；采用玉米、麸皮和豆粕等原料作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)的发酵产酶培养基，枯草芽孢杆菌用液体发酵、米曲霉和黑曲霉用固体混合发酵，配伍制成复合酶制剂；将活菌制剂与复合酶制剂按合适比例复配制成双效添加剂产品。
夏立秋等(申请号03124850.0)提出了“一种血粉饲用蛋白的生产方法”，该方法涉及用混合菌株一次发酵生产血粉蛋白。即经活化培养的米曲霉AS100、AS102芽孢杆菌Asp007与酵母菌Y113分别以5～4∶3～4∶1∶1的比例，以0.5％接种量接入米糠种曲培养中制成种曲，经活化的种曲，以0.5％接种量接入血粉、米糠、菜粕、豆粕与羽毛粉的血粉发酵培养基中发酵48℃小时后干燥制成血粉蛋白。
况启生等(申请号02108823.3)提出了“多菌种复合米酒曲的制作”，该方法是采用二种或二种以上多菌种分开进行纯种培养，然后按一定配比混合生产的多菌种复合米酒曲。
以上技术方法由于使用了固态发酵或其它利用目的，因此其酵母与霉菌的共生发酵法难以得到高蛋白质酵母(含蛋白质50％以上)。
发明内容本发明既是为了提供一种能得到高蛋白质酵母(含蛋白质50％以上)的、产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，所述方法如下共生培养基终浓度组成为麸皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麦芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/6～1/4×105个细胞/mL培养基的接种量接种米曲霉孢子悬液，20～40℃、100～150r/min振荡培养36～72h后，再以1/15～1/10×106个细胞/mL培养基的接种量接种产朊假丝酵母种子液，20～40℃、100～200r/min振荡培养18～36h，获得共生培养产物。
所述米曲霉孢子悬液可由如下方法制备得到将米曲霉菌种转接于斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，即得所述米曲霉孢子悬液。所述斜面培养基可为常用适用于米曲霉的培养基，本发明中采用豆汁斜面培养基，配制方法如下称取一定量的黄豆，加入质量约为黄豆10倍的水浸泡过夜，煮沸2小时，用纱布过滤即得豆汁(加入蔗糖至终浓度为30g/L，即为豆汁液体培养基)；往豆汁中加入蔗糖至终浓度为30g/L和琼脂至终浓度为20g/L即为豆汁斜面培养基。
所述产朊假丝酵母种子液可由如下方法制备得到将产朊假丝酵母菌种转接于斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于液体培养基，30℃下恒温培养72h，即得所述产朊假丝酵母种子液。所述斜面培养基和液体培养基可为常见适用于产朊假丝酵母的斜面培养基和液体培养基，本发明中采用麦芽汁斜面培养基和麦芽汁液体培养基，配制称取一定量的麦芽颗粒，加四倍的水浸泡过夜，打碎磨浆，在72℃的恒温水浴锅中糖化一个小时左右，用碘液试验检查糖化完全为止，煮沸30分钟灭酶，离心，得上清液即为麦芽汁(可直接作为麦芽汁液体培养基)，再加入琼脂至终浓度为20g/L即为麦芽汁斜面培养基。
优选的，所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母1422。
优选的，所述所述米曲霉为米曲霉3042。
前述豆汁液体培养基，121℃灭菌20min，接入米曲霉3042孢子悬液，于30℃，120r/min振荡培养。从生长曲线发现米曲霉3042在培养40小时后开始进入对数生长期，72小时后基本上进入生长平稳期，因此接入米曲霉3042的菌龄选择在36～60h，以48h最佳。
前述麦芽汁(100Bê)液体培养基，接入产朊假丝酵母1422菌种子液，于30℃、180r/min振荡培养，从不同时间所得的菌液光密度值可以得出产朊假丝酵母1422在24小时进入对数生长期，48小时后进入平稳期，故确定接入产朊假丝酵母1422的菌龄为12～48h，以培养24小时为最佳。
具体的，所述方法包括如下步骤(1)将米曲霉3042菌种转接于豆汁斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于豆汁斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用质量为斜面培养基质量2倍的无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，获得米曲霉孢子悬液；(2)将假丝酵母1422菌种转接于麦芽汁斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于豆汁液体培养基，30℃下恒温培养72h，获得产朊假丝酵母种子液；(3)共生培养基终浓度组成为麸皮10g/L，豆粕30g/L，麦芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/5×105个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(1)所得米曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养48h后，再以1/12×106个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(2)所得产朊假丝酵母种子液，30℃、180r/min振荡培养24h，获得共生培养产物。
通过本发明方法进行的产朊假丝酵母和米曲霉复合共生培养发酵，不仅获得了含高蛋白质的酵母(粗蛋白质含量高达52.3g/100g(干菌计)以上，复合菌株培养发酵的含菌量达5.933×109个/g(干计)，同时也得到了丰富的内源酶系，中性蛋白酶活高达76单位/克(干计)以上。
具体实施方式
下面以产朊假丝酵母1422和米曲霉3042为例，结合实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1菌种扩大培养培养基配制豆汁斜面培养基组成称取一定量的黄豆，加10倍质量的水浸泡过夜，煮沸2小时，用纱布过滤得豆汁；加入蔗糖终浓度为30g/L，琼脂终浓度为20g/L即为豆汁斜面培养基。
麦芽汁斜面培养基组成称取一定量的麦芽颗粒，加4倍质量的水浸泡过夜，打碎磨浆，在72℃的恒温水浴锅中糖化一个小时左右，用碘液试验检查糖化完全为止，煮沸30分钟灭酶，离心，得麦芽汁，再加入终浓度20g/L的琼脂即为麦芽汁斜面培养基。
麦芽汁液体培养基组成称取一定量的麦芽颗粒，加4倍质量的水浸泡过夜，打碎磨浆，在72℃的恒温水浴锅中糖化一个小时左右，用碘液试验检查糖化完全为止，煮沸30分钟灭酶，离心，得上清液即为麦芽汁，即麦芽汁液体培养基。
米曲霉3042以无菌操作方式，将米曲霉3042菌种(由杭州食品酿造有限公司提供)转接于豆汁斜面培养基上，于30℃下培养96h，获得斜面活化菌种；再以无菌操作方式，将活化菌种转接于茄子瓶豆汁斜面培养基上，于30℃下恒温培养96h，用50毫升无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，制成孢子悬液，细胞浓度为1×105个/mL；产朊假丝酵母1422以无菌操作方式，将产朊假丝酵母1422菌种(由中国工业微生物菌种保藏中心提供)转接于麦芽汁(50Bê)斜面培养基上，于30℃下恒温培养72h，获得斜面活化菌种；再以无菌操作方式，将斜面活化菌种转接于麦芽汁液体培养基，30℃下恒温培养72h，即得所述产朊假丝酵母种子液，细胞浓度为1×106个/mL。
实施例2共生培养共生培养基终浓度组成为麸皮10g/L，豆粕30g/L，麦芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；1.5L三角瓶中装液量300mL，调pH7.0，灭菌，冷却至室温，接入实施例1所得米曲霉孢子悬液60mL，30℃、120r/min振荡培养48h后，再接入实施例1所得产朊假丝酵母种子液25mL，30℃、180r/min振荡培养24h，发酵结束后，过滤，离心收集菌丝体，不同批次菌粉中蛋白质和内源酶系酶活含量见表1，U为酶活单位，定义为在pH7.2，40℃，1min内产生1μg酪氨酸的酶量(g)为一个单位。
表1不同批次菌粉中蛋白质和内源酶系酶活含量
结论运用本发明方法，产朊假丝酵母1422和米曲霉3042共生培养获得的产物中，粗蛋白质含量高达52.3g/100g(干计)以上，复合菌株培养发酵的含菌量达5.933×109个/g(干计)，同时也得到了丰富的内源蛋白酶系，酶活高达76U/克(干菌计)以上。
实施例3共生培养基终浓度组成为麸皮15g/L，豆粕25g/L，麦芽汁120g/L，酵母膏0.8g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L；1.5L三角瓶中装液量300mL，调pH7.0，灭菌，冷却至室温，接入实施例1所得米曲霉孢子悬液50mL，30℃、120r/min振荡培养48h后，再接入实施例1所得产朊假丝酵母种子液20mL，28℃、150r/min振荡培养36h，发酵结束后，过滤，离心收集菌丝体，其中粗蛋白质含量为53.35g/100g菌粉，内源蛋白酶系酶活为87U/克干菌粉。
实施例4共生培养基终浓度组成为麸皮8g/L，豆粕36g/L，麦芽汁80g/L，酵母膏1.6g/L，KH2PO46g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L；1.5L三角瓶中装液量300mL，调pH7.0，灭菌，冷却至室温，接入实施例1所得米曲霉孢子悬液50mL，30℃、120r/min振荡培养48h后，再接入实施例1所得产朊假丝酵母种子液20mL，35℃、120r/min振荡培养48h，发酵结束后，过滤，离心收集菌丝体，其中粗蛋白质含量为52.16g/100g菌粉，内源蛋白酶系酶活为85U/克干菌粉。
权利要求
1.一种产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，其特征在于所述方法如下共生培养基终浓度组成为麸皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麦芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/6～1/4×105个细胞/mL培养基的接种量接种米曲霉孢子悬液，20～40℃、100～150r/min振荡培养36～72h后，再以1/15～1/10×106个细胞/mL培养基的接种量接种产朊假丝酵母种子液，20～40℃、100～200r/min振荡培养18～36h，获得共生培养产物。
2.如权利要求1所述的产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，其特征在于所述米曲霉孢子悬液由如下方法制备得到将米曲霉菌种转接于斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，即得所述米曲霉孢子悬液。
3.如权利要求1所述的产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，其特征在于所述产朊假丝酵母种子液由如下方法制备得到将产朊假丝酵母菌种转接于斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于液体培养基，30℃下恒温培养72h，即得所述产朊假丝酵母种子液。
4.如权利要求1或2所述的产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，其特征在于所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母1422。
5.如权利要求1或3所述的产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，其特征在于所述所述米曲霉为米曲霉3042。
6.如权利要求1所述的产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(1)将米曲霉3042菌种转接于豆汁斜面培养基，30℃下培养48～120h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于豆汁斜面培养基上，30℃下恒温培养96h，用质量为斜面培养基质量2倍的无菌生理盐水洗下米曲霉孢子，充分振荡使孢子混合均匀，获得米曲霉孢子悬液；(2)将产朊假丝酵母1422菌种转接于麦芽汁斜面培养基上，于30℃下恒温培养36～96h，获得斜面活化菌种，再将斜面活化菌种转接于麦芽汁液体培养基，30℃下恒温培养72h，获得产朊假丝酵母种子液；(3)共生培养基终浓度组成为麸皮10g/L，豆粕30g/L，麦芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；调pH7.0，灭菌，冷却至室温，以1/5×105个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(1)所得米曲霉孢子悬液，30℃、120r/min振荡培养48h后，再以1/12×106个细胞/mL培养基的接种量接种步骤(2)所得产朊假丝酵母种子液，30℃、180r/min振荡培养24h，获得共生培养产物。
全文摘要
本发明提供了一种产朊假丝酵母与米曲霉的共生培养方法，所述方法如下共生培养基终浓度组成为麸皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麦芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH
文档编号C12R1/69GK101050432SQ20071006755
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月9日 优先权日2007年3月9日
发明者丁玉庭, 聂小华, 刘书来 申请人:浙江工业大学