从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种谷脫甘肤的制备方法，具体设及一种从产航假丝酵母发酵液中提 取谷脫甘肤的方法。
【背景技术】
[0002]谷脫甘肤，即I: A-谷氨酷半脫氨酷甘氨酸，是由k谷氨酸、k半脫氨酸和 甘氨酸经肤键缩合而成的一种同时具有I-谷氨酷基和琉基的生物活性=肤化合物。作为 生物体内的非蛋白琉基化合物，谷脫甘肤主要有还原型（G-SH)和氧化型（G-S-S-G)两种形 态，在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷脫甘肤。还原型谷脫甘肤具有独特的生 理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。还原型谷脫甘肤作为氨基酸类生化药物，可用于治 疗肝病、重金属中毒等疾病，最近发现还原型谷脫甘肤还具有抗爱滋病毒功效。
[0003]目前生产还原型谷脫甘肤的主要方法是发酵法，即W廉价的糖类等原料为营养物 质，利用微生物体内物质和能量代谢途径来进行还原型谷脫甘肤生物合成的方法。一般情 况下微生物细胞中还原型谷脫甘肤的含量不高，仅为干重的0. 5%~1. 0%，因为过高含量的 还原型谷脫甘肤容易破坏体内已平衡的氧化还原环境。由于还原型谷脫甘肤是一种胞内产 物，发酵结束后需要对还原型谷脫甘肤进行提取纯化。
[0004] 目前从胞内提取还原型谷脫甘肤主要方法有溶剂萃取法、热水抽提法及超声波破 砕抽提法。
[0005]其中溶剂萃取法是通过增加细胞壁通透性W完成提取，溶剂的种类、溫度和提取 时间对抽取率影响较大，用甲酸、液氨、硫酸或=氯乙酸作溶剂萃取时提取率低；用乙醇提 取时可W不破坏细胞壁，杂质含量少，能耗低，但是乙醇抽提完毕需要回收处理，增加了提 取成本。超声波破碎主要问题是破壁后胞内蛋白质、核酸等杂质全部溶出，离屯、后容易浑 浊，不利于后续处理；超声破碎耗费时间长，需要有效的降溫系统，能耗大，不利于工业生 产。
[0006]热水抽提法是从发酵液中提取谷脫甘肤应用较早的方法，例如中国专利文献CN100455592C(申请号200610040606. 3)公开了一种从谷脫甘肤发酵液中提取谷脫甘肤的 方法，采用的是沸水煮法，将谷脫甘肤发酵液经离屯、得到酵母细胞液、用硫酸调节酵母细胞 液抑值为1至2、将调节好抑值的酵母细胞液倒进沸水中进行沸水破壁、阳离子交换后收 集富含谷脫甘肤的浓缩液、真空浓缩得谷脫甘肤超浓缩液、将谷脫甘肤超浓缩液冷冻干燥 得到白色粉末状谷脫甘肤、成品包装而得到成品谷脫甘肤。
[0007] 中国专利文献CN104130310A(申请号201410231642. 2)公开了一种谷脫甘肤 的分离纯化方法，将酵母发酵液离屯、，收集酵母，加入50°C~90°C热水抽取5~30min，调 节抽取液的抑值为1. 5~3,将提取液进行过滤或离屯、，收集提取液；提取液采用超滤法去 除大分子的蛋白质、多糖等杂质，然后采用纳滤膜过滤的方法去除大部分的小分子氨基酸、 单糖类、无机盐等杂质；W纳滤浓缩液为原料，采用强酸性阳离子交换树脂吸附谷脫甘肤， 吸附达到穿透点后洗脱；将洗脱液减压浓缩，加入=倍体积的乙醇进行沉淀，沉淀物冷冻烘 干，得到谷脫甘肤产品，纯度达95%W上。
[0008] 热水抽提法方法简单，成本较低，但容易使还原型G-甜转变成G-S-S-G，而且胞内 其他物质如蛋白质、糖类及核酸等大分子也会随之释放出来，增加后续纯化难度。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种提取完全、成本低的从产航假丝酵母发酵 液中提取谷脫甘肤的方法。
[0010] 实现本发明目的的技术方案是一种从产航假丝酵母发酵液中提取谷脫甘肤的方 法，包括W下步骤： ①产航假丝酵母种子培养和发酵。
[0011] ②收集步骤①发酵培养完毕的产航假丝酵母发酵液，离屯、后去除上清液，收集的 细胞在-15°C~-25°c下冷冻20~30分钟。
[0012] ③将步骤②冷冻后的产航假丝酵母细胞加入硫酸溶液中，硫酸溶液的抑值为1~ 2, 20°C~35°C下放置15~30分钟后，产航假丝酵母细胞内的还原型谷脫甘肤从胞内释 放出来溶解在硫酸溶液中，完成从产航假丝酵母发酵液中对谷脫甘肤的提取，离屯、分离，收 集上清液。
[0013] 上述步骤③中，硫酸溶液中产航假丝酵母细胞的浓度为0. 08g/血~0. 12g/血。
[0014] 上述步骤①产航假丝酵母种子培养时，将产航假丝酵母菌株接种于种子培养基 中，28°C~32°C下培养18~28小时，摇床转速200~250巧m，培养至对数期时停止培养， 得到的种子液待发酵培养。
[0015] 步骤①产航假丝酵母发酵时，先将种子液按8%~10%的接种量接种在发酵基本 培养基中分批培养8~lOh，再按照细胞比生长速率0. 1化1~0. 25h1指数流加培养11~ 13h，接着W5.0~6.0g(h. 1)1恒数流加培养23~2化后；向罐内加入S种氨基酸，加 入后罐内谷氨酸5. 5~6. 5mmol/X、甘氨酸5. 0~6. 〇111111〇1/^、半脫氨酸6. 0~7. 0mmol/ 以继续培养25~3化完成产航假丝酵母的发酵培养。
[0016] 上述分批培养时所述发酵基本培养基组成为：葡萄糖15g/l，硫酸锭5g/l，酵母 膏2g/L，憐酸二氨钟1. 5g/L，硫酸儀0. 25g/L，发酵基本培养基的抑值为5. 5 ; 上述指数流加培养和恒数流加培养所用的均为流加培养基，流加培养基组成如下：葡 萄糖500g/l，硫酸锭36g/l，憐酸二氨钟5g/l，硫酸儀0.5旨/1，其中葡萄糖单独灭菌后 与其它成分混合。
[0017] 本发明具有积极的效果：（0本发明的提取方法首先将产航假丝酵母（Candida utilis，简写为C.utilis)培养并发酵，得到的发酵液离屯、分离，去除上清液，收集的细胞 在-20°C~-30°C下冷冻处理，W增加C.utilis细胞壁渗透性；将冷冻处理后的C.utilis 细胞加入低抑值的强酸溶液中，在低抑值的强酸溶液中胞内还原型谷脫甘肤完全释放出 来，而胞内其他大分子物质如蛋白质、糖类、核酸等则基本留在胞内，简化了后续的纯化操 作，降低了纯化成本，实现了高效、清洁化提取C.utilis细胞中G-甜；同时在本发明的提取 条件下还原型谷脫甘肤未被破坏。
[0018] (2)用低抑值的强酸溶液提取GSH时，只需使用少量的强酸溶液，G-SH提取结束 后，强酸溶液还可进一步循环利用，具有环境友好性。
[0019] (3)本发明的提取方法提取时间短，20分钟左右细胞内的谷脫甘肤就能完全释放 至强酸溶液中，因此本方法提取效率高。
[0020] (4)本发明的提取方法工艺简单、经济、环保，符合循环经济发展的需要，具有良好 的工业应用前景。
【具体实施方式】[002。（实施例1) 本实施例的从产航假丝酵母发酵液中提取谷脫甘肤的方法包括W下步骤： ①产航假丝酵母种子培养和发酵。W产航假丝酵母（CandidautilisW甜02-08)作 为生产菌株，首先进行种子培养，培养至对数后期时停止培养，得到的种子液待发酵培养。
[0022] 种子培养基组成如下（g/L):葡萄糖20,蛋白腺20,酵母