专利名称：一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法
技术领域：
本发明属生物检验检疫领域，通过构建重组蛋白，利用重组蛋白免疫动物制备抗体，建立一种梅花鹿朊蛋白双抗夹心ELISA检测方法。
背景技术：
朊病毒(Prion)是一种由蛋白质组成而不含有核酸等遗传物质的病毒。朊病毒 (PrPsc)是生物体内普遍存在的正常细胞型朊蛋白(PrPe),当它由于某种原因结构发生变化，在细胞内发生错误折叠并可以抵抗新陈代谢，进而聚集扩增，最后引起细胞死亡，最终引起宿主发生神经退行性病变，导致不可逆转性死亡。朊病毒病作为一种新型疾病，由于它病原的特异性，传统的消毒措施不能破坏它的传染性，正常的食物加工过程中不能有效灭活朊病毒，因此该病对食品安全造成巨大威胁。当疯牛病在欧洲爆发时，英法等国屠宰牛群达到100万只以上，造成巨大的经济损失， 同时许多人因为使用了病牛肉制品可能在今后的几十年后感染朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病(Chronic wasting disease, CWD)和疯牛病(BSE)，羊痒疫 (Scrapy)，人克雅氏病(CJD) —样都属于朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病主要感染北美麋鹿、 黑尾鹿、白尾鹿等，广泛分布于北美，主要存在于加拿大和美国。近几年，亚洲国家韩国在引进来自加拿大的鹿体内发现朊病毒，后证实病鹿感染鹿慢性消耗性疾病。梅花鹿是我国重要经济动物，梅花鹿制品品种丰富，具有较高的药用价值和经济价值。由于IM3se可以吸引ft~Pe，并将其转化成IM3se导致疾病的传播，而且朊蛋白在各个物种中均高度保守，梅花鹿朊蛋白和北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿氨基酸同源性则高达93%。一旦该病在我国出现，必将对我国的财政收入、食品安全造成巨大的危害。当前对于朊病毒病的检测主要是利用PrPse抗蛋白酶消化的特点，对动物组织勻浆进行消化前后的对比，既可以判断该病原是否存在。检测手段主要应用Western blot和免疫组化的方法。这两种方法虽然准确度高，但对仪器和环境的要求很高，需要在实验室进行。
发明内容
本发明提供一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法，本发明采取的技术方案是包括下列步骤
(一)、鼠抗重组朊蛋白PrFes单克隆抗体的制备如下 (a)、重组朊蛋白PrPres的制备
(1)制备重组朊蛋白PrP"s基因的人工合成引物为 Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG ； RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；
(2)提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至 PMD-18T-Simp 1 e载体上，将PrFes基因片段插入表达载体pET_Trx中构建重组表达质粒，pET-Trx- PrPres ；将PrFes基因片段插入表达载体ρΕΤ-His中构建重组表达质粒， pET-His- PrPres ；
(3)将重组表达质粒ρΕΤ- χ-PrPlres和pET-His- PrPlres转入BL21 (DE3)中进行表达， 得到两种重组融合朊蛋白I^rFes-Trx和PrFes-His,表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于LB培养基(50mg/L抗生素)，37°C剧烈摇荡培养至0D600=0. 6时加入终浓度为lmmol/L 的IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现ft~Pres-Trx 和PrFes-His分别以包涵体的形式大量表达；
(4)切胶纯化方法，取500μ L包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE，将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h，将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来，置于蒸馏水中在脱色摇床上摇20 min,脱去NaAc，之后将切下来的胶放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后， 用PEG20000进行浓缩，做透析去除小分子，经SDS-PAGE和flfestern blot鉴定后分装后放入-80度冰箱备用；
(b)鼠抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
以复性的重组朊蛋白PrPres-Trx免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔3周后，采用弗氏不完全佐剂 (1:1)乳化抗原，进行第2、3次免疫，最后加强免疫时，直接用免疫原进行腹腔注射；
(2)间接ELISA筛选方法以及阳性杂交瘤判断标准的建立
分别以重组成熟朊蛋白PrPres-His和空载体菌体蛋白pET-His包被酶标板孔，以测定PrPres-Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定 492 nm光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为抗原的最适合包被浓度为 25μ g/ml，4°C包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育lh，以此建立了间接ELISA筛选方法；
(3)阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测
取加强免疫3d后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5 1在PEG1500的作用下融合， 以建立的间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌单克隆抗体的为“3C6”，2011年12月7日其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5556，分类命名产朊蛋白单克隆抗体细胞株， 并用间接ELISA法检测连续培养30代以及冻存5个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌抗体的稳定性；
(4)单克隆抗体生物学特性的鉴定
按试剂盒说明书操作，经鉴定该单克隆抗体为IgG2b型，以10%的梅花鹿脑勻浆包被 Elisa板，以3C6纯化后单抗(1 μ g/ml)检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照，在492nm下读值，3C6反应孔与阴性孔P/N在1观00倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力；
(二)、兔抗重组朊蛋白PrFes-HiS多克隆抗体的制备
用重组朊蛋白I^rPres-HiS免疫雌性家兔，皮下3点注射，免疫剂量Img/只/次，间隔14d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂，第3次免疫后 14天心脏放血，37°C放置1小时后，4°C过夜，次日3000转离心15分钟，去上清，辛酸-硫酸铵法纯化兔多抗血清，纯化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法测定蛋白浓度，_80°C冻存； (三)梅花鹿朊蛋白的检测步骤如下
(1)加入100μL浓度为5μ g/ml兔抗重组梅花鹿朊蛋白PrPres-His多克隆抗体包被 ELISA反应板，4°C孵育12小时；
(2)取梅花鹿脑组织0.5g,加入4. 5ml组织蛋白裂解液，制备成10%组织勻浆。每1毫升组织勻浆加入IOmg蛋白酶K，37°C孵育1小时；
(3)取出包被后的ELISA板用TBST洗5次，每次5分钟；
(4)每孔加入300μ L封闭液:3%BSA + 3%明胶，37°C孵育2小时；
(5)用TBST洗5次，每次5分钟；
(6)每孔加入100μ L待检组织勻浆，37°C孵育1小时；
(7)用TBST洗5次，每次5分钟;
(8)每孔加入100μ L浓度为1. 25 μ g/ml辣根过氧化物酶标记的鼠抗重组梅花鹿朊蛋白单克隆抗体3C6，37°C孵育1小时；
(9)用TBST洗5次，每次5分钟；
(10)加入底物，37°C避光孵育10分钟；
(11)每孔加入50μ L 2M硫酸终止反应；
(12)读板，记录OD值;
(13)根据标准曲线，计算组织勻浆中梅花鹿朊蛋白的含量。本发明受到了国家自然科学基金面上项目(30871956)的资助。本发明采取的包被抗体为兔抗梅花鹿重组朊蛋白PrFes-His多克隆抗体、检测抗体为鼠抗梅花鹿重组朊蛋白I^rPres单克隆抗体，所用的Elisa的方式具有准确度高的优点， 同时所受环境的限制较少，本发明可应用于制备梅花鹿朊蛋白双抗夹心ELISA检测试剂
品.ο
图Ia是本发明重组表达载体PET-Trx构建图； 图Ib是本发明重组表达载体PET-His构建图2是PrP-Trx表达图，椭圆标记处为目的蛋白，目的蛋白大小为2. SKd ； 图3是PrP-Trx纯化图，1和2均为切胶纯化后的目的蛋白； 图4是ft~P-HIS表达图，椭圆标记处为目的蛋白； 图5是PrP-HIS纯化图，1和2均为切胶纯化后的目的蛋白； 图6是免疫后血清效价图，在51200X稀释时阳性血清和阴性血清的P/N仍超过2. 1 ； 图7是利用单抗3C6检测梅花鹿脑，在Western blot中可见特异性条带； 图8是免疫血清效价图，在51200倍稀释时P/N仍大于2. 1 ； 图 9 是标准曲线图，y=0. ΟΟΟδχ+Ο. 5434, R2=O. 9912。
具体实施方式
实施例1重组朊蛋白PrFes的制备
(1)制备重组朊蛋白PrFes基因的人工合成引物为 Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；
(2)提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增条件为预变性95°C2分钟，变性93°C 50秒，退火56°C 45秒，延伸72°C 1分钟，30个循环，最后72°C延伸10分钟，获得目的基因，克隆至PMD-IST-Simple载体上，酶切鉴定，目的基因核苷酸序列见SEQ ID UfI^rPlres基因片段插入表达载体pET-TRX和PET-HIS中构建重组表达质粒，pET_TRX_ PrPres, pET-HIS-PrPres ；
(3)将重组表达质粒pET-TrS-PrPlres和PET-His-PrPlres转化BL21(DE3)中进行表达， 得到重组融合朊蛋白PrFes-Trx和PrFes-His, PrPres-Trx作为免疫原免疫动物，PrPres-His 包被ELISA板后作为检测源用来筛选单抗。实施例2重组朊蛋白PrFes的大量制备和切胶回收
表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于LB培养基(50mg/L抗生素)。37°C剧烈摇荡培养至0D600=0. 6时，加入终浓度为lmmol/L的IPTG进行诱导，220r/min，剧烈摇培4h。离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE 分别检测全菌、上清和沉淀，发现I^rFes-Trx和PrFes-His分别以包涵体的形式大量表达。切胶纯化方法，取500 μ L包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE。将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h，将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来，置于蒸馏水中在脱色摇床上摇20 min，脱去NaAc。之后将切下来的胶放在密封透析袋内，之后以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后， 用PEG20000进行浓缩，然后做透析去除小分子。经SDS-PAGE和flfestern blot鉴定后，分装后放入-80度冰箱备用。实施例3动物免疫
以复性的重组朊蛋白PrPres-Trx免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔3周后，采用弗氏不完全佐剂 (1:1)乳化抗原，进行第2、3次免疫，最后加强免疫时，直接用免疫原进行腹腔注射。实施例4间接ELISA的建立
分别以重组成熟朊蛋白PrPres-His和空载体菌体蛋白pET-His包被酶标板孔，以测定PrPres-Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定 492 nm光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为抗原的最适合包被浓度为 25μ g/ml，4°C包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育lh，以此建立了间接ELISA筛选方法。实施例5阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测
取加强免疫3d后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5:1在PEG1500的作用下融合，以建立的间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌的抗体为“3C6”，2011年12月7日其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5556，分类命名产朊蛋白单克隆抗体细胞株，并用间接 ELISA法检测连续培养30代以及冻存5个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌单克隆抗体的稳定性。实施例6单抗生物学特性的鉴定
按试剂盒说明书操作，鉴定单克隆抗体为IgG2b型，以10%的梅花鹿脑勻浆包被Elisa 板，以纯化后单抗(1 μ g/ml)检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照。在 492nm下读值，该单克隆抗体反应孔与阴性孔P/N在1观00倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力。实施例7兔抗重组朊蛋白PrFes多克隆抗体的制备
用重组梅花鹿朊蛋白PrFe-Trx所得重组梅花鹿朊蛋白免疫雌性家兔，皮下3点注射， 免疫剂量Img/只/次，间隔14d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂，第3次免疫后14天心脏放血，37 0C放置1小时后，4°C过夜，次日3000 转离心15分钟，却上清，辛酸-硫酸铵法纯化兔多抗血清，纯化后的IgG用PBS透析3次， 用BCA法测定蛋白浓度，-80°C冻存。实施例8兔抗重组朊蛋白PrFes多克隆抗体的纯化采用辛酸一硫酸铵法，操作步骤如下
(1)将血清用滤纸过滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0) 稀释后，用NaOH调pH值至4. 5 ；
(2)逐滴加入正辛酸(终浓度75μ L/mL)，室温下搅拌30分钟后，以6000 8000 r/ min离心30分钟，收集上清液；
(3)上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10XPBS(0.1 mol/L, pH7. 4)按10 1比例混合，调PH至7. 4，置冰浴冷至4°C ；
(4)每毫升上述混合液加0.277g固体硫酸铵，4°C搅拌30分钟，以4000 6000 r/ min离心15-20分钟，将沉淀溶于少量PBS，在2000倍体积的PBS中透析，透析结束后，酶标仪测定蛋白浓度并分装、冻存。实施例9兔抗重组朊蛋白PrFes多克隆抗体最佳稀释度和单抗最适工作浓度的确定
采用棋盘方阵滴定法，同时确定多抗最佳包被稀释度和单抗的最适工作浓度，具体方法如下以pH9. 6的碳酸盐缓冲液将兔多克隆抗体稀释，浓度分别为20 μ g/ml、10 μ g/ml、 5 μ g/ml,2. 5 μ g/mlU. 25 μ g/ml,0. 625 μ g/ml,0. 3125 μ g/ml 包被酶标板，4°C 12 小时。洗涤后封闭液封闭2小时。洗涤后加入1 μ g/mL PrPres-Trx溶液，以PBS作为阴性对照，37°C 温育1小时。洗涤后加入单抗3C6，稀释倍数分别为5. 0 μ g/mL，2. 5 μ g/mL，2. 0 μ g/mL， 1. 25 μ g/mL, 0. 625 μ g/mL, 0. 3125 μ g/mL, 0. 1 μ g/mL,以商品化朊蛋白单克隆抗体 SAF31 (Pierce公司)作为阳性对照，然后分别进行检测，根据P/N值结果确定最佳多抗包被浓度为5 μ g/ml稀释和单抗最适工作浓度为1. 25 μ g/mL。实施例10包被多抗和单抗作用条件的确定
以最适多抗包被稀释度包被酶标板，分成4组，第1组4°C包被M小时；第2组4°C 包被12小时；第3组37°C包被2小时后4°C包被12小时；第4组37°C包被2小时；之后将包被好的酶标板洗涤三遍，洗涤后，37°C封闭2小时，再次洗涤，加入1 μ g/mL PrPres-Trx 溶液，37°C孵育1小时，洗涤，以PBS溶液作为阴性对照，加入单抗3C6，37°C分别作用2小时、1.5小时、1小时和30分钟，37°C孵育1小时，然后分别进行ELISA检测，根据P/N值结果确定最佳多抗包被条件为4°C包被12小时，最佳单抗作用时间为37°C分别作用1小时。实施例11封闭液的确定
用最佳的多抗包被稀释度和包被条件包被酶标板，洗涤后，分成6组。第一组用3%BSA 封闭；第二组用3%明胶封闭；第三组用10%脱脂乳封闭；第四组3%酪蛋白封闭 ’第五组3%BSA + 3%明胶，然后进行ELISA试验检测，根据P/N值结果确定最佳封闭液为第五组 3%BSA + 3% 明胶。实施例12封闭时间的确定
用最佳的多抗包被稀释度和包被条件包被酶标板，洗涤后，加入之前中选定的封闭液， 200 μ L/孔，分成5组。第一组37°C封闭4小时；第二组37°C封闭2小时；第三组4°C 12 小时；第四组37°C 4小时后4°C 12小时；第五组37°C 2小时，4°C小时。然后按步骤进行 ELISA试验检测，根据P/N值结果确定最佳封闭时间为37°C封闭2小时。实施例13标准曲线的制作
按以上优化的实验最佳条件，取 8. 0,16. 0,32. 0,64. 0,128. 0,256. 0,512. 0,1024. 0 ng/mL的朊蛋白商品化标准品)标准液，每个浓度设两个平行孔，按照W010]制定的双抗夹心ELISA试验程序进行检测，以在0D492nm下测得的值与阴性值对照比值小于2. 1 时，最低朊蛋白PrP标准品浓度设为最低检测限，对测定数据进行回归分析，得出回归方程和标准曲线，回归方程为y=0. ΟΟΟδχ+Ο. 5434，R2=O. 9912，其中X=PrP (稀释浓度)，y轴是OD 值，最低检测限为25ng/ml。实施例14 一种梅花鹿朊蛋白双抗夹心ELISA检测方法的使用
(1)加入ΙΟΟμL浓度为5μ g/ml兔抗重组梅花鹿朊蛋白PrPres-His多克隆抗体包被 ELISA反应板，4°C孵育12小时；
(2)取梅花鹿脑组织0.5g,加入4. 5ml组织蛋白裂解液，制备成10%组织勻浆。每1毫升组织勻浆加入IOmg蛋白酶K，37°C孵育1小时；
(3)取出包被后的ELISA板用TBST洗5次，每次5分钟；
(4)每孔加入300μ L封闭液:3%BSA + 3%明胶，37°C孵育2小时；
(5)用TBST洗5次，每次5分钟;
(6)每孔加入100μ L待检组织勻浆，37°C孵育1小时；
(7)用TBST洗5次，每次5分钟;
(8)每孔加入100μ L浓度为1. 25 μ g/ml辣根过氧化物酶标记的鼠抗重组梅花鹿朊蛋白单克隆抗体3C6，37°C孵育1小时；
(9)用TBST洗5次，每次5分钟；
(10)加入底物，37°C避光孵育10分钟；
(11)每孔加入50μ L 2M硫酸终止反应；
(12)读板，记录OD值;
(13)根据标准曲线，计算组织勻浆中梅花鹿朊蛋白的含量。
权利要求
1. 一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法，其特下在于包括下列步骤(一)、鼠抗重组朊蛋白PrFes单克隆抗体的制备如下(a)、重组朊蛋白PrPres的制备(1)制备重组朊蛋白PrP"s基因的人工合成引物为Fff: GGG AAT TCC ATA TGA AGA AGC GAC CAA AAC CTG ； RV: CGGATC CGA ACT TGC CCC TCG TTG GTA ；(2)提取梅花鹿总基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因，克隆至 PMD-18T-Simp 1 e载体上，将PrFes基因片段插入表达载体pET_Trx中构建重组表达质粒，pET-Trx- PrPres ；将PrFes基因片段插入表达载体ρΕΤ-His中构建重组表达质粒， pET-His- PrPres ；(3)将重组表达质粒ρΕΤ- χ-PrPlres和pET-His- PrPlres转入BL21 (DE3)中进行表达， 得到两种重组融合朊蛋白I^rFes-Trx和PrFes-His,表达条件为阳性克隆培养物以1%接种于LB培养基(50mg/L抗生素)，37°C剧烈摇荡培养至0D600=0. 6时加入终浓度为lmmol/L 的IPTG进行诱导，220r/min剧烈摇培4h，离心收集菌体，菌体重新PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现ft~Pres-Trx 和PrFes-His分别以包涵体的形式大量表达；(4)切胶纯化方法，取500μ L包涵体提取液处理后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE，将胶浸入2 mol/L NaAc溶液中在摇床上染色1 h，将染成银白色的含目的蛋白胶切割下来，置于蒸馏水中在脱色摇床上摇20 min,脱去NaAc，之后将切下来的胶放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后， 用PEG20000进行浓缩，做透析去除小分子，经SDS-PAGE和flfestern blot鉴定后分装后放入-80度冰箱备用；(b)鼠抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体的制备(1)动物免疫以复性的重组朊蛋白PrPres-Trx免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，100 μ g/只，皮下分点注射，首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔3周后，采用弗氏不完全佐剂 (1:1)乳化抗原，进行第2、3次免疫，最后加强免疫时，直接用免疫原进行腹腔注射；(2)间接ELISA筛选方法以及阳性杂交瘤判断标准的建立分别以重组成熟朊蛋白PrPres-His和空载体菌体蛋白pET-His包被酶标板孔，以测定PrPres-Trx免疫血清效价，以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，分别测定 492 nm光吸收值，经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为抗原的最适合包被浓度为 25μ g/ml，4°C包被过夜；阳性和阴性血清最佳工作浓度为1:800，37°C孵育Ih ； HRP二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育lh，以此建立了间接ELISA筛选方法；(3)阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测取加强免疫3d后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5 1在PEG1500的作用下融合， 以建立的间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，通过多次克隆化和筛选后，获得一株能分泌单克隆抗体的为“3C6”，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No. 5556，分类命名产朊蛋白单克隆抗体细胞株，并用间接ELISA法检测连续培养30代以及冻存5个月复苏后的阳性杂交瘤细胞的上清液，确定其分泌抗体的稳定性；(4)单克隆抗体生物学特性的鉴定按试剂盒说明书操作，经鉴定该单克隆抗体为IgG2b型，以10%的梅花鹿脑勻浆包被 Elisa板，以3C6纯化后单抗(1 μ g/ml)检测，同时以SP2/0细胞上清和鼠阴性血清为阴性对照，在492nm下读值，3C6反应孔与阴性孔P/N在1观00倍稀释条件下仍大于2，说明该单克隆抗体具有识别天然结构梅花鹿朊蛋白的能力；(二)、兔抗重组朊蛋白PrFes-HiS多克隆抗体的制备用重组朊蛋白I^rPres-HiS免疫雌性家兔，皮下3点注射，免疫剂量Img/只/次，间隔14d 免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂，第3次免疫后 14天心脏放血，37°C放置1小时后，4°C过夜，次日3000转离心15分钟，去上清，辛酸-硫酸铵法纯化兔多抗血清，纯化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法测定蛋白浓度，_80°C冻存；(三)梅花鹿朊蛋白的检测步骤如下(1)加入100μ L浓度为5 μ g/ml兔抗重组梅花鹿朊蛋白PrFes-His多克隆抗体包被 ELISA反应板，4°C孵育12小时；(2)取梅花鹿脑组织0.5g,加入4. 5ml组织蛋白裂解液，制备成10%组织勻浆，每1毫升组织勻浆加入IOmg蛋白酶K，37°C孵育1小时；(3)取出包被后的ELISA板用TBST洗5次，每次5分钟；(4)每孔加入300μ L封闭液3%BSA + 3%明胶，37°C孵育2小时；(5)用TBST洗5次，每次5分钟；(6)每孔加入100μ L待检组织勻浆，37°C孵育1小时；(7)用TBST洗5次，每次5分钟；(8)每孔加入100μ L浓度为1. 25 μ g/ml辣根过氧化物酶标记的鼠抗重组梅花鹿朊蛋白单克隆抗体3C6，37°C孵育1小时；(9)用TBST洗5次，每次5分钟；(10)加入底物，37°C避光孵育10分钟；(11)每孔加入50μ L 2M硫酸终止反应；(12)读板，记录OD值;(13)根据标准曲线，计算组织勻浆中梅花鹿朊蛋白的含量。
全文摘要
本发明涉及一种梅花鹿朊蛋白免疫学检测方法，属于生物检验检疫领域。制备鼠抗重组朊蛋白PrPres单克隆抗体、兔抗重组朊蛋白PrPres-His多克隆抗体，采取的包被抗体为兔抗梅花鹿重组朊蛋白PrPres-His多克隆抗体、检测抗体为鼠抗梅花鹿重组朊蛋白PrPres单克隆抗体，所用的Elisa的方式具有准确度高的优点，同时所受环境的限制较少，本发明可应用于制备梅花鹿朊蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒。
文档编号G01N33/577GK102565410SQ201210009078
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者任洪林, 刘 东, 卢士英, 周玉, 宋杰, 张茂林, 李兆辉, 李岩松, 柳增善 申请人:吉林大学