用于检测脑病的方法

专利名称：用于检测脑病的方法
用于检测脑病的方法
技术领域：
本发明主要涉及一种用于增强细胞朊病毒蛋白Prpe的PrpSe亚型的低聚和
/或感染性滴度的方法。本发明还涉及所述方法在脑病，尤其是包括牛海绵状
脑病(BSEs)的可传播性亚急性海绵状脑病(TSSEs)的诊断、表征、临床监
测等方面的应用。
朊病毒病或者可传播性亚急性海绵状脑病(TSSEs)是影响人类和动物的 致死性神经退行性症状。TSSEs基本上包括人类的克-雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD)，绵羊和山羊的羊搔痒症和牛的牛海绵状脑病(BSE)。其它脑 病已经被证明存在于猫科动物、貂或者某些野生动物如鹿或驼鹿中。
造成这些疾病的传染性病原体是非传统性的。目前，主要的假说是"朊病 毒"，根据该假说，由宿主生物体所合成的细胞朊病毒蛋白Prpe能够采用被称 作PrpSe的病理构象，其表示"羊搔痒症"亚型。
上述两种亚型具有相同的氨基酸序列，但是二级结构不同PrP"具有明 显较高含量的(3-折叠片层，而正常PrP (PrPe)具有较多的(x-螺旋。
两种生化特性通常使得可以区分上述两种亚型
- 1^"对蛋白酶有部分抗性，尤其是对蛋白酶K (PK)，所述蛋白酶产生 其N-末端切割。PK作用以后，Prpse通常由于双糖基化型的表观分子量被称作 PrP27-30:通常认为常见菌株的PrPSe切割位点位于89和90氨基酸之间 (PmsinerS.B.等，Cell, (1984) ，38,127-134)，
-PrpSe不溶于非离子洗涤剂，例如TritonX100或Triton 114。
原则上，正常形式的朊病毒蛋白(PrpG)被蛋白酶完全降解并且在存在非 离子洗涤剂时完全溶解。
Prpse在罹患TSSE的人或动物脑中的积累造成脑的退化。由于在欧洲的疯 牛病危机和克-雅病出现在人类中的新变种(vCJD)，对这些疾病的研究显示 出研发上的显著增加。结果是对于这些非传统性的传染性病原体的理解获得了 进展。然而，目前还不存在用于治疗罹患CJD的患者的治疗方法，也没有用 于早期诊断的检测。在过去这十多年来，己经鉴定了一些具有"抗-朊病毒"活性以及创新的化学结构的分子，例如(i)树枝状大分子(dendrimers ) (Supattapone S.筝，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 14529-34); (ii)叶啉和酞菁的衍生物(CaugheyW.S.等,Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1998) 21,12117-22); (iii) 阿的平的衍生物和氯丙嗪的衍生物(Doh-Ura等，J Virol (2000) 74,4894-7),(Korth C等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2001) 98， 9836-41 )。这些药物能 够部分或者全部地消除慢性朊病毒感染的ScN2a小鼠神经母细胞瘤的传染性。 然而，其在体内的作用非常有限(DemaimayR等，J Gen. Virol (1994) 75， 2499-503; Priola SA等，Science (2000) 287, 1503-6)。这些产品在体内缺乏 有效性的原因可能是因为对这些药物的作用机制所知不多或者根本不知道，所 以其对于感染性病原体缺乏特异性，以及这些产品在穿过血脑屏障时有困难。 为了鉴定"抗-朊病毒"产品所进行的药物筛选研究也导致鉴定出两种化 合物，即2-氨基-6-[ (2-氨基苯基)硫]-4- (2-呋喃基)吡啶-3，5-二腈和 N，-l- ({5-[ (4,5-二氯-lH-咪唑-l-基)甲基]-2-呋喃基}羰基)-4-甲氧基苯-1-磺 酰肼，其在细胞培养物中表现出抑制活性(PerrierV.等,Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A. (2000) 97; 6073-6078)。然而，所获得的这些产品的IC5Q值(细胞 中PrP"含量的50%被抑制的浓度)达到15pM的数量，并未被发现适合于体 内应用。而且，Etessami等(Biochem. Biophys. Res. Comm., 2005， 330:5)也观察到核苷酸释放到破损细胞的细胞外培养基中易于减少朊病毒的从头感染。 对于诊断，最近的方法是基于利用Prpse的部分蛋白酶抗性，对于感染性病原体相关的异常PrP (PrPSe)进行选择性检测。在此方面，可以区别-Western印迹法，其基于对组织提取物中的PrPSe进行免疫检测，使用蛋 白酶处理提取物以便破坏正常PrpG亚型后，利用电泳从提取物中分离蛋白， 将其转移到聚合物膜上，并用识别PrP的特异抗体检测(SchallerO.等，Acta Neuropathol.， 1999,98,437-443)，禾口-ELISA检测法，其也包括使用蛋白酶处理组织提取物。 在这些包括使用蛋白酶处理组织提取物的各种试验中，可以提及 -由Serban等(Neurology, 1990， 40, 100)所描述，其发展了用于检测PrPSc 的试验，其包括在硝酸纤维素膜上固定蛋白，然后用蛋白酶消化、变性，和用单克隆抗体进行免疫检测，
-由Oesch等(Biochemistry, 1994， 33, 5926-5931)所描述，为了量化PrPSc， 其提出免疫渗滤法(ELIFA或酶联免疫渗滤法)用于纯化PrpSe，
-由Gratwohl K.U.等在J. Virol. Methods, 1997, 64, 205-216所描述，其提出 ELISA检测法。在用蛋白酶K处理样品和通过离心纯化PrpSe以后，将纯化后 的Prpse吸附到微量滴定板上并使用兔多克隆抗体检测，
-由Safar J.等在Nature Med.， 1998， 10， 1157-1165所描述，其没有使用蛋白 酶K，并根据其是否预先进行变性处理比较固定在固相支持物上的PrP&的免 疫反应性。
最近，文献WO 01/35104提出了一种试验，包括在调节到使得Prpe蛋白 彻底降解而同时保留Prpe蛋白全部或者部分重复的八肽模体的条件下，连续 地用蛋白酶K处理假定含有PrPSe的样品，随后将因此被处理的所述样品与配 体相接触，尤其是八肽模体的特异抗体，和对重复八肽模体-配体复合物的可 能的检测。
WO 02/04954描述了用于检测朊病毒的方法，其使用通过将异常PrP与已 知量的正常PrP相接触增强Prpe蛋白的步骤。
通常，这些各种试验具有缺乏灵敏性的缺陷，并因此产生假阴性。另外， 其是在死后进行的。
事实上，对血液或尿中的朊病毒的早期检测需要比目前存在的检测灵敏性 高10 100倍的检测。另外，对于异常亚型PrpSe的特异性是产生有效检测的 必要条件。
因此，仍旧需要用于检测脑病的新方法，尤其是可以在生物体中被应用的 方法，其是快速的并且使得可以在最初阶段检测病理。
本发明的一个目的是准确地提出一种用于脑病诊断的新方法，其使得可以 建立人类或动物疾病的早期(即生前)诊断并且是无创的。
根据本发明的一个方面，本发明主要针对于一种用于选择性地增强PrP细 胞朊病毒蛋白的至少一种亚型PrpSe的低聚和/或增加感染率的方法，在适宜的 时候在与PrpSe亚型的混合物中，其特征在于，该方法包括在适于增强的情况 下，将所述PrP&亚型与有效量的至少一种通式I的化合物放在一起<formula>formula see original document page 8</formula>其中A， R和n如下文所限定。根据本发明的另一方面，本发明针对于一种用于检测细胞朊病毒蛋白PrPe 的Prpse亚型的方法，包括至少实施如上所限定的方法和检测所述亚型的步骤。 该检测步骤可以通过诸如杂交或抗体/抗原相互作用类的筛选方法而进行。根据本发明的另一方面，本发明涉及一种用于检测在动物或者人类个体中 存在脑病或发生脑病风险的方法，所述方法包括至少-在适于增强可能存在于所述样品中的Prpse亚型低聚的条件下，将来自所 述个体的生物样品与有效量的至少一种如上所限定的通式I的化合物放在一 起，禾口-检测所述PrP&亚型可能的存在，显示在所述个体中脑病的存在或者患脑 病的风险。根据本发明的方法尤其对检测可传播性亚急性海绵状脑病(TSSEs)有用， 并且特别是人类的克-雅病，绵羊和山羊的羊搔痒症和牛海绵状脑病。根据一个具体实施方式
，通式I的化合物可以与适于发光检测或者利用亲 和检测的标记物相关的形式被使用。根据本发明的另一个具体实施方式
，所述检测步骤包括免疫检测方法，尤 其是使用特异性抗体。根据该第二种变化，所述检测包括至少用蛋白酶，例如蛋白酶k处理全部 或者部分所述样品以便破坏正常PrP亚型，分离蛋白和检测PrP"亚型可能的 存在，尤其是使用特异性抗体。破坏正常PrP亚型的步骤通常在增强PrpSe亚 型低聚的步骤后进行。对人PrP的序列157 161特异的抗体SAF60和SAF69，以及对人PrP的 序列156 162特异的抗体SAF70的混合物尤其适合于该检测。类似地，使用蛋白酶K的处理可以在如文献WO 01/35104所描述的条件 下进行，其导致PrpSe蛋白完全降解而同时保留Prpse蛋白全部或者部分的重复 八肽模体。在此种情况下，可以通过随后将因此处理的所述样品，尤其是八肽模体与配体接触进行检测，以检测重复八肽模体-配体复合物可能的存在。根据本发明的再一个方面，本发明涉及一种用于选择性扩增至少一种 PrpSe亚型低聚物的试剂盒和也涉及用于诊断TSSEs的试剂盒，包括至少一种通式I的化合物作为试剂。出人意料地，发明人观察到通式I的化合物证明对于选择性的扩增细胞朊 病毒蛋白的Prpse亚型低聚物尤其有效，尤其是其非病理形式存在时。因此， 通式I的化合物具有增加PrPSe的寡聚形式而不增加正常PrPSe亚型寡聚形式的 特性。很显然，根据本发明的化合物特异地作用于PrpSe分子。对其使得能够在早期诊断发生脑病的风险而言，这一能力尤其有益。从今以后，通过在生物样品中选择性扩增使用常规诊断方法未检测到的 PrpSe亚型，可以在相当早期检测出来。出于显而易见的原因，该早期诊断仅仅可以对治疗和经济而言有益，和就 公共健康而言以及对于卫生安全组成了主要的需求。因此，本发明使得可以发展一种用于在诸如尿和血液的生理体液中检测朊 病毒的试验，用于羊搔痒症和牛海绵状脑病的临床前诊断，和因此检测能够通 常进入食物链的患病动物。另外，根据本发明用于血液样品的方法对于人类输血提供了更好的保证和 使得可以建立一种用于早期诊断人类TSSEs的试验，或者甚至优化今后的治 疗。如上所说明，本发明基于使用如下通式I的化合物<formula>formula see original document page 9</formula>其中-A表示-C (H) xR广，-CO-， C (H) xO (R。， -C (H) XS (R。 -， -CN (R,) (R2)-基团，其中x是0或l，和R,和R2相互独立地表示氢原子，饱 和或不饱和的、线性的、分支或环状的C, C6的烷基，其在适宜的时候被取 代，-符号U表示所述的嘧啶环可以是饱和、不饱和或者芳香的，
-R表示选自下述的基团 -氢原子，
-OR'" N (R，)(R，2)， SR，,基团，其R、和R，2相互独立地表示一如 上对R,和/或112所限定的基团，
-饱和或不饱和、线性的、分支或环状的Q Cn)的烃基，其烃链在适宜 的时候被一个或多个选自S，O和N的杂原子所插入，和在适宜的时候被取代，
-n是0或者是1 3的整数， -和其盐、溶剂化合物、异构体或衍生物。
根据一个实施方式，当R基团出现在嘧啶环的N原子上时，其是氢原子。 至于所述化合物的盐，只要发现其适合于实施本发明，其可以是任何无机 盐或者有机盐。
至于所述化合物的衍生物，为了本发明的目的，其可以更尤其是在其结构 中插入至少一个实体的通式I化合物，所述实体可以属于或者不属于标记体系， 能够提供该化合物一种检测方法，例如发光检测，诸如在红外范围内可见的信 号或者利用诸如铕的荧光，或者通过亲和检测，例如在链酶亲和素/生物素识 别的情况下的生物素标记。
通常是化学物的所述实体意图提供通式I化合物一种用于检测的标记的方 法，该实体可以通过常规方法被附着到通式I分子上。
当然，选择其位置以便不影响因此获得的通式I的衍生物所期望的反应性。
更具体而言，所述嘧啶环是一个芳香环。
根据一个实施方式，当所述嘧啶环是一个芳香环时，R在基团A的间位 或对位上。
根据一个具体实施方式
，n是l。
至于A，其尤其是-CS (R,)-模体，其R,表示如前所定义的烷基。 R优选地表示插入了一个或两个选自S， N和O原子的杂原子的不饱和或 芳香的C5 Q杂环基。
其尤其是一噻吩基团，其在适宜的时候被取代。作为适宜的取代基，尤其可以提及卤素原子，其尤其选自氟、溴、碘和氯
原子，和尤其是溴；OH， OR，， NR，R"， SR，禾flR，，其R，和R"分别独立地表 示线性或分支的C, d。的烷基；饱和、不饱和或芳香的C4 C8，尤其是Cs C6的杂环基团，其可选择地被取代，包括一个或多个选自N， O和S的杂原 子，例如噻吩基团，苯硫基或噻唑基。
根据一个具体实施方式
，取代基可以有益地选自溴或噻吩基。 作为通式I化合物的非限制性代表，尤其可以提及具有下述通式的4-(5-溴 -2-噻吩基)-2-(甲硫基)嘧啶
气>H H
和具有下述通式的4- (5-噻吩基-2-噻吩基)-2-(氨基)嘧啶
和其盐或衍生物。
考虑到其对于Prpse亚型的反应性，通式I化合物明显地具有结合至少一 种氨基酸的能力。
不希望被任何理论所约束，可以看出根据本发明的化合物被发现能够结合
下述PrP蛋白C-末端部分的两个区域中的至少一个
-位于连接H2和H3螺旋的二硫桥的区域(残基Cys 179和Cys 214)， -位于Hl螺旋(包括残基144 154)的区域，其位于晶体结构的PrP 二
聚体界面处。
通常通过用有效量的通式I化合物培育假定被感染或未被感染的细胞来进 行扩增。在适于扩增的条件下进行这种培育，通常是在37。C、生理pH下，培 育足够长的时间，其可以达到大约3天。
、义对于本发明的目的，术语"有效量"指观察到至少一种可能存在于作为分析对象的生物样品中的PrpSe亚型的低聚扩增的至少最小量和足够量。出于显而易见的原因，取决于诊断方法所需灵敏度和/或PrpSe亚型最初存在的量，这一有效量可以显著不同。例如，该浓度可以是0.1 20pM。关于免疫检测Pr]pse亚型的方法，后者可以通过诸如杂交或抗体/抗原反应的常规筛选方法而进行。此种处理需要使用常规的物理、机械或化学方法预先 裂解细胞。根据本发明的一个变化，经历了根据本发明的扩大方法的细胞溶解可以在检测PrPSe亚型之前用蛋白酶，和尤其是蛋白酶K进行部分酶切，以便除去PrPe 分子和因此只保留生物样品中的Pri^亚型。随后通过尤其是免疫印迹类的简 单的常规分析法可以检测这些PrpS、亚型的存在。例如，所述PK处理可以按下述方式进行对最终体积400 pl中总共200pg 蛋白，每50或25叫蛋白用1吗PK在37。C酶切lh。根据本发明的一个具体实施方式
，使用蛋白酶K的这一处理也可以在文 献WO 01/35104所描述的条件下进行，其内容以参考的方式被引用到本申请 中。这一处理针对于完全降解正常PrPG亚型而同时保留PrPSe的全部或者部分 重复八肽模体，不考虑非常规可传播性因子(UTA)的菌株。需要指出一些参数是相互紧密关联的，蛋白酶K的浓度直接依赖于处理 样品的持续时间(培育时间)因此可以认为，例如在37°C，用浓度介于30 和200pg/ml的PK培育10%的组织匀浆10分钟等价于用浓度介于10和 70pg/ml的PK培育10%的组织匀浆30分钟。例如，用浓度是25pg/ml的PK 培育30分钟等价于用浓度是75吗/ml的PK培育10分钟。关于使用通式I化合物的衍生物，即用标记的方法，可以根据所选标记所 推荐的标准条件进行检测。本发明的主题也是一种用于实施根据本发明的方法的诊断试剂盒，其特征 在于其包括至少一种通式I化合物作为试剂。根据本发明的另一方面，本发明涉及一种用于诊断TSSE的试剂盒，其特 征在于其包括结合PrP细胞型蛋白的配体的至少一种通式I化合物，和尤其是结合Prpe亚型的配体。更具体而言，其是一种抗体，其可以是单克隆或者不 是单克隆的，或者是单克隆抗体的混合物。所述抗体尤其被Nishida等(J. Virol， 74:320-325, 2000)所描述和由Spibio 公司出售。其也在专利WO 01/35104中被描述。根据本发明的另一方面，本发明涉及一种用于诊断TSSE的试剂盒，其特 征在于其包括以带有标记体系的衍生物形式的至少一种通式I化合物。该标记 可以适于尤其是荧光的发光检测，或者亲和检测，例如链酶亲和素/生物素对。下面出现的实施例和附图是以对本发明领域非限制性说明的方式给出 腿-

图1说明了根据本发明的化合物A对来自感染的N2a58/22L细胞的PrpSe 的活性。在用蛋白酶K处理以后，利用免疫印迹进行分析(0)=未处理细胞， D二单独用溶剂处理的细胞(DMSO)， CR-刚果红，T1和T2是两个无效对照 化合物)。-图2说明了根据本发明的化合物A对来自感染的N2a58/22L细胞的PrPSt; 的剂量效应活性。在用蛋白酶K处理以后，利用免疫印迹进行分析。使用0.1 2(VM的浓度范围检测化合物A以建立剂量效应曲线(0)=未处理细胞，数字 0.1 20对应于所使用的产品浓度(按pM))。-图3报道了根据本发明的化合物A对来自未感染的N2a58细胞的PrPe 的作用。利用免疫印迹进行分析(数字1 10pM对应于在用细胞培育时所使 用的产品A的浓度)。-图4说明了化合物A对来自感染的N2a58/22L细胞的PrPSe的剂量效应活 性。在用蛋白酶K处理以后，利用免疫印迹进行分析。使用浓度5)iM或者2(^M 检测化合物A持续3 14天(Co-未处理细胞，数字5和20对应于所使用的 产品浓度(按)iM))。-图5报道了化合物A对来自未感染的N2a58细胞的PrPe的缺失效应。在 用蛋白酶K处理前或者处理后，利用免疫印迹进行分析。数字5 20pM对应 于在用细胞培育时所使用的化合物A的浓度)。-图6说明了在经过延长的化合物培育14天后，5|aM和20 pM的化合物 A和20 (iM根据本发明的化合物B对来自感染的N2a58/22L细胞的PrPe的作用的比较。在用蛋白酶K处理前或者处理后，利用免疫印迹分析样品。(Co=未处理细胞，数字5和20对应于所使用的产品浓度(按pM))。使用或者是化合物A或者是化合物B作为通式I化合物进行该检测法， 所述化合物A即由Maybridge公司以目录号ACD 30432出售的4- (5-溴-2-噻 吩基)-2-(甲硫基)喷啶，化合物B即由Maybridge公司以目录号SEW 02312 出售的4- (5-噻吩基-2-噻吩基)-2-(氨基)嘧啶。实施例1、对朊病毒慢性感染的细胞培养物的体外筛选在由22L朊病毒株系(在小鼠中稳定的羊搔痒症株系)慢性感染的小鼠 神经母细胞系中体外检测化合物A (NishidaN.等，J. Virol. (2000) 74， 320-325)。该被称作N2a/22L的感染的细胞系产生大量的PrpSe分子，其对于蛋白酶K的局部消化具有抗性和具有使人联想到朊病毒的那些特性。当向小 鼠颅内接种时，被感染的N2a/22L细胞能够造成TSSE。在37。C和5% C02 时，用浓度20 的化合物A与被感染的N2a/22L培育3天。3天以后，在洗涤剂存在下裂解融合细胞。用蛋白酶K (PK)部分酶切相 对于其蛋白质含量标准化的细胞溶解物以便和未处理的对照细胞相比，除去 Prpe分子。重复检测该产品以消除非可重复性作用。在第二步中，使用浓度范围是0.1 20 对化合物A再次检测以确定是 否可以获得剂量效应作用。与未处理的对照相比，在20pM寡聚形式中观察到 信号大约增加了90倍。图1和图2报道了在用蛋白酶K处理以后，利用免疫印迹分析获得的结 果。观察到化合物A显著地增加感染细胞中的PrPSe的量。由于感染的细胞表达Prpe分子和PrP"分子，对化合物A作用于上述两种 亚型中哪一个的问题进行了调查。尤其是迁移到49kDa和98kDa的寡聚物是 否是Prpe寡聚物的问题进行了调查，该PrF寡聚物在与化合物A相互作用后 变得更抗蛋白酶K。为此，在化合物A存在下培育了仅表达Prpe亚型的未感 染细胞。图3给出的结果显示了化合物A不增加细胞中PrPe的低聚。实施例2、化合物A对未感染或朊病毒感染的细胞培养物的作用在N2a58/22L细胞存在下以浓度是5和20pM将化合物A培育14天。 在第3， 7， 11和14天后，利用免疫印迹分析细胞裂解物。 结果显示在感染细胞中长期培育该化合物不诱导出现比培育3天所观察到更大的寡聚形式。也没有观察到有利于更增强大约50 60kDa的寡聚体形式的单聚体形式prpse27-3e的减少(图4)。另一方面，化合物A浓度是20pM时，在第3天所扩增的寡聚形式的比例与第14天相等，这显示在第3天达到了平衡状态，这在浓度是5MM时却非此情况，其在第ll天以后达到平衡。研究了化合物A在正常Prpe朊病毒的蛋白中诱导蛋白酶K-抗性形式出现的作用。在化合物A存在下，对获得自与感染的N2a58/22L细胞相同细胞系的正 常N2a58细胞培育3天。在用蛋白酶消化样品之前或之后进行的免疫印迹分 析不能证明正常朊病毒蛋白PrP的寡聚形式，也没有出现抗蛋白酶K消化的 条带(图5)。这些结果表明化合物A特异地作用于朊病毒蛋白感染性亚型PrPSe的扩增。实施例3、化合物B对未感染或朊病毒感染的细胞培养物的作用在用浓度是5 20pM的化合物B培育3天的N2a58/22L细胞中获得化合 物B的剂量效应曲线，PrP&寡聚形式的量与浓度为IO)li或20pM所观察到的 相同，其表明在5pM时，剂量效应曲线已经达到其平稳期。另外，在培育14天后，在化合物B和A之间的比较动力学显示化合物B具有更强的扩增能力。在用产物B以20 pM的浓度培育细胞14天后，所观察到的寡聚形式的量 比在同样条件下用化合物A所观察到的多。所有这些结果都在图6中被说明。
权利要求
1、一种用于选择性增强细胞朊病毒蛋白PrPc的至少一种PrPSc亚型低聚的方法，其特征在于，其包括在适于扩增的条件下，将所述PrPSc亚型与有效量的至少一种通式I化合物放在一起其中-A表示-C(H)xR1-，-CO-，C(H)xO(R1)，-C(H)xS(R1)-，-CN(R1)(R2)-基团，其中x是0或1，和R1和R2相互独立地表示氢原子，饱和或不饱和、线性的、分支或环状的C1～C6的烷基，其在适宜的时候被取代，-符号表示所述的嘧啶环可以是饱和的、不饱和或者芳香的，-R表示选自下述的基团-氢原子，-OR’1，N(R’1)(R’2)，SR’1基团，其R’1和R’2相互独立地表示如上对R1和/或R2所限定的基团，-饱和或不饱和、线性、分支或环状的C1～C10的烃基，其烃链在适宜的时候被一个或多个选自S，O和N的杂原子所插入，和在适宜的时候被取代，-n是0或者是1～3的整数，-和其盐、溶剂化合物、异构体或衍生物。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在Prpe亚型存在下进行扩增。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，当R基团出现在嘧啶 环的N原子上时，其是氢原子。
4、 根据上述任意-一项权利要求所述的方法，其特征在于，通式I化合物 的嘧啶环是一芳香环。
5、 根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，在通式I中，n是l。
6、 根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，A表示-CS (R。-模体，其R,表示如权利要求1所定义的烷基。
7、 根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，在通式I中，R 表示插入了一个或两个选自S， N和O原子的杂原子的不饱和或芳香的C5 Q杂环基团。
8、 根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，R表示噻吩基 基团。
9、 根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述噻吩基被选自下述 的取代基所取代氟、溴、碘和氯原子；OH， OR，， NR'R"， SR，禾卩R'，其R'和R"分别独立地表示线性或分支的Q Cu)的烷基；饱和、不饱和或芳香的 C4 C8,尤其是C5 C6的杂环基团，其可选择地被取代，包括一个或多个选 自N， O和S的杂原子。
10、 根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述通式I化 合物能够结合至少--种氨基酸。
11、 根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述化合物是 4- (5-溴-2-噻吩基)-2-(甲硫基)嘧啶或者4- (5-噻吩基-2-噻吩基)-2-(氨 基)嘧啶，或者其盐或衍生物。
12、 根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述通式化合 物是以其插入至少一个实体的衍生物的形式，该实体能够提供其检测方法。
13、 根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述实体是适合于发光 检测或亲和检测的标记物。
14、 一种用于检测细胞朊病毒蛋白Prpe的PrpSe亚型的方法，包括实施至 少一种如权利要求1-13中任意一项所限定的方法和检测所述亚型的步骤。
15、 一种用于检卿个体中脑病的存在或发生脑病风险的方法，所述方法包括至少-在适于扩增可能存在的Prpse亚型的条件下，将来自个体的生物样品与有 效量的至少一种如权利要求1和权利要求3-13中所限定的通式I化合物放在 --起，和-检测所述？^&亚型可能的存在，显示在所述个体中脑病的存在或者患脑 病的风险。
16、 根据权利要求15所述的方法，用于检测可传播性亚急性海绵状脑病(TSSE)。
17、 根据权利要求15或16所述的方法，用于检测人类的克-雅病，绵羊 和山羊的羊搔痒症和牛的牛海绵状脑病。
18、 根据权利要求15-17中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述 通式I化合物以带有标记体系的衍生物的形式被使用。
19、 根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述衍生物插入了适于 发光检测或亲和检测的标记物。
20、 根据权利要求15-19中任一权利要求所述的方法，其特征在于，另外 进行了对用蛋白酶处理过的全部或者部分所述样品的处理以破坏正常PrPe亚 型，分离蛋白，并使用特异抗体检测PrpSe亚型可能的存在。
21、 根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所用的蛋白酶是蛋白酶K。
22、 根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，在适于完全降解PrPe 蛋白而同时保留全部或者部分PrpSe蛋白的条件下，用蛋白酶K处理，和随后 进行PrpSe亚型的检测。
23、 一种用于选择性增强细胞朊病毒蛋白Prpe的至少一种PrpSe亚型低聚 的试剂盒，其特征在于，其包括至少一种如权利要求1和3-13所限定的通式I 化合物作为试剂。
24、 一种用于诊断脑病，尤其是动物或人的可传播性亚急性海绵状脑病 (TSSEs)的试剂盒，包括至少一种如权利要求1和3-13所限定的通式I化合物 以带有标记体系的衍生物的形式作为试剂。
25、 一种用于诊断脑病，尤其是动物或人的可传播性亚急性海绵状脑病 (TSSEs)的试剂盒，包括至少一种如权利要求1和3-13所限定的通式I化合物 与特异结合到PrP亚型的配体相结合作为试剂。
26、 根据权利要求24或25所述的试剂盒，其特征在于，其还包括识别 Prpse亚型的抗体或抗体混合物。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测TSSE或朊病毒病的方法。本发明还涉及一种增强细胞朊病毒PrP^Sc亚型低聚的方法。
文档编号G01N33/58GK101248355SQ200680024759
公开日2008年8月20日 申请日期2006年6月7日 优先权日2005年6月7日
发明者卡特琳娜·耶尔瓦尔, 维罗尼克·皮埃尔-罗那尔得, 让-米歇尔·维尔蒂耶 申请人:健康与医药研究学院;国家科研中心