专利名称：施用trkb激动剂治疗不希望的重量减轻或进食障碍的方法
施用TRKB激动剂治疗 不希望的重量減轻或进食障碍的方法发明领域本发明涉及trkB激动剂在治疗和/或预防不希望有的重量减轻、 进食障碍或阿片样物质诱导的呕吐中的用途。发明背景神经营养蛋白是小型同型二聚体蛋白质家族，其在神经系统的发 育和维持中起关键作用。神经营养蛋白家族的成员包括神经生长因子 (NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3 ( NT-3 )、 神经营养蛋白-4/5 (NT-4/5)、神经营养蛋白-6 ( NT-6 )和神经营养 蛋白-7 (NT-7)。神经营养蛋白，类似于其他多肽生长因子，通过与 细胞表面受体相互作用影响其靶细胞。根据现有知识，2种跨膜糖蛋 白充当关于神经营养蛋白的受体。神经营养蛋白响应神经元具有常见 的低分子量(65 - 80 kDa)，低亲和力的受体(LNGFR )，也称为p75NTR 或p75，其以2x10 —9 M的K。结合NGF、 BDNF、 NT-3和NT-4/5;和大 分子量(130 - 150 kDa)，高亲和力(在10—11 M范围中的K。)受体， 其是受体酪氨酸激酶的trk家族的成员。Trk受体家族鉴定的成员是 trkA、 trkB和trkC。BDNF和NT-4/5以相似的亲和力与trkB和p75NTR受体结合。然 而，NT-4/5和BDNF突变型小鼠显示出完全形成对照的表型。尽管 NT-4/5+小鼠是存活和能育的，仅具有轻微的感觉缺陷，但BDNF+小 鼠在出生后的早期阶段时死亡，具有严重的神经元缺陷和行为症状。 Fan等人，Nat. Neurosci. 3 ( 4 ): 350-7， 2000; Liu等人，Nature 375: 238-241， 1995; Conover等人，Nature 375: 235-238， 1995; Ernfors等人，Nature 368: 147-150， 1994; Jones等人，Cell 76: 989-999, 1994。几个出版物报道NT-4/5和BDNF在体内具有不同的生 物活性，并且提出不同的活性可能部分起因于trkB受体及其下游信号 途径经由NT-4/5和BDNF的不同激活。Fan等人，Nat. Neurosci. 3 (4 ): 350-7， 2000; Minichiello等人，Neuron. 21: 335-45， 1998; Wirth等人，Development. 130( 23 ): 5827-38， 2003; Lopez等人， Program No. 38.6， 2003 Abstract, Society for Neuroscience。已显示BDNF和NT-4/5在II型糖尿病模型动物例如C57db/db小 鼠中具有血糖和血脂控制活性和抗肥胖活性。美国专利号6， 391， 312; Itakura等人，Metabolism 49: 129-33 ( 2000 );美国专利申请公开 号2005/0209148; WO 2005/082401。还已显示BDNF在用高脂肪饮食 喂养的小鼠中具有抗肥胖活性和改善瘦素抗性中的活性。美国专利申 请7>开号2003/0036512。 Kernie等人报道BDNF或NT-4/5可以在其 中BDNF基因表达减少的杂合的BDNF敲除小鼠中暂时逆转进食行为和 肥胖。Kernie等人，EMB0 J. 19 ( 6 ) : 1290-300， 2000。已报道在 人trkB上的Y722C置换的从新错义突变导致受损的受体磷酸化和给 MAP激酶的信号；并且这种突变似乎导致独特的贪食性肥胖的人类综 合征。Yeo等人，Nat. Neurosci. 7: 1187-1189 ( 2004 )。BDNF在具有肥胖的人和具有神经性厌食的患者中的循环水平已 得到研究。Monteleone 等人，Psychosomatic Medicine 66: 744-748， 2004; Nakazato等人，Biol. Psychiatry 54: 485-490，2003。 与基于下述发现的预测相反BDNF生产在小鼠中的损害已与增 加的食物摄入、减少的能量消耗和重量增长相关，与不肥胖的健康对 照比较，循环BDNF在神经性厌食患者中明显减少和在肥胖患者中明显 增加。已假定在神经性厌食中，BDNF减少通过促进食物输入，尝试抗 衡导致负平衡的患者的改变的行为；和在肥胖中，增加的BDNF水平可 能代表通过刺激能量消耗和减少食物摄入来抵消正能量失衡的病状的 适应机制。Monteleone等人,Psychosomat ic Medicine 66: 744-748，2004。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的通过提及 在此整体合并入本文，其程度与每个单个出版物、专利或专利申请特
别并个别指出通过提及如此合并一样。发明概述本发明提供了通过外周施用trkB激动剂，包括trkB选择性激动 剂用于增加体重和/或食物摄入的方法。这些方法可以用于治疗或预防 不希望有的重量减轻(例如与恶病质或与衰老相关的)、进食障碍(例 如神经性厌食)和阿片样物质诱导的呕吐。在一个方面，本发明提供了用于增加灵长类动物中的体重的方法， 所述方法包括给灵长类动物外周施用有效量的trkB激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于增加灵长类动物中的食物摄入 的方法，所述方法包括给灵长类动物外周施用有效量的trkB激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防灵长类动物中的恶 病质的方法，所述方法包括给灵长类动物外周施用有效量的trkB激动 剂。在另一个方面，本发明提供了用于改善灵长类动物中的恶病质、 减少灵长类动物中的恶病质的发病率、或延迟灵长类动物中的恶病质 的发展或进展的方法，所述方法包括给灵长类动物外周施用有效量的 trkB激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于治疗灵长类动物中的不希望有 的重量减轻的方法，所述方法包括给灵长类动物外周施用有效量的 trkB激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于改善灵长类动物中的不希望有 的重量减轻、减少灵长类动物中的不希望有的重量减轻的发病率、或 延迟灵长类动物中不希望有的重量减轻的发展或进展的方法，所述方 法包括给灵长类动物外周施用有效量的trkB激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防灵长类动物中的神 经性厌食的方法，所述方法包括给灵长类动物外周施用有效量的trkB 激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于改善灵长类动物中的神经性厌 食、减少灵长类动物中的神经性厌食的发病率、或延迟灵长类动物中 的神经性厌食的发展或进展的方法，所述方法包括给灵长类动物外周施用有效量的trkB激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防个体中的阿片样物 质诱导的呕吐的方法，所述方法包括给个体外周施用有效量的trkB 激动剂。在另一个方面，本发明提供了用于改善个体中的阿片样物质诱导 的呕吐、减少个体中的阿片样物质诱导的呕吐的发病率、或延迟个体 中的阿片样物质诱导的呕吐的发展或进展的方法，所述方法包括给个 体外周施用有效量的trkB激动剂。trkB激动剂进行外周施用。例如，trkB激动剂可以通过下述方式 之一进行施用静脉内、腹膜内、肌内、皮下、肠胃外、经由吸入、 动脉内、心内、心室内和经皮。在某些实施方案中，个体是灵长类动物。在某些实施方案中，灵 长类动物是人。可以用于本文描述的方法的trkB激动剂包括但不限于，BDNF多 肽、NT-4/5多肽、和抗trkB激动剂抗体。在某些实施方案中，trkB 激动剂是人NT-4/5。在某些实施方案中，trkB激动剂是人BDNF。在 其他实施方案中，trkB激动剂是抗trkB激动剂抗体，包括trkB选择 性的抗trkB激动剂抗体。在某些实施方案中，抗trkB抗体是人或人 源化的。在另一个方面，本发明提供了包含有效量的trkB激动剂包括trkB 选择性激动剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。药物組合物可 以用于治疗或预防本文描述的任何疾病。在另一个方面，本发明提供了用于在本文描述的任何方法中使用 的包含trkB激动剂的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含容器， 包含有效量的trkB激动剂的组合物，与药学上可接受的赋形剂组合， 和关于在本文描述的任何方法中使用组合物的说明书。在另一个方面，本发明还提供了用于产生特异性结合并激活受体 的激动剂单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤(a)通过在约
15天内至少2次将免疫原性分子注入哺乳动物内，用包含受体的细胞 外结构域的免疫原性分子免疫宿主哺乳动物。该方法可以进一步包括 下述步骤使来自免疫的哺乳动物的淋巴细胞与永生化细胞系融合， 以产生分泌单克隆抗体的杂交瘤；在允许单克隆抗体分泌的条件下培 养杂交瘤；和选择分泌结合并激活受体的单克隆抗体的杂交瘤。在某 些实施方案中，受体是需要二聚化用于活化的受体。附图简述图l是显示在肥胖的雌性狒狒中每天NT-4/5输注对体重的影响的 曲线图。X轴对应测量体重时的天数，和Y轴对应作为基线(任何治 疗前的体重)的百分比测量的体重。双因素AN0VA用于比较NT-4/5 治疗组和媒介物组。数据指出NT-4/5治疗组的体重明显不同于媒介物 组(F-50. 71， P<0. 0001 ) 。 Bonferroni事后检验分析显示NT-4/5治 疗组(实心三角)与媒介物组(空心方块)之间的显著配对差异。如 曲线图中所示，'指示P〈0. 05;"指示P〈0. 01;和"'指示P<0. 001。图2是显示在肥胖的雌性狒狒中每天NT-4/5输注对食物摄入的影 响的曲线图。X轴对应测量食物摄入时的天数，和Y轴对应每天由狒 狒摄取的饼干数目。双因素ANOVA用于比较NT-4/5治疗组和媒介物组。 数据指出NT-4/5治疗组的食物摄入明显不同于媒介物组(F-262. 5， P<0. 0001 ) 。 Bonferroni事后检验显示NT-4/5治疗组(实心三角) 与媒介物组(空心方块)之间的显著配对差异。曲线图中的实心黑条 指出配对比较导致P<0. 05或更小时的时期。图3是显示在肥胖的雌性狒狒中每周2次NT-4/5输注对体重的影 响的曲线图。X轴对应测量体重时的天数，和Y轴对应作为基线(任 何治疗前的体重)的百分比测量的体重。双因素ANOVA用于比较NT-4/5 治疗组和媒介物组。数据指出NT-4/5治疗组的体重明显不同于媒介物 组(F-34. 81， P<0. 0001 ) 。 Bonferroni事后检验分析显示NT-4/5治 疗组(实心三角)与媒介物组(空心方块)之间的显著配对差异。
指示P<0. 05;和..指示P<0. 01。图4是显示在肥胖的雌性狒狒中每周2次NT-4/5输注对食物摄入
的影响的曲线图。X轴对应测量食物摄入时的天数，和Y轴对应每天 由狒狒摄取的饼干数目。图5是显示在消瘦的食蟹猴中每天NT-4/5和每周聚乙二醇化的 NT-4/5输注对体重的影响的曲线图。X轴对应测量体重时的天数，和 Y轴对应作为基线(任何治疗前的体重)的百分比测量的体重。双因 素ANOVA用于比较NT-4/5治疗组或聚乙二醇化的NT-4/5 (PEG-NT-4/5)和媒介物组。数据指出NT-4/5治疗组而不是聚乙二醇 化的NT-4/5治疗组的体重明显不同于媒介物组(F-54. 98,P<0. 0001 )。 Bonferroni事后检验分析显示NT-4/5治疗组(三角)与媒介物组(方 块)之间，而不是聚乙二醇化的NT-4/5组(倒三角)和媒介物组之间 的显著配对差异。如曲线图中所示，'"指示P〈0. 001。图6是显示在消瘦的食蟹猴中每天NT-4/5和每周聚乙二醇化的 NT-4/5输注对食物摄入的影响的曲线图。X轴对应测量食物摄入时的 天数，和Y轴对应每天由食蟹猴摄取的饼干数目。双因素ANOVA用于 比较NT-4/5治疗组或聚乙二醇化的NT-4/5 (PEG-NT-4/5)和媒介物 组。数据指出NT-4/5治疗组而不是聚乙二，化的NT-4/5治疗组的食 物摄入明显不同于媒介物组(F=33. 82， P<0. 0001 ) 。 Bonferroni事 后检验显示在15、 16、 17、 19、 22、 23、 25和30天时，第NT-4/5 治疗组(三角)与媒介物组(方块)之间，而不是聚乙二醇化的NT-4/5 组(倒三角)和媒介物组之间的显著配对差异(P<0. 05或更小)。图7是显示在消瘦的食蟹猴中每天NT-4/5和每周聚乙二醇化的 NT-4/5皮下注射对体重的影响的曲线图。X轴对应测量体重时的天数， 和Y轴对应作为基线(任何治疗前的体重)的百分比测量的体重。双 因素ANOVA用于比较NT-4/5治疗组或聚乙二醇化的NT-4/5 (PEG-NT-4/5 )和媒介物组。数据指出NT-4/5治疗组的体重明显不同 于媒介物组(F=19. 10， P<0. 0001 ) 。 Bonferroni事后检验分析显示 NT-4/5治疗组(三角)与媒介物组(方块)之间，以及聚乙二醇化的 NT-4/5组(倒三角)和媒介物组之间的显著配对差异。…指示P<0. 001; 和"指示P<0. 01。 图8是显示在雪貂冲NT-4/5的单次注射对吗啡诱导的呕吐的影响 的曲线图。X轴对应注射的药物的类型；和Y轴对应经过注射后60分 钟的时间段的干呕和呕吐次数。单因素AN0VA与Dunnett氏事后检验 用于统计分析。P值在曲线图中指出。图9A和图9B显示由NT-4/5在雪貂后脑部中诱导的c-Fos。图9A 显示在最后区中被抗c-Fos抗体染色的核的数目。图9B显示在背侧迷 走神经核中被抗c-Fos抗体染色的核的数目。
图10显示与人NT-4/5比较，在KIRA测定法中通过各种抗trkB 抗体(36D1、 38B8、 37D12、 19H8 (1) 、 1F8、 23B8、 18H6)的trkB 酪氨酸磷酸化的水平。图ll显示由几种trkB激动剂抗体支持的结状神经元存活的曲线 图。X轴表示加入得自Swiss Webster小鼠的第15天胚胎(E15)结 节性神经元培养物中的抗trkB抗体的不同浓度。Y轴表示铺板后48 小时存活的神经元的数目。每个点是4次测定的平均值，和误差条显 示来自1个标准差的那个平均值的差异。数据指出测试的trkB抗体中 的一些可以支持结状神经元存活，和这些抗体在这种培养条件下的50 %有效浓度(EC50)从小于0. 1到超过10 pM (参见表l)。图12A和图12B是显示在小鼠中颅内注射的抗trkB激动剂抗体对 体重(图12A)和食物摄入(图12B)的影响的曲线图。抗体和NT-4/5 在第0天时进行注射。每天测量体重和食物摄入直至第15天。…指示 与小鼠IgG对照比较P<0. 001;"指示与小鼠IgG对照比较P<0. 01; 和'指示与小鼠IgG对照比较P<0. 05。图13A和图13B是显示在食蟹猴中外周静脉内注射的抗trkB激动 剂抗体对体重(图13A)和食物摄入(图13B)的影响的曲线图。抗体 在第l天时进行注射。体重每周进行监控和食物摄入每天进行监控。 "'指示与对照媒介物比较P>0. 001;"指示与对照媒介物比较P>0. 01; 和'指示与对照媒介物比较p>0. 05。发明详述本发明提供了用于治疗或预防不希望有的体重减轻(例如与恶病
质或与衰老相关的)、进食障碍(例如神经性厌食)、和阿片样物质诱导的呕吐的方法，所述方法包括给个体或受试者施用trkB激动剂。 I. 一般技术除非另有说明，本发明的实践将使用分子生物学(包括重组技术)、 微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些在本领 域的4支术内。此类^L术在文献中充分说明，例如，M /ecw/ar C/o力/z^; j "6or"o T#,",第2版(Sambrook，等人，1989 ) Cold Spring Harbor Press; 0//gooi/c/e"油5>/^Ae"'s(M. J. Gait,编辑1984入.Za6or"ory M^e6ooi" ( J. E. Cellis，编辑1998 ) Academic Press;CW7 ( R. I. Freshney,编辑1987 ) ; //3"o^c〃加Ce// a/2ff 77s飾(7z/"z/re ( J. P. Mather和P. E. Roberts, 1998 ) Plenum Press/ Ce// a/2tf 7Vswe C""wre.. Za6or"ory户rocedi/res Doyle, J.B. Griffiths和D. G. Newell，编辑1993-8 ) J. Wiley 和Sons; /"力ir7/z 0/0^7( Academic Press, Inc. ); 〃a/^6ooi"oT^^er/zzze/^fl/ /咖w7070^7( D. M. Weir和C. C. Blackwell， eds.); (7e/7e 7Va/7S尸er 「ecfors尸ot ^<3/ 边3//3刀Ce/7s ( J.M. Miller和M. P. Calos,编辑1987 ) ; toTe/7f户r"oco/s //3M 7ecu/ar^/o/c^( F.M. Ausube 1 ，等人，编辑19 8 7 ) ; 7 e户o/拜erflC力a //z Aesctio/7，(Mullis，等人，编辑1994 ) ; C""加t户r"oco/s // /咖u/zo/。^7 (J. E. Coligan等人，编辑1991);幼o"/Y"ocoh /力(Wi ley和Sons ， 1999 ) ; /鹏w/2( 6/0/0^7 ( C. A. Janeway和 P. Travers， 1997 ) ; J/7〃60if/es (P. Finch, 1997 ) ; ln〃6od/w a ; rs"/ca/ a/7，ac力(D. Catty.，编辑IRL Press, 1988-1989 ); #ofl￡7c7o"a/ .. a pra"/ca/ a/7/7roac力(P. Shepherd和C. Dean,编辑Oxford University Press, 2000 ); ^//z"力〃6od/w s /a6or"oiy鹏/zi/s7 ( E. Harlow和D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 ); 7力e J/2〃60d/e5(M. Zanetti和J. D. Capra， 编辑Harwood Academic Publishers, 1995 )。 II. 定义如本文所使用的，"治疗"是用于获得有利的或需要的临床结果 的方法。为了本发明的目的，有利的或需要的临床结果包括但不限于，下述中的一种或多种改善与疾病相关的一种或多种症状、减轻与疾 病相关的一种或多种症状的严重度、緩和与疾病相关的一种或多种症 状。例如，对于恶病质和/或不希望有的重量减轻的治疗，有利的或需 要的临床结果包括但不限于，下述中的任何一种或多种的任何改善、 严重度的减轻和/或緩和重量减轻、脂解、肌肉和内脏蛋白质减少、 厌食(即食欲缺乏)、减少的食物/热摄取、长期恶心、疲乏和虚弱。 对于神经性厌食的治疗，有利的或需要的临床结果包括但不限于，下 述中的任何一种或多种食欲改善、食物怨恨减弱、增加重量、维持 正常营养状况、水合和电解质平衡、维持关于年龄和高度的正常体重、 减少住院治疗的次数和持续时间、和减少死亡危险。对于阿片样物质 诱导的呕吐的治疗，有利的或需要的临床结果包括但不限于，减轻恶 心和/或呕吐的严重度和/或缩短恶心和/或呕吐的持续时间，从而允许 阿片样物质诱导的疼痛緩解的完全临床利益。"改善，，疾病或一种或多种疾病症状意指与未施用trkB激动剂比 较，减轻或改善与疾病相关的一种或多种症状。"改善，，还包括缩短 或减少症状的持续时间。"减少疾病的发病率"意指减少严重度(这可以包括减少一般用 于这种病状的其他药物和/或疗法的需要和/或量(例如，暴露于))、 持续时间、和/或频率(包括，例如，延迟或增加个体中到下一次偶发 性攻击的时间)中的任何一种。如本领域技术人员应当理解的，个体 可以在其对治疗的应答方面不同，并且像这样，例如减少疾病在个体 中的发病率的方法反映基于合理的预期施用trkB激动剂，所述合理的 预期是此类施用很可能引起在那个特定个体中发病率的此类减少。如本文所使用的，"延迟"疾病的发展意指延期、阻碍、减緩、 延緩、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可以具有各种时间长度， 取决于疾病史和/或待治疗的个体。如对于本领域技术人员显而易见
的，足够的或显著的延迟事实上可以包括预防，因为个体不发展该疾 病(例如，恶病质、神经性厌食和阿片样物质诱导的呕吐)。"延迟" 症状的发展的方法是当与不使用该方法比较时，在给定时帧中减少发 展症状的可能性和/或在给定时帧中减少症状的程度的方法。此类比较 一般基于临床研究，使用统计上显著的受试者数目。疾病的"发展"或"进展"意指病症的最初表现和/或随之发生的 进展。疾病的发展可以是使用本领域众所周知的标准临床技术可检测 和评估的。然而，发展还指可能是无法检测的进展。为了本发明的目 的，发展或进展指症状的生物学过程。"发展"包括发生、复发和发 作。如本文所使用的，疾病的"发作"或"发生"包括最初发作和/ 或复发。如本文所使用的，药物、化合物或药物组合物的"有效剂量"或 "有效量"是足以实现有利的或需要的结果的量。对于预防用途，有 利的或需要的结果包括此类结果如消除或减少疾病的危险、减轻疾病 的严重度、或延迟疾病的开始，包括疾病的生物化学、组织学和/或行 为症状，在疾病发展期间呈现的它的并发症和中间病理学表型。对于 治疗用途，有利的或需要的结果包括此类临床结果如减少疾病的强度、 持续时间或发作频率，和减少由疾病引起的一种或多种症状(生物化 学、组织学和/或行为)，包括在疾病发展期间呈现的它的并发症和中 间病理学表型，增加患有疾病的那些患者的生活质量，减少治疗疾病 所需的其他药物的剂量，增强另一种药物的效应，和/或延迟患者的疾 病进展。有效剂量可以在一次或多次施用中进行施用。为了本发明的 目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现 预防或治疗性治疗的量。如在临床背景中应理解的，药物、化合物或 药物组合物的有效剂量可以与另 一种药物、化合物或药物组合物结合 或不结合来达到。因此，"有效剂量"可以在施用一种或多种治疗剂 的背景中加以考虑，并且如果与一种或多种其他试剂结合，可以达到 或已达到希望的结果，那么单个试剂可以认为以有效量给予。"个体"或"受试者"是哺乳动物，更优选地人。哺乳动物还包 括但不限于，农场动物、运动动物、灵长类动物(包括人)、马、犬、 猫、小鼠和大鼠。"trkB激动剂"指能够与trkB受体结合并激活trkB受体和/或 由trkB信号功能介导的下游途径的试剂。例如，激动剂可以与trkB 受体的细胞外结构域结合并从而引起受体的二聚化，导致细胞内的催 化激酶结构域激活。随后，这可以导致在体外和/或体内刺激表达受体 的细胞的生长和/或分化。在某些实施方案中，trkB激动剂与trkB结 合并激活trkB生物活性。"生物活性"当与本发明的trkB激动剂结合使用时， 一般指具有 与trkB受体结合并激活trkB受体和/或由trkB信号功能介导的下游 途径的能力。如本文所使用的，"生物活性"包含与由在trkB表达细 胞上的NT-4/5和/或BDNF、trkB天然配体的作用诱导的那些一样的一 种或多种效应子功能。生物活性包括但不限于，下述中的任何一种或 多种结合并激活trkB的能力；促进trkB受体二聚化的能力；在体 外或体内促进细胞(包括受损细胞)发展、存活、功能、维持和/或再 生的能力，所述细胞特别是神经元包括外周(交感、感觉、运动和肠) 神经元，和中枢(脑和脊髓)神经元，和非神经元细胞，例如外周血 白细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞。特别优选的生物活性是当外周 施用时在灵长类动物中增加体重和/或食物摄入的能力，以治疗(包括 预防)灵长类动物中恶病质和神经性厌食的一种或多种症状，和/或治 疗(包括预防)哺乳动物中阿片样物质诱导的呕吐的一种或多种症状。"激动剂抗trkB抗体"(可互换地称为"抗trkB激动剂抗体") 指能够与trkB受体结合并激活trkB受体和/或由trkB信号功能介导 的下游途径的抗体。例如，激动剂抗体可以与trkB受体的细胞外结构 域结合并从而引起受体的二聚化，导致细胞内催化激酶结构域的激活。 因此，这可以导致在体外和/或体内刺激表达受体的细胞的生长和/或 分化。在某些实施方案中，激动剂抗trkB抗体与trkB结合并激活trkB 生物活性。如本文所使用的，"外周施用"或"外周施用的"指在中枢神经
系统(CNS)或血脑屏障(BBB)外将试剂引入受试者内。外周施用包 括除对脊柱或脑直接施用外的任何施用途径。外周施用可以是局部或 系统的。"抗体"是通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一种抗原 识别位点，能够与靶特异性结合的免疫球蛋白分子，所述乾例如碳水 化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所使用的，该术语不仅包 括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(例如Fab、 Fab， 、 F (ab， )2、 Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分(例如结 构域抗体)的融合蛋白、和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任 何其他经修饰的构型。抗体包括任何种类的抗体，例如IgG、 IgA或 IgM(或其亚类)，并且抗体无需是任何特定种类。取决于其重链的恒 定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以归于不同种类。存在5 个主要种类的免疫球蛋白IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM，并且这些中 的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2。对应免疫球蛋白的不同种类的重链恒定结构域分别被称 为oc、 5、 e、 Y和ii。免疫球蛋白的不同种类的亚单位结构和三维 构型是众所周知的。如本文所使用的，"单克隆抗体"指得自基本上同质的抗体群体 的抗体，即群体包含的单个抗体是等同的，除了可能以小量存在的可 能天然发生的突变外。单克隆抗体是针对单个抗原位点高度特异性的。 此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体 制剂形成对比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语"单 克隆"指出抗体作为得自基本上同质的抗体群体的特征，并且不应解 释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单 克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein， 1975， Nature, 256: 495描述的杂交瘤法来制备，或可以通过例如美国专利号4,816,567 中描述的重组DM法来制备。单克隆抗体还可以从使用例如 McCafferty等人，1990， Nature, 348: 552-554中描述的技术产生 的噬菌体文库中进行分离。
如本文所使用的，"人源化，，抗体指非人(例如鼠类)抗体的形 式，其是包含衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链、或其片段(例如Fv、 Fab、 Fab'、 F ( ab') 2或抗体的其他抗原结合子序列)。在极大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被 具有所需特异性、亲和力和生物活性的来自非人种类(供体抗体)例 如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。在某些情况下，人免疫球蛋白 的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可 以包含这样的残基，其在受体抗体或引入的CDR或构架序列中都没有 发现，但被包括以进一步改善和优化抗体性能。 一般而言，人源化抗 体将包含基本上全部至少一个、和一般地2个可变结构域，其中所有 或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白的那些，和所有或基本上所 有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最理想地还将包 含至少部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)， 一般是人免疫球蛋白 的那种。抗体可以具有如WO 99/58572中所述进行修饰的Fc区。其他 形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDRs( 1、 2、 3、 4、 5、 6个)，这也称为"衍生自"来自原始抗体的一个或多个CDRs 的一个或多个CDRs。如本文所使用的，"人抗体"意指具有的氨基酸序列对应这样的 抗体的那种的抗体，所述抗体由人生产和/或已使用本领域已知的或本 文公开的用于制备人抗体的任何技术进行制备。人抗体的这个定义包 括包含至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。 一个这种 例子是包含鼠类轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可以使用本领域已 知的任何技术进行生产。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库， 其中那种喧菌体文库表达人抗体 (Vaughan等人，1996， Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets等人，1998, PNAS, (USA) 95: 6157-6162; Hoogenboom和Winter ， 1991, J. Mol. Biol. , 227: 381; Marks等人，1991, J. Mol. Biol. , 222: 581 )。人抗体还可以通过 将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物内例如小鼠来制备，在所述转 基因动物中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全灭活。这种方法在美国专利号5, 545, 807; 5, 545, 806; 5, 569, 825; 5, 625, 126; 5, 633, 425; 和5,661， 016中得到描述。备选地，人抗体可以通过使人B淋巴细胞 永生化来制备，所述人B淋巴细胞产生针对靶抗原的抗体(此类B淋 巴细胞可以从个体中进行回收或可以已在体外进行免疫)。参见，例 如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第77页(1985 ); Boerner等人，1991， J. Immunol., 147 (1 ): 86-95;和美国专利号5， 750， 373。抗体的"可变区"指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链 的可变区。重和轻链的可变区各自由4个构架区(FR)组成，所述构 架区由3个互补决定区(CDRs)也称为高变区进行连接。每条链中的 CDRs通过FRs紧密结合在一起，并且与来自其他链的CDRs —起促成 抗体的抗原结合位点的形成。存在用于确定CDRs的至少2种技术:(1) 基于交叉种类序列变异性的方法(即，Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版，1991， National Institutes of Health, Bethesda MD));和(2)基于抗原-抗体 复合物的结晶学研究的方法(Al-lazikani等人(1997 )J. Molec. Biol. 273: 927-948 ))。如本文所使用的，CDR可以指通过任一方法或通 过2种方法的组合限定的CDRs。抗体的"恒定区，，指单独或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链 的恒定区。与抗体或多肽"优先结合"或"特异性结合"(在本文中可互换 使用)的表位是本领域充分理解的术语，和测定此类特异性或优先结 合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定细胞或物质比它与 备选细胞或物质更频繁、更快速、以更长的持续时间和/或以更大的亲 和力反应或结合，那么它被说成显示"特异性结合"或"优先结合"。 如果和它与其他物质的结合相比较，抗体以更大的亲和力、亲合力、 更快速和/或以更长的持续时间结合，那么它与靶"特异性结合"或"优 先结合"或"选择性"结合。例如，与trkB表位特异性或优先结合的 抗体是这样的抗体，和它与其他trkB表位或非trkB表位的结合相比 较，以更大的亲和力、亲合力、更快速和/或以更长的持续时间结合的 抗体。还应当理解通过阅读这个定义，与第一种耙特异性或优先结合 的例如抗体(或部分或表位)可以与第二种乾特异性或优先结合或者 不特异性或优先结合。像这样，抗体与trkB的"特异性"结合或"优 先"结合或"选择性"结合不必要求(尽管它可以包括)专一结合。 一般地但不必要地，提及选择性trkB结合意指优先结合(例如，与其 他受体比较，对于trkB在低至少3、 5，或优选地至少IO倍或IOO倍 的浓度下以IC50结合)。术语"Fc区"用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。"Fc区" 可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边 界可以改变，但人IgG重链Fc区通常限定于从在位置Cys226上的氨 基酸残基或从Pro230到其羧基末端的段。Fc区中的残基编号是如 Kabat等人，Sequences of Proteins of Imunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， Md. ， 1991中的EU索引的那种。免疫球蛋白的Fc区一般 包含2个恒定结构域，CH2和CH3。如本文所使用的，"Fc受体"和"FcR"描述了与抗体的Fc区结 合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合 IgG抗体(y受体)并包括FcyRI、 FcyRII、 FcyRIII和Fc y RIV亚类的受体的那种，包括这些受体的等位基因变体和可变剪切形式。 FcyRII受体包括FcyRIIA ("活化受体")和Fc y RIIB ("抑制受 体)，其具有主要在其胞浆结构域中不同的类似的氨基酸序列。FcRs 在Ravetch和Kinet， 1991， Ann. Rev. Immunol. ， 9: 457-92; Capel 等人，1994， Immunomethods, 4: 25-34; de Haas等人，1995， J. Lab. Clin. Med. , 126: 330-41; Nimmerjahn等人，2005， Immunity 23: 2-4中得到综述。"FcR"还包括负责将母体IgGs转移给胎儿的新生 儿受体FcRn(Guyer等人，1976， J. Immunol., 117: 587;和Kim 等人，1994， J. Immunol., 24: 249 )。 "补体依赖性细胞毒性"和"CDC"指在补体的存在下裂解乾。补 体活化途径通过补体系统的第一种组分(Clq)与分子(例如抗体)的 结合来起始，所述分子与同源抗原复合。为了评估补体激活，可以执 行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods, 202: 163 ( 1996 )中描述的。"功能Fc区"具有天然序列Fc区的至少一种效应子功能。示例 性"效应子功能"包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC) ; Fc 受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细 胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能一般 要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用"天然序列Fc区"包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列等 同的氨基酸序列。"变体Fc区"包含这样的氨基酸序列，其由于至少 一种氨基酸修饰不同于天然序列Fc区的那种，但保留天然序列Fc区 的至少一种效应子功能。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc 区比较，变体Fc区具有在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中的至少 一个氨基酸置换，例如约1个-约10个氨基酸置换，和优选地约1 个-约5个氨基酸置换。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/ 或亲本多肽的Fc区具有至少约80%的序列同一性，和最优选地与之 具有至少约90%的序列同一性，更优选地与之具有至少约95%、至少 约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的序列同一性。如本文所使用的，"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"和"ADCC" 指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细 胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别在靶 细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的裂解。目的分子的ADCC活性 可以使用体外ADCC测定法进行评估，例如美国专利号5， 500， 362或 5， 821， 337中描述的那种。用于此类测定法的有用的效应细胞包括外 周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。备选地或另外地，目的分子的ADCC 活性可以在体内进行评估，例如在动物模型中，例如在Clynes等人，
1998， PNAS(USA) , 95: 652-656中公开的那种。如本文所使用的，"药学上可接受的载体，，或"药学上可接受的 赋形剂，，包括当与活性成分组合时，允许成分保留生物活性并且不与 受试者的免疫系统反应的任何材料。例子包括但不限于，任何标准药 学载体例如磷酸盐緩冲盐水溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、和各种类 型的湿润剂。用于气溶胶或肠胃外施用的优选稀释剂是磷酸盐緩冲盐 水或生理(0. 9% )盐水。包含此类栽体的组合物通过众所周知常规方 法进行配制(参见,例如，We/zz/z^o/z 户力fli7z/acez/〃cfl7 5We力ces， 第18版，A. Ge證ro,编辑,Mack Publishing Co., Eastern, PA， 1990; 和 to7//^o/7, 7力e 5We/7ce a/7d户ra"/ce C户/ ar迈flcy第 20版Mack Publishing, 2000)。术语"多肽，，、"寡肽"、"肽，，和"蛋白质"在本文中可互换 地用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的， 它可以包含经修饰的氨基酸，和它可以被非氨基酸间断。该术语还包 括已天然或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖 基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作或修饰，例如与标 记組分缀合。还包括在该定义内的是例如包含一个或多个氨基酸类似 物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。 应当理解因为本发明的多肽基于抗体，所以多肽可以作为单链或结合 链存在。如在本文中可互换使用地，"多核苷酸"或"核酸"指任何长度 的核苷酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可以通过 DNA或RNA聚合酶掺入聚合物内的任何底物。多核苷酸可以包含经修 饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。存在时，对核苷酸结 构的修饰可以在聚合物装配前或后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷 酸组分间断。多核苷酸可以在聚合作用后进一步修饰，例如通过与标 记组分缀合。其他类型的修饰包括例如"帽"，用类似物置换一个或 多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰例如，具有不带电的键(例如，
甲基膦酸盐、磷酸三酯、亚磷酰胺(原文为phosphoramidites，疑为 phosphoamidates)氨基甲酸盐等)和具有带电荷的键(例如，磷硫酰、 二硫代磷酸酯等)的那些，包含悬挂部分的那些，例如蛋白质(例如 核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，具有嵌合剂(例如， 吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂的那些(例如，金属、放射 性金属、硼、氧化金属等)，包含烷化剂的那些，具有经修饰的键的 那些(例如，oc异头物核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸。此外， 糖中通常存在的任何羟基可以例如被膦酸盐基团、磷酸基替换，被标 准保护基团保护，或进行活化以制备与另外核苷酸的另外连接，或可 以与固体载体缀合。5'和3'末端0H可以进行磷酸化或用l-20个碳 原子的胺或有机加帽基团部分取代。其他羟基也可以进行衍生至标准 保护基团。多核苷酸还可以包含本领域一般已知的类似形式的核糖或 脱氧核糖，包括，例如，2'-0-甲基、2'-0-烯丙基，2'-氟或2'-叠氮 基-核糖、碳环糖类似物、异头糖、差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或 来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类 似物例如甲基核苷。 一 个或多个磷酸二酯键可以被备选的键合基团替 换。这些备选键合基团包括但不限于，其中磷酸盐被P (0) S ("硫 代")、P (S) S ( "二硫代")、(0) NR2 ("酰胺，，)、P (0) R、 P (0) 0R， 、 C0或CH2 ( "formacetal")替换的实施方案，其中每 个R或R'是独立地H或取代或未取代的烷基(1-20C),任选包含乙 醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。并非多核苷 酸中所有键都必须是相同的。先前所述应用于本文提及的所有多核苷 酸，包括RNA和DM。如本文所使用的，"基本上纯化的"指至少50%纯化(即不含污 染物)，更优选地，至少90%纯化，更优选地，至少95%纯化，更优 选地，至少98%纯化，更优选地，至少99%纯化的材料。"宿主细胞"包括可以是或已是用于掺入多核苷酸插入片段的载 体的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后 代，和由于天然、意外或有意的突变，后代不必与原始亲本细胞完全
相同(在形态学或在基因组DNA互补物方面)。宿主细胞包括用本发 明的多核苷酸体内转染的细胞。如本文所使用的，"载体"意指能够在宿主细胞中递送和优选地 表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的例子包括但不限于， 病毒载体、棵露DNA或RNA表达栽体、质粒、粘粒或噬菌体栽体、与 阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、封装在脂质体中的DNA或 RNA表达载体、和某些真核细胞，例如生产者细胞。如本文所使用的，"表达控制序列"意指指导核酸转录的核酸序 列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子，或增 强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。如本文所使用的，术语"k。n"意指关于抗体与抗原结合的速率常数。如本文所使用的，术语"k。ff"意指关于抗体与抗体/抗原复合物 解离的速率常数。如本文所使用的，术语"KD"意指抗体-抗原相互作用的平衡解离 常数。如本文所使用的，除非另有说明，单数形式"a" 、 "an"和"the" 包括复数参照。 III. 本发明的方法本发明包括通过外周施用trkB激动剂用于增加体重和/或食物摄 入的方法。这些方法可以用于治疗或预防灵长类动物中不希望有的重 量减轻(例如恶病质)和进食障碍(例如神经性厌食)，和哺乳动物 中阿片样物质诱导的呕吐。该方法使得能够给有此需要的个体外周施 用有效量的一种或多种trkB激动剂(各种适应症和方面在本文中得到 描述)。就本文描述的所有方法而言，提及trkB激动剂还包括包含一种或 多种这些试剂的组合物。这些组合物可以进一步包含合适的赋形剂， 例如药学上可接受的赋形剂，包括緩冲剂，这是本领域众所周知的。 本发明可以单独或与其他常规治疗方法组合使用。 可以通过本文描述的方法进行治疗和/或预防的恶病质可以引起下述中的一种或多种和/或与之相关慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢 性肾疾病(CKD)、慢性心力衰竭(CHF)、衰老、癌症和AIDS。在某些实施方案中，具有待治疗的恶病质或待治疗的不希望有的 重量减轻的人患者具有小于约25. 0 kg/m2、 24.0 kg/m2、 23.0 kg/m2、 22.0kg/m2、 21.0kg/m2、 20. 0 kg/m2、 19, 0 kg/m2和18. 5 kg/m2中的 任何一个的体重指数(BMI，计算为体重/以平方米的高度(kg/m2))。 在某些实施方案中，具有待治疗的恶病质或待治疗的不希望有的重量 减轻的人患者具有小于约90%、约80%、约70%、约60%、约50%、 约40%、约30%、约20%或约10%的正常推荐的每天摄取水平或发 病前水平的每天食物摄入。在某些实施方案中，具有通过本文描述的方法治疗的神经性厌食 的人患者具有小于约18.5 kg/m2、 17.5 kg/m2或16. 5 kg/m2中的任何 一个的BMI。在某些实施方案中，具有待治疗的神经性厌食的人患者 具有小于约90%、约80%、约70%、约60%、约50%、约40%、约 30% 、约20%或约10%的正常推荐的每天摄取水平或发病前水平的每 天食物摄入。trkB激动剂进行外周施用。应当理解尽管试剂进行外周施用，但 小百分比的试剂可能通过血脑屏障并且导致递送给中枢神经系统，取 决于试剂的性质。在某些实施方案中，小于约1%、约0.5%、约0.25 0/。和约0. 1%中的任何一个的外周施用的trkB激动剂(例如trkB激 动剂抗体)可接近CNS。t rkB激动剂可以经由任何合适的外周途径施用于个体。对于本领 域技术人员显而易见的是，本文描述的例子不希望是可用技术的限制 而是举例说明。因此，在某些实施方案中，trkB激动剂依照已知方法 施用于个体，例如静脉内施用，例如作为大丸药或通过经过一段时间 连续输注，通过肌内、腹膜内、皮下、关节内、舌下、滑膜内、经由 吹入、口部、吸入或局部途径。施用可以是全身性的，例如静脉内施 用，或局部的。用于液体制剂的商购可得的喷雾器包括喷射雾化器和
超声波雾化器对于注射有用。液体制剂可以直接进行雾化，或冻干的
粉末可以在重构后进行雾化。备选地，trkB激动剂可以使用碳氟化合 物制剂和计量吸入器进行烟雾化，或作为冻干和研碎的粉末吸入。
trkB激动剂可以经由位点特异性或把向局部递送技术在CNS或血 脑屏障外进行施用。位点特异性或靶向局部递送技术的例子包括各种 可植入的储存来源的trkB激动剂或局部递送导管，例如输注导管、留 置导管、或针刺导管、合成移植物，外膜包裹物，分流器和支架或其 他可植入装置，位点特异性载体，直接注射，或直接应用。参见，例 如，PCT公开号W0 00/53211和美国专利号5,981,568。
trkB激动剂的各种制剂可以用于施用。在某些实施方案中，trkB 激动剂可以纯施用。在其他实施方案中，trkB激动剂和药学上可接受 的赋形剂被施用，并且可以为各种制剂。药学上可接受的赋形剂是本 领域已知的，并且是有助于药理学有效物质的施用的相对惰性物质。 例如，赋形剂可以产生形状或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包 括但不限于，稳定剂、湿润和乳化剂、用于改变同渗容摩的盐、成胶 嚢剂、緩沖剂和皮肤穿透促进剂。赋形剂以及用于肠胃外和非肠胃外 药物递送的制剂在Ae/z7i/^on, r力e S"'e/zce 户ra"ice o尸户力ar咖c7 第20版Mack Publishing ( 2000 )中得到阐述。 一般地，这些试剂配 制用于通过注射(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等)施用，尽管 其他形式的施用(例如，口部、粘膜、经皮、吸入等)也可以使用。
特别的给药方案，即剂量、时间选择和重复将取决于特定个体和 那个个体的医疗史，待治疗的特定疾病(例如，恶病质、不希望有的 重量减轻、神经性厌食和阿片样物质诱导的呕吐)，和特定的trkB 激动剂。 一般地，可以使用trkB激动剂(例如，NT-4/5、 BDNF和抗 trkB激动剂抗体)的下述剂量中的任何一个至少约50 mg/kg体重 的剂量；至少约20mg/kg体重；至少约10mg/kg体重；至少约5 mg/kg 体重；至少约3 mg/kg体重；至少约2 mg/kg体重；至少约1 mg/kg 体重；至少约750 Pg/kg体重；至少约500 Pg/kg体重；至少约250 ug/kg 体重；至少约100 Pg/kg体重；至少约50Hg/kg体重；至少约10ug
/kg体重；至少约1 Pg/kg体重或更多被施用。经验考虑例如半衰期 一般将促进剂量的确定。对于经过数天或更长时间的重复施用，取决 于病状，治疗持续直至疾病症状的所需抑制发生或直至达到足够的治 疗水平。例如，考虑了每周l-5次的给药。其他给药方案包括高达l 次/天，1-5次/周，或更不频繁的方案。在某些实施方案中，trkB 激动剂约1次/周，约1-4次/月施用。可以使用由2天直至7天或甚 至14天隔开的具有交错剂量的间断给药方案。在某些实施方案中，治 疗可以从每天给药开始并随后变成每周或甚至每月给药。这种治疗的 进展通过常规技术和测定法容易地监控。
在某些个体中，可能需要超过一次剂量。施用频率可以经过治疗 过程进行施用和调整。例如，施用频率可以基于待治疗的疾病的类型 和严重度进行确定或调整，无论试剂被施用用于预防或治疗目的，先 前治疗，患者的临床史和对试剂的应答，和主治医师的判断。 一般地 临床医师将施用trkB激动剂直至达到实现所需结果的剂量。在某些情 况下，trkB激动剂的持续緩释制剂可能是合适的。用于达到持续释放 的各种制剂和装置是本领域已知的。例如trkB激动剂可以通过机械泵 进行施用或包埋在基质床中用于持续或緩慢释放。
在一个实施方案中，关于trkB激动剂的剂量可以以经验为主地在 已给予一次或多次施用的个体中进行确定。个体被给予增加剂量的 trkB激动剂。为了评估trkB激动剂的功效，可以监控疾病状态的标 记。对于本领域技术人员显而易见的是，剂量将依个体、疾病(例如 恶病质、神经性厌食和阿片样物质诱导的呕吐)阶段、以及使用的过
去和并存治疗而变。
依照本发明的方法的t r k B激动剂施用可以是连续的或间断的，例
如依赖接受者的生理条件，无论施用的目的是治疗还是预防，和熟练 的从业者已知的其他因素。trkB激动剂的施用可以经过预先选择的时
间段基本上连续的或可以是一系列间隔剂量。
其他制剂包括本领域已知的合适的递送形式，包括但不限于，栽 体例如脂质体。参见，例如Mahato等人(1997 )户力ar瓜14:
853-859。脂质体制剂包括但不限于，细胞转染剂、多层嚢泡和单层囊 泡。疾病的评估使用本领域已知的标准方法来进行，例如通过监控合 适的标记。例如，对于恶病质，可以监控下述标记体重、血浆白蛋 白、体脂、全身瘦体量、疲乏、虚弱和食欲。对于神经性厌食，可以 监控下述标记体重、食欲和对增加体重的恐惧。对于阿片样物质诱 导的呕吐，可以监控下述标记恶心、呕吐、食欲、体重、和其他相 关的医学并发症。 IV. 组合物和制备组合物的方法本发明的方法使用trkB激动剂，这指与天然trkB受体结合并激 活天然trkB受体和/或由trkB信号功能介导的下游途径的任何分子。 trkB激动剂包括trkB受体的任何天然配体，例如NT-4/5和BDNF。 trkB 激动剂还包括trkB受体的非天然配体(例如，多肽、肽衍生的化合物、 环肽衍生或非肽衍生的分子)，其与天然trkB受体结合并激活天然 trkB受体，从而模拟受体的天然配体的生物活性。trkB受体的非天然 配体的例子是抗trkB激动剂抗体。TrkB激动剂还包括小分子或肽模 拟物(例如，BDNF的肽模拟物)。参见，例如O'Leary等人，J. Biol. Chem. 278: 25738-44， 2003。在某些实施方案中，当外周施用时，小 分子trkB激动剂不显著穿过血脑屏障。trkB激动剂应显示下述特征中的一种或多种(a)与trkB受体 结合；(b)与trkB受体结合并激活trkB生物活性和/或由trkB信号 功能介导的一种或多种下游途径；(c)当外周施用时，与trkB受体 结合并在灵长类动物中增加体重和/或食物摄入；(d)当外周施用时， 与trkB受体结合，并治疗、预防、逆转或改善灵长类动物中的恶病质 或不希望有的重量减轻的一种或多种症状；(e)当外周施用时，与trkB受体结合，并治疗、预防、逆转或改善灵长类动物中的神经性厌 食的一种或多种症状；(f)当外周施用时，与trkB受体结合，并治 疗、预防、逆转或改善哺乳动物中的阿片样物质诱导的呕吐的一种或 多种症状；(g)促进trkB受体二聚化和活化；和(h)增加trkB受体依赖性神经元存活和/或神经突长出。在某些实施方案中，trkB激 动剂结合并激活trkB受体，但不显著或优先激活一种或多种其他trk 受体，例如trkA和/或trkC。trkB激动剂可以以组合物的形式用于在本文描述的任何方法中 使用。本发明的方法中使用的组合物包含有效量的trkB激动剂。组合 物可以以冻干制剂或水溶液的形式进一 步包含药学上可接受的栽体、 赋形剂或稳定剂(Ae/37/'/2^to/ .' 7Z e Sc/e/7ce di3do/*尸力ar边scy 第20版(2000 ) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover.)。可接受的栽体、赋形剂或稳定剂在剂量和浓度上对于接受 者是无毒的，并且可以包括緩沖剂例如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机 酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八基二甲基 节基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，节索氯铵；苯酚，丁醇或苯 甲醇；烷基对羟苯曱酸例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯 二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(小于约10个残基) 多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例 如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨 酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖，甘 露糖或右旋糖；螯合剂例如EDTA;糖例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山 梨糖醇；形成盐的抗衡离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络 合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN , PLURONICSTM或聚乙 二醇(PEG)。药学上可接受的赋形剂在本文中进一步描述。本文描述的TrkB激动剂可以配制用于持续释放。持续释放的制剂 的合适例子包括包含t rkB激动剂的固体疏水聚合物的半透性基质，所 述基质为成形物体的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的例子包 括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚乙烯醇、 聚交酯(美国专利号3, 773, 919 ) 、 L-谷氨酸和7-乙基L-谷氨酸盐的 共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例 如LUPR0N DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可 注射的微球体)，乙酸异丁酸蔗糖酯，和聚-D-(-) -3-羟丁酸。可以
使用的持续释放的药物递送系统的另 一个例子是由Atrix Laboratories制成的ATRIGEL 。参见，例如美国专利号6， 565， 874。 ATRIGEL逸药物递送系统由生物可降解的聚合物组成，类似于在生物可 降解的缝线中使用的那些，溶解于生物相容的栽体中。TrkB激动剂可 以在制造时掺入这种液体递送系统内，或取决于产品，可以在使用时 由医师随后加入。当液体产品通过小型计量针进行皮下或肌内注射或 通过套管置于可接近的组织位点内时，由组织液中的水取代载体引起 聚合物沉淀以形成固体膜或植入物。在植入物内装入的TrkB激动剂随 后以受控方式进行释放，因为聚合物基质随着时间生物分解。依赖患 者的医学需要，Atrigel系统可以经过从数日到数月的时间段递送蛋 白质。还可以使用可注射的持续释放的系统例如由制造的ProLease , Medisorb⑧。在某些实施方案中，本发明提供了用于在本文描述的任何方法中 使用的组合物(本文描述的)，无论在作为药物的用途和/或用于制备 药物的用途的背景中。NT-4/5多肽在本发明的方法中使用的trkB激动剂包括NT-4/5多肽。如本文 所使用的，"NT-4/5多肽"包括天然存在的成熟蛋白质(可互换地称 为"NT-4/5")，例如下表l、以及美国专利申请公开号2005/0209148 和PCT W0 2005/08240、和美国专利申请公开号20030203383的图1 所示的成熟的人NT-4/5;和天然存在的NT-4/5的氨基酸序列变体； 成熟的NT-4/5(例如人)的肽片段和氨基酸序列变体；和成熟的NT-4/5 和所述氨基酸序列变体和肽片段的经修饰的形式，其中多肽或肽已通 过用除天然存在的氨基酸外的部分置换进行共价修饰，只要氨基酸序 列变体、肽片段及其经修饰的形式显示trkB激动剂和/或天然存在的 成熟NT-4/5蛋白质的一种或多种生物活性。trkB激动剂还包括包含 本文描述的任何NT-4/5多肽实施方案的融合蛋白和缀合物，例如与半 衰期延长部分例如PEG、 IgGFc区、白蛋白或肽缀合或融合的NT-4/5 多肽。考虑的氨基酸序列变体、肽片段(包括变体的片段)、或其经
修饰的形式不包括任何动物种类的NGF、 BDNF或NT-3。天然存在的 NT-4/5的变体、肽片段及其经修饰的形式在美国专利申请公开号 2003/0203383; 2002/0045576; 2005/0209148;美国专利号5， 702, 906; 6,506,728; 6, 566, 091; 5， 830， 858中得到描述。NT-4/5多肽包括本 文描述的任何一个或多个实施方案。例如，NT-4/5多肽包括具有一个 或多个氨基酸插入、删除或置换的天然存在的序列。表1.成熟的人NT-4/5的氨基酸序列和编码成熟的人NT-4/5的人核苷酸序列_氨基酸序列(SEQ ID NO: 1):GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA核苷酸序列(SEQ ID NO: 2) GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTC AGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGA GGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCC AGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGC CCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGT ATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATG CCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTC TGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCCTGAG在某些实施方案中，NT-4/5多肽是哺乳动物NT-4/5多肽，其可 以是天然存在的哺乳动物NT-4/5,或衍生自天然存在的哺乳动物 NT-4/5并具有这样的序列的NT-4/5多肽，所述序列不匹配天然存在 的非哺乳动物NT-4/5的任何部分。在某些实施方案中，NT-4/5多肽 是人NT-4/5多肽，其可以是天然存在的人NT-4/5,或衍生自天然存
在的人NT-4/5并具有这样的序列的NT-4/5多肽，所述序列不匹配天 然存在的非人NT-4/5的任何部分。本发明的NT-4/5多肽，包括NT-4/5多肽(包括天然存在的 NT-4/5)的变体、肽片段、经修饰的形式，融合蛋白和缀合物的特征 在于下述特征中的任何(一种或多种)(a)与trkB受体结合；(b) 与trkB受体结合并激活trkB生物活性和/或由trkB信号功能介导的 一种或多种下游途径；(c)当外周施用时，与trkB受体结合并在灵 长类动物中增加体重和/或食物摄入；(d)当外周施用时，与trkB 受体结合，并治疗、预防、逆转或改善灵长类动物中的恶病质的一种 或多种症状；(e)当外周施用时，与trkB受体结合，并治疗、预防、逆转或改善灵长类动物中的神经性厌食的一种或多种症状；(f )当外 周施用时，与trkB受体结合，并治疗、预防、逆转或改善哺乳动物中 的阿片样物质诱导的呕吐的一种或多种症状；(g)促进trkB受体二 聚化和活化；和(h)增加trkB受体依赖性神经元存活和/或神经突长 出。因此，所有NT-4/5多肽(包括变体、片段和经修饰的形式)具有 如上文所述的功能。变体的生物活性可以使用本领域已知的方法和本文描述的方法在 体外和体内进行测试。还可以使用本文描述的用于鉴定抗trkB激动剂 的方法。与天然存在的NT-4/5蛋白质比较，NT-4/5多肽可以具有增 强的活性或减少的活性。在某些实施方案中，就上文描述(或本领域 已知的)的一种或多种生物测定法而言，与NT-4/5多肽由其衍生的天 然NT-4/5蛋白质比较，功能上等价的变体具有至少约50%、 60%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90 %或95 %中的任何一个的活性。在某些 实施方案中，功能上等价的变体在体外TrkB受体活化中(例如实施例 6中，以及在US 2005/0209148和PCT WO 2005/082401中描述的测定 法)具有小于约0.01 nM、 0.1 nM、 1 nM、 10 nM或100 nM中的任何 一个的EC5。(半数最大有效浓度)。NT-4/5的氨基酸序列变体包括具有这样的氨基酸序列的多肽，所 述氨基酸序列由于天然存在的NT-4/5 (例如，表l中所示的成熟的人NT-4)的序列内的一个或多个氨基酸残基的插入、删除和/或置换，而 不同于天然存在的NT-4/5。氨基酸序列变体一般将与任何天然存在的 NT-4/5 (例如SEQIDNO: 1中所示的成熟的人NT-4/5 )至少约65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99% 等同。在某些实施方案中，变体与SEQIDNO: 1的氨基酸序列至少约 70%等同。在某些实施方案中，变体与SEQIDNO: 1的氨基酸序列至 少约85%等同。在某些实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的氨基酸 序列至少约90%等同。在某些实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的 氨基酸序列至少约95%等同。NT-4/5的氨基酸序列变体可以通过在先前分离的NT-4/5 DNA中 制备预定的突变来产生。氨基酸变体可以基于NT-4/5和TrkB受体的 晶体结构进行设计和产生。Banfield等人，Structure 9:1191-9( 2001 ) 例如，不直接涉及NT-4/5单体之间和NT-4/5与TrkB受体之间的相互 作用的氨基酸可以进行突变，例如以引入PEG附着位点。本领域已知 的方法可以用于设计NT-4/5多肽的变体，与天然存在的NT-4/5蛋白 质比较，其具有增强或减少的一种或多种生物活性。存在在制备此类预定突变中考虑的2种主要变量突变位点的位 置和突变的性质。 一般而言，选择的突变的位置和性质一般依赖待修 饰的NT-4/5特征。例如，候选物NT-4/5拮抗剂或超激动剂最初可以 通过定位在NGF、 BDNF、 NT-3和NT-4中相同或高度保守的氨基酸残基 进行选择。那些残基可以连续地进行修饰，例如通过(l)首先用保守 选择和随后依赖达到的结果用更激进的选择置换，(2 )删除乾残基， 或(3)插入与确定位点邻近的相同或不同类的残基，或选择1-3的 组合。一种有用的技术称为"ala扫描"。此处，氨基酸残基或靶残基 组进行鉴定，并由丙氨酸或聚丙氨酸置换。显示对丙氨酸置换的功能 敏感性的那些结构域随后通过在丙氨酸置换位点处或对于丙氨酸置换 位点引入更多的或其他变体进行改善。明显地，例如将NT-4/5转变成NGF、 BDNF或NT-3的此类变体不 包括在本发明的范围内。因此，尽管用于引入氨基酸序列变体的位点 是预定的，但突变的性质本身无需是预定的。例如，为了优化在给定位点处的突变的性能，ala扫描或随机诱变在靶密码子或区域处进行， 和表达的NT-4/5变体就优化的所需活性进行筛选。氨基酸序列缺失一般为约l个-30个残基，更优选地，约l个-IO个残基，和一般是邻接的。缺失可以在BDNF、 NGF、 NT-3和NT-4/5 中低同源性的区域内引入以修饰NT-4/5的活性。来自NT-4/5的与 BDNF、 NT-3和NGF基本同源的区域中的缺失也许更可能更显著地修饰 NT-4/5的生物活性。可以选择连续删除的数目，以便保留受影响的结 构域中NT-4/5的三级结构，例如P折叠片或a螺旋。氨基酸序列插入包括长度为1个残基到包含1000个或更多残基的 多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列 内插入。序列内插入(即，在成熟的NT-4/5序列内的插入) 一般可以 为约l个-IO个残基，更优选地，l个-5个，最优选地l个-3个。 末端插入的例子包括异源N末端信号序列与NT-4/5分子的N末端的融 合，以促进成熟的NT-4/5从重组宿主中分泌。此类信号一般将与预期 的宿主细胞同源，并且包括用于大肠杆菌的STII或lpp,用于酵母的 a因子，和用于哺乳动物细胞的病毒信号例如疱疹gD。其他插入包括 多肽与NT-4/5的N或C末端的融合物。另一组变体包括其中NT-4/5中的至少一个氨基酸残基和优选地 仅1个已被去除和不同的残基插入其位置中的那些变体。例子是精氨蛋白质水解有抵抗力，从而制备更稳定的NT-4/5变体。对于置换诱变 最感兴趣的位点包括这样的位点，其中在BDNF、 NGF、 NT-3和NT-4 中发现的氨基酸就侧链体积、电荷或疏水性而言基本上不同，但其中 在NGF、 NT-3和BDNF的各种动物类似物(例如，在所有动物NGFs， 所有动物NT-3，和所有BDNFs中)内在所选择的位点上还存在高度同 源性。这个分析将突出可能涉及营养因子的活性的区分的残基，和因 此在这些位点上的变体可以影响此类活性。在成熟的人NT-4/5中、从，以使得NT-4/5对经由丝氨酸蛋白酶的 N末端开始编号、和示例性置换的此类位点的例子包括分别地，SEQID NO: 1的NT-4/5的G77至K、 H、 Q或R和R84至E、 F、 P、 Y或W。其 他感兴趣的位点是其中残基在所有动物种类BDNF、NGF、NT-3和NT-4/5 中相同的位点，这种构象程度暗示达到在所有4种因子共有的生物活 性中的重要性。例如， 一个或多个氨基酸的置换包括保守置换。制备保守置换的 方法是本领域已知的。例如，ala (A)可以被val、 leu、 ile，优选 地净皮val置换；arg (R)可以-故lys、 gln、 asn，优选地祐lys置换； asn (N)可以被gln、 his、 lys、 arg，优选地被gln置换；asp(D) 可以被glu置换；cys (C)可以被ser置换；gln ( Q)可以被asn置 换；glu (E)可以被asp置换；gly ( G )可以被pro置换；his(H) 可以被asn、 gln、 lys、 arg，优选地被arg置换；i le (I)可以被leu、 val、 met、 ala、 phe、正亮氨酸，优选地被leu置换；leu(L)可以 4皮正亮氨酸、ile、 val、 met; ala; phe，优选地被ile置换；lys(K) 可以被arg; gln、 asn,优选地被arg置换；met (M)可以被leu; phe; ile，优选地被leu置换；phe ( F)可以被leu、 val、 ile、 ala，优 选地被leu置换；pro (P)可以被gly置换；ser ( S )可以被thr置 换；thr (T)可以被ser置换；trp ( W)可以被tyr置换；tyr(Y) 可以被trp、 phe、 thr、 ser，优选地被phe置换；val(V)可以被ile; leu; met; phe、 ala;正亮氨酸，优选地被leu置换。特别适合于保守置换的位点包括，从成熟的人NT-4 (SEQ ID NO: l)的N末端开始编号，Rll、 G12、 E13、 V16、 D18、 W23、 V24、 D26、 V40、 L41、 Q54、 Y55、 F56、 E58、 T59、 G77、 R79 、 G80、 H85、 W86、 A99、 LIOO、 TlOl、 WllO、 Rlll、 W112、 1113、 R114、 1115、 D116和A118。不涉及维持NT-4/5的正确构象的半胱氨酸残基也可以 被置换， 一般地用丝氨酸，以便改善分子的抗氧化性和防止异常交联。 除这个段落中列举的那些外的位点适合于上文一般描述的删除或插入 研究。在功能中的基本修饰可以通过选择在其对维持下述的影响方面显
著不同的置换来完成(a)置换区域中的多肽主链的结构，例如作为 折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点上的电荷或疏水性，或(c)侧 链的体积。天然存在的残基基于共有的侧链性质进行分组(这些中的 一些可以包括在几个功能组内)(1) 疏水的正亮氨酸，met, ala, val, leu， ile;(2) 中性亲水的cys， ser， thr;(3) 酸性的asp, glu;(4) 碱性的asn， gln， his， lys， arg;(5) 影响链定向的残基gly， pro;和(6) 芳香族的trp， tyr， phe。非保守置换将使得能够把这些种类中的一个的成员换成另 一个。 NT-4变体的例子包括具有E67至S或T的突变(这添加N链糖 基化位点)的SEQ ID NO: 1的多肽；SEQ ID NO: 1的氨基酸残基R83 至Q94， G1至C61, G1至C17， C17至C61， C17至C78， C17至C90, C17至C119， C17至C121， R11至R27， Rll至R34， R34至R53， C61 至C78, R53至C61， C61至C119, C61至C78， C78至C119, C61至 C90， R60至C78， K62至C119， K62至K91， R79至R98， R83至K93， T101至Rlll， Gl至C121的多肽；多肽包含SEQ ID NO: 1的V40-C121， 例如在N末端和/或C末端上与多肽融合的SEQ ID NO: 1的V40-CU1; 多肽包含具有C78， C61， Q54-T59, R60-D82， H85-S88， W86-T101的 删除的SEQ ID NO: 1 (残基指出的跨度的删除，包括所述残基在内)； 具有从R53到H，从K91到H，从V108到F，从R84到Q、 H、 N、 T、 Y 或W，和从D116到E、 N、 Q、 Y、 S或T的突变的SEQ IDNO: 1。还包 括的是这样的NT-4/5 (SEQ ID NO: 1)，其中第70位用除G， E， D 或P外的氨基酸残基置换；第71位用除A, P或M外的氨基酸残基置 换；和/或第83位用除R， D, S或K外的氨基酸残基置换；以及环化 的NT-4片段。如果当如下文所述就最大对应性进行比对时，2个序列中的核苷 酸或氨基酸的序列相同，那么2个多核苷酸或多肽序列被说成是"等
同的"。2个序列之间的比较一般通过在比较窗上比较序列来进行， 以鉴定和比较序列相似性的局部区域。如本文所使用的，"比较窗" 指至少约20个邻接位置，通常为30个-约75个，40个-约50个的 区段，其中在2个序列进行最佳比对后，序列可以与相同数目的邻接 位置的参考序列进行比较。用于比较的最佳比对序列可以使用生物信息学软件(DNASTAR， Inc., Madison, WI)的Lasergene包中的Megal ign程序来进行，使 用缺省参数。这个程序具体体现了下述参考文献中描述的几种比对方 案Dayhoff， M. 0. ( 1978 ) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff ， M. 0.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC第 5 巻，Suppl. 3，第345-358页；HeinJ. ， 1990， Unified Approach to Alignment and Phylogenes第626-645页Methods inEnzymology第 183巻,Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins， D. G.和 Sharp, P.M., 1989， CABI0S 5: 151-153; Myers, E.W.和Muller W. ， 1988， CABI0S 4: 11-17; Robinson, E.D. ， 1971， Comb. Theor. 11: 105; Santou， N. ， Nes ， M. ， 1987 ， Mol. Biol. Evol. 4: 406-425 ; Sneath , P. H. A.和Sokal , R. R. , 1973， Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J.和Lipman, D. J.， 1983， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730。优选地，"序列同一性的百分比"通过在至少20个位置的比较窗 上比较2个最佳比对的序列来测定，其中就2个序列的最佳比对与参 考序列(它不包含添加或缺失)比较，比较窗中的多核苷酸或多肽序 列的部分可以包含20%或更少，通常为5-15%,或10-12%的添加 或缺失(即缺口 )。百分比通过下述进行计算测定在其上等同的核 酸碱基或氨基酸残基存在于2个序列中的位置数目以产生匹配位置的 数目，将匹配位置数目除以参考序列(即，窗口大小)中的位置总数 目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。NT-4/5的氨基酸序列变体可以是天然存在的或可以合成制备，例 如通过将合适的核苷酸变化引入先前分离的NT-4/5 DNA内，或通过体 外合成所需变体多肽。如上所述，此类变体可以包含来自成熟的 NT-4/5的氨基酸序列(例如，表l中所示的序列)内的一个或多个氨 基酸残基的删除、或插入或置换。制备删除、插入和置换的任何组合， 以达到NT-4/5的氨基酸残基变体，条件是所得到的变体多肽具有所需 特征。氨基酸变化还可以导致在重组宿主中表达后NT-4/5的进一步修 饰，例如，引入或去除糖基化位点，或引入膜锚定序列(参见，例如， PCT WO 89/01041 )。在某些实施方案中，NT-4/5多肽包含由这样的核酸编码的氨基酸 序列，所述核酸在严格条件下与编码成熟的人NT-4/5的核酸序列(例 如，SEQ ID NO: 2)杂交。变体多核苷酸还可以或备选地与天然基因或其部分或互补物基本 上同源。此类多核苷酸变体在中等严格条件下能够与编码该多肽(或 互补序列)的天然存在的DNA序列杂交。合适的"中等严格条件"包括在5XSSC， 0.5%SDS， l.OmMEDTA (pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50X:- 65n, 5 X SSC下杂交过夜； 随后于65"C用包含0.1。/。SDS的2X, 0. 5X和0. 2X SSC各洗涤2次， 共20分钟。如本文所使用的，"高度严格条件"或"高严格条件"是下述的 那些(1)使用低离子强度和高温用于洗涤，例如0.015M氯化钠/ 0.0015 M柠檬酸钠/0. 1%十二烷基硫酸钠在50C下；(2)在杂交过 程中使用变性剂，例如甲酰胺，例如50% (v/v)甲酰胺与0. 1%牛血 清白蛋白/O. l%Ficoll/0. 1%聚乙烯吡咯烷酮/50慮磷酸钠緩冲液在 pH 6. 5下与750 mM氯化钠，75mM柠檬酸钠在42"C下；或(3 )使用 50%曱酰胺，5 x SSC ( 0. 75 M NaCl， 0. 075 M柠檬酸钠)，50 mM 磷酸钠(pH 6.8) ， 0. 1%焦磷酸钠，5 x Denhardt氏溶液，超声处 理的鲑精DNA(50 ng/ml) ， 0.1% SDS，和10%硫酸葡聚糖在42
。C下，而洗涤在42tJ下在0.2 x SSC (氯化钠/杵檬酸钠)和50%曱 酰胺中在55t:下，随后为由包含EDTA的0. 1 x SSC在55C下组成的 高严格洗涤。另一种示例性严格条件杂交在50%甲酰胺，5xSSC， 0.1 %十二烷基硫酸钠，0.1 %焦磷酸钠，50 mM磷酸钠pH 6. 8， 2 x Denhardt 氏溶液，和10%硫酸葡聚糖在421C下，随后为在0. lxSSC和0. 1%SDS 中在42C下洗涤。技术人员应知道必要时如何调整温度、离子强度等， 以适应因子例如探针长度等。本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并，存在编码如本 文所描述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天 然基因的核苷酸序列具有最低限度的同源性。不过，本发明特别预期 了由于密码子使用中的差异而改变的多核苷酸。此外，包含本发明提 供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是 由于一种或多种突变而改变的内源基因，所述突变例如核苷酸缺失、 添加和/或置换。所得到的mRNA和蛋白质可以但无需具有改变的结构 或功能。等位基因可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序 列比较)进行鉴定。本发明的方法中使用的TrkB激动剂还包括融合蛋白，其包含 NT-4/5的氨基酸序列(例如，表l中所示的人NT-4/5)或其功能肽片 段。生物学活性的NT-4/5多肽可以与序列例如增强免疫反应性的序列 融合，促进多肽与支持物或栽体的偶联，或促进重折叠和/或纯化(例 如，编码表位的序列，例如Myc，衍生自流感病毒血凝素的HA， His-6， FLAG)。这些序列可以与NT-4/5多肽在N末端或C末端上融合。此外， 蛋白质或多核苷酸可以与其他或多舦融合，所述序列增加其功能或指 定其在细胞中的定位，例如分泌序列。用于生产上文所述的重组融合 蛋白的方法是本领域已知的。重组融合蛋白可以通过本领域众所周知 的方法进行生产、重折叠和分离。本文描述的NT-4/5多肽可以进行修饰以增加其在个体中的半衰 期。例如，NT-4/5多肽可以进行聚乙二醇化以减少全身性清除，伴随 生物活性的最低限度丧失。本发明还提供了包含与PEG分子连接的
NT-4/5多肽的组合物(包括药物组合物)。在某些实施方案中，PEG 分子通过可逆连接与NT-4/5多肽连接。聚乙二醇化的NT-4/5多肽的 半衰期可以延长超过非聚乙二醇化的NT-4/5多肽的半衰期约2倍、5 倍、10-倍、15-倍、20-倍和30-倍中的任何一个。聚乙二醇聚合物(PEG)可以使用本领域已知的方法与NT-4/5多 肽的各种官能团进行连接。参见，例如，Roberts等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476 ( 2002 ) ; Sakane等人 14: 1085-91 ( 1997 )。 PEG可以与多肽上的下述官能团进行连接氨 基、羧基、经修饰的或天然的N末端、胺基和巯基。在某些实施方案 中， 一个或多个表面氨基酸残基用PEG分子进行修饰。PEG分子可以 具有各种大小(例如，范围约2-40kDa)。与NT-4/5多肽连接的PEG 分子可以具有约2000、 10, 000、 15, 000、 20, 000、 25, 000、 30, 000、 35, 000、 40，000 Da中的任何一个的分子量。PEG分子可以是单链或支 链。为了使PEG与NT-4/5多肽连接，可以使用在1个或2个末端上具 有官能团的PEG的衍生物。官能团基于在NT-4/5多肽上可用的反应基 团的类型进行选择。使衍生物与多肽连接的方法是本领域已知的。 Roberts等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476( 2002 )。 NT-4/5多肽和PEG之间的连接也可以是这样的，使得它可以在个体中 进行切割或天然降解(可逆的或可降解的连接)，这可以改善半衰期 而使活性的丧失降到最低。在NT-4/5多肽上的PEG连接位点还可以通行制备。例如，人NT-4/5 (SEQ ID NO: 1)的下述氨基酸可以进行突 变用于PEG附着Gl、 V2、 S3、 E4、 T5、 S9、 R10、 T25、 D26、 R28、 T29、 V31、 E37、 E39、 L41、 E43、 A46、 A47、 G48、 G49、 S50、 R53、 D64、 N65、 A66、 E67、 E68、 G69、 D82、 R83、 R84、 H85、 A104、 Q105、 G106、 R107、 V108、 S125和T127。这些可以应用于其他种类中的相应 残基。几种聚乙二醇化的NT-4/5已产生并显示于美国专利申请公开号 2005/0209148和PCT WO 2005/082401的实施例6和7中。在成熟的 人NT—/5的第50位上的丝氨酸残基可以变成半胱氨酸以产生 NIM-S50C，所述NT4-S50C随后进行聚乙二醇化，其中PEG与在第50 位上的半胱氨酸进行连接。用于PEG的N末端特异性附着的1个例子 是使第l位上的残基突变成丝氨酸或苏氨酸，随后为聚乙二醇化，其 中PEG与第1位上的丝氨酸连接。NT-4/5多肽可以通过重组方法，即，通过表达编码NT-4/5多肽 的核酸来产生。在重组细胞培养物中，和任选地，来自细胞培养物的 变体多肽的纯化，例如通过变体的活性的生物测定法或通过在包含兔 抗NT-4/5多克隆抗体(这将与同样存在于天然NT-4/5上的变体的至 少一个免疫表位结合)的免疫亲和柱上吸附。约40个残基或更少的小 型肽片段通过体外方法方便地制备。编码NT-4/5多肽的DNA可以克隆到表达载体内用于在宿主细胞中 表达蛋白质。编码NT-4/5多肽的核酸的例子在美国专利申请公开号 2003/0203383中得到描述。编码以其成熟形式的NT-4/5多肽的DNA 可以在其氨基末端上与分泌信号连接。这种分泌信号优选是通常在体 内指导NT-4/5由人细胞分泌的NT-4/5前序列。然而，合适的分泌信 号还包括来自其他动物NT-4/5的信号，来自NGF、 NT-2或NT-3的信 号，病毒信号，或来自相同或无关种类的分泌多肽的信号。任何宿主 细胞(例如大肠杆菌)可以用于表达蛋白质或多肽。表达的NT-4/5多肽可以进行纯化。NT-4/5多肽可以作为分泌的 蛋白质从培养基中进行回收，尽管当不含分泌信号直接表达时，它也 可以从宿主细胞裂解物中进行回收。可以使用本领域已知的蛋白质纯 化方法。生产NT-4/5多肽和纯化表达的NT-4/5多肽的方法在美国专 利申请公开号2003/0203383和美国专利号6,184， 360中得到描述。 NT-4/5多肽可以在大肠杆菌中进行表达并且根据本领域已知的方法 进行重折叠。成熟的人NT-4/5还可以商购获得(例如，从R&D Systems, Minneapolis, MN， Sigma, St. Louis, M0和Upstate Biotech.， Temecula， CA)。抗trkB激动剂多肽和抗体
本发明的方法中使用的trkB激动剂还包括抗trkB激动剂多肽， 包括抗trkB激动剂抗体。抗trkB激动剂多肽(例如抗体)应显示下 述特征中的一种或多种(a)与trkB受体结合；(b)与trkB受体 结合并激活trkB生物活性和/或由trkB信号功能介导的一种或多种下 游途径；(c)当外周施用时，与trkB受体结合并在灵长类动物中增 加体重和/或食物摄入；(d)当外周施用时，与trkB受体结合，并治 疗、预防、逆转或改善灵长类动物中的恶病质的一种或多种症状；(e) 当外周施用时，与trkB受体结合，并治疗、预防、逆转或改善灵长类 动物中的神经性厌食的一种或多种症状；(f )当外周施用时，与trkB 受体结合，并治疗、预防、逆转或改善哺乳动物中的阿片样物质诱导 的呕吐的一种或多种症状；(g)促进trkB受体二聚化和活化；和(h) 增加trkB受体依赖性神经元存活和/或神经突长出。在某些实施方案中，抗trkB激动剂多肽(例如，抗体)是多价的 并与trkB受体的细胞外结构域结合。已显示能够与神经营养蛋白受体 的trk家族结合并交联或二聚化的免疫球蛋白激活这些受体，并在神 经元中产生类似于暴露于神经营养蛋白的结果。参见，美国专利号 6,656,465;和PCT W0 01/98361,trkB激动剂抗体可以包括单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段(例 如Fab， Fab， ， F ( ab， ) 2， Fv， Fc等)，嵌合抗体，单链(ScFv ), 其突变体，包含抗体部分的嵌合蛋白质，和包含所需特异性的抗原识 别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型。抗体可以是鼠类、 大鼠、人或任何其他来源(包括人源化抗体)。在某些实施方案中，多肽(包括抗体)结合trkB并且不与其他神 经营养蛋白受体(例如相关的神经营养蛋白受体，trkA和/或trkC) 显著交叉反应(结合)。激动剂抗trkB多肽可以结合人trkB。激动 剂抗trkB多肽还可以结合人和啮齿类动物trkB。在某些实施方案中， 激动剂抗trkB多肽可以结合人和大鼠trkB。在某些实施方案中，抗 trkB多肽可以结合人和小鼠trkB。在一个实施方案中，多肽识别在人 trkB细胞外结构域上的一种或多种表位。在另一个实施方案中，抗体 是识别在人trkB细胞外结构域上的一种或多种表位的小鼠或大鼠抗 体。在某些实施方案中，多肽结合人trkB并且不显著结合来自另一个 哺乳动物种类(在某些实施方案中，脊推动物种类)的trkB。在某些 实施方案中，多肽结合人trkB以及来自另 一个哺乳动物种类(在某些 实施方案中，脊推动物种类)的一种或多种trkB。在另一个实施方案 中，多肽识别选自下述中的一种或多种的trkB上的一种或多种表位 灵长类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物和牛科动物。在某些实施方案中，抗trkB激动剂抗体在体外TrkB受体(例如， 人trkB)活化中(例如实施例6中，以及在US 2005/0209148和PCTW0 2005/082401中描述的测定法)具有小于约0.01 nM、 0.1 nM、 0.5 nM、 1 nM、 5 nM、 10 nM、 50 nM或100 nM中的任何一个的EC5。(半 数最大有效浓度)。抗trkB激动剂多肽(例如，抗体)与trkB的结合亲和力可以是 约500 nM、约400 nM、约300 nM、约200 nM、约100 nM、约50 nM、 约10 nM、约1 nM、约500 pM、约100 pM或约50 pM中的任何一个， 至约2 pM、约5 pM、约10 pM、约15 pM、约20 pM或约40 pM中的 任何一个。在某些实施方案中，结合亲和力为约100 nM、约50 nM、 约10nM、约1 nM、约500 pM、约100 pM或约50 pM、或小于约50 pM 中的任何一个。在某些实施方案中，结合亲和力是小于约100nM、约 50 nM、约10 nM、约1 nM、约500 pM、约100 pM或约50 pM中的任 何一个。在另外其他的实施方案中，结合亲和力为约2 pM、约5 pM、 约10 pM、约15 pM、约20 pM、约40 pM、或大于约40 pM。如本领 域众所周知的，结合亲和力可以表示为K。，或解离常数，和增加的结 合亲和力对应减少的KD。测定抗体与trkB的结合亲和力的一种方法通过测量抗体的单功 能Fab片段的结合亲和力。为了获得单功能Fab片段，抗体(例如， IgG)可以用木瓜蛋白酶进行切割或重组表达。抗体的抗trkB Fab片 段的亲和力可以通过表面等离子体共振(B IAcore3000TM表面等离子 体共振(SPR)系统，BIAcore， INC， Piscataway NJ)进行测定。CM5
芯片根据供应商的说明书用N-乙基-N'- (3-二甲基氨丙基)-碳化二 亚胺(原文为carbodiinide，疑为carbodi imide )盐酸化物(EDC ) 和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS )进行活化。人trkB-Fc融合蛋白("htrkB")(或任何其他trkB，例如大鼠trkB)可以稀释到10 mM乙酸钠pH 5. 0 内，并以0. 0005 mg/mL的浓度注入活化芯片上。使用经过单个芯片通 道的变速流时间，可以达到2个抗原密度范围200-400 (共振单位)(RU)用于详细的动力学研究和500-1000 RU用于筛选测定法。芯片 可以用乙醇胺封闭。再生研究已显示Pierce洗脱緩沖液(产品号 21004， Pierce Biotechnology, Rockford， IL)和4 M NaCl ( 2: 1) 的混合物有效去除结合的Fab，同时在芯片上的htrkB活性保持超过 200次注射。HBS-EP緩冲液(0. OIMHEPES， pH7.4， 0,15NaCl， 3 mM EDTA， 0. 005 %表面活性剂P29)用作用于BIAcore测定法的运行緩冲 液。纯化的Fab样品的系列稀释(0. 1 - 10x估计的KD)以100nL/分 钟注入l分钟，并且允许高达2小时的解离时间。Fab蛋白质的浓度 通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳进行测定，4吏用已知浓度的Fab (如 通过氨基酸分析测定的)作为标准。动态结合速率(k。n)和解离速率(k。ff)(一般在251C下测量)通过使用BIAevaluation程序使数据 与1: 1的郎缪尔(Ungmuir)结合模型(Karlsson, R. Roos， H. Fagerstam， L. Petersson, B. (1994) . Methods Enzymology 6: 99-110)拟合同时获得。平衡解离常数(KD)值计算为k。ff/k。n。在某些实施方案中，抗trkB激动剂多肽(包括抗体)具有受损的 效应子功能。如本文所使用的，具有"受损的效应子功能"(可与术 语"免疫学惰性的"互换使用)的抗体或多肽指没有任何效应子功能 或具有减少的效应子功能活性(与具有未修饰的或天然存在的恒定区 的抗体或多肽比较)的抗体或多肽，例如在下述中的任何一种或多种 中无活性或具有减少的活性a)引发补体介导的裂解；b)刺激抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);和c)激活小神经胶质细胞。 效应子功能活性可以减少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99 %和100%中的任何一个。在某些实施 方案中，抗体与trkB受体结合，而不引发显著的补体依赖性裂解，或细胞介导的乾破坏。例如，恒定区上的Fc受体结合位点可以进行修饰或突变，以去除或减少与某些Fc受体，例如FcyRI、 FcyRII、 FcyRIII和/或Fc"/RIV的结合亲和力。为了简单起见，将提及抗体，应当理解实施方案也可应用于多肽。EU编号系统Uabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest; 第 5 版 Public HealthService, National Institutes of Healthy, Bethesda， Md. , 1991)用于指出恒定区(例如IgG抗体的)的哪些氨基酸残基被改变或突变。编号可以用于特定类型的抗体(例如，IgGl)或种类(例如，人)， 应当理解类似改变可以跨越抗体类型和种类来进行。在某些实施方案中，与trkB受体特异性结合的多肽(包括抗体) 包含具有受损的效应子功能的重链恒定区。重链恒定区可以具有天然 存在的序列或是变体。在某些实施方案中，天然存在的重链恒定区的 氨基酸序列是突变的，例如通过氨基酸置换、插入和/或删除，由此恒 定区的效应子功能受损。在某些实施方案中，重链恒定区的Fc区的 N-糖基化可以进行改变，例如可以完全或部分去除，由此恒定区的效 应子功能受损。在某些实施方案中，效应子功能通过去除Fc区(例如在IgG的 CH2结构域中)的N-糖基化而受损。在某些实施方案中，Fc区的N-糖基化通过使糖基化的氨基酸残基或侧翼残基突变来去除，所述侧翼 残基是恒定区中的糖基化识别序列的部分。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨 酸(N-X-S )、天冬酰胺-X-苏氨酸(N-X-T )和天冬酰胺-X-半胱氨酸 (N-X-C),其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是关于碳水化合物部 分与天冬酰胺侧链的酶促附着的识别序列用于N-糖基化。使恒定区中 的三肽序列中的任何氨基酸突变产生无糖基化的IgG。例如，人IgGl 和lgG3的N-糖基化位点N297可以突变成A、 D、 Q、 K或H。参见，Tao 等人，J. Immunology 143: 2595-2601 ( 1989 );和Jefferis等人， Immunological Reviews 163: 59-76 ( 1998 )。已报道具有用Gln、 His或Lys置换的Asn-297的人IgGl和IgG3不与人FcyRI结合，并
不激活补体，其中Clq结合能力对于IgGl完全丧失和对于IgG3显著 减少。在某些实施方案中，三肽序列中的氨基酸N突变成氨基酸A、 C、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W、 Y中的任何一 个。在某些实施方案中，三肽序列中的氨基酸N突变成保守置换。在 某些实施方案中，三肽序列中的氨基酸X突变成脯氨酸。在某些实施 方案中，三肽序列中的氨基酸S突变成A、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 V、 W、 Y。在某些实施方案中，三肽序列中的氛基酸 T突变成A、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 V、 W、 Y。在 某些实施方案中，三肽序列中的氨基酸C突变成A、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 V、 W、 Y。在某些实施方案中，三肽后的氨 基酸突变成P。在某些实施方案中，恒定区中的N-糖基化被酶促去除 (例如，N-糖苷酶F，内切糖苷酶Fl,内切糖苷酶F2，内切糖苷酶F3 和内切糖苷酶H )。去除N-糖基化还可以通过在对于N-糖基化具有缺 陷的细胞系中生产抗体来达到。Wright等人，J Immunol, 160 (7): 3393-402 ( 1998 )。在某些实施方案中，与附在恒定区的N-糖基化位点上的寡糖相互 作用的氨基酸残基进行突变，以减少与FcyRI的结合亲和力。例如， 人IgG3的F241、 V264、 D265可以进行突变。参见，Lund等人，J. Immunology 157: 4963-4969 (1996)。在某些实施方案中，效应子功能通过修饰人IgG的区域例如 233-236、 297和/或327-331而受损，如PCT W0 99/58572和Armour 等人，Molecular Immunology 40: 585-593 ( 2003 ) ; Reddy等人， J. Immunology 164: 1925-1933 ( 2000 )中所述。PCT W0 99/58572 和Armour等人中描述的抗体除针对靶分子的结合结构域外，还包含具 有这样的氨基酸序列的效应子结构域，所述氨基酸序列与人免疫球蛋 白重链的恒定区的所有或部分基本上同源。这些抗体能够结合靶分子， 而不引发显著的补体依赖性裂解，或细胞介导的靶破坏。在某些实施 方案中，效应子结构域具有对于FcyRI、 FcyRIIa和FcyRIII减少的亲 和力。在某些实施方案中，效应子结构域能够特异性结合FcRn和/或FcvRIIb。这些一般基于衍生自2个或更多人免疫球蛋白重链CH2结 构域的嵌合结构域。以这种方式修饰的抗体特别适合于用于长期抗体 疗法，以避免关于常规抗体疗法的炎症和其他不良反应。在某些实施 方案中，该抗体的重链恒定区是具有下述突变中的任何一个的人重链 IgGl: 1) A327A330P331至G327S330S331; 2 ) E233L234L235G236至 P233V234A235伴随删除的G236; 3 ) E233L234L235至P233V234A235; 4)E233L23札235G236A327A330P331至P233V234A235G327S330S331伴 随删除的 G236 ; 5 ) E233L234L235A327A330P331 至 P233V234A235G327S330S331;和6 ) N297至A297或除N外的任何其 他氨基酸。在某些实施方案中，该抗体的重链恒定区是具有下述突变 的人重链IgG2: A330P331至S330S331。在某些实施方案中，该抗体 的重链恒定区是具有下述突变中的任何一个的人重链IgG4: E233F234L235G236至P233V234A235伴随删除的G236; E233F23札235 至P233V234A235;和S228L235至P228E235。恒定区也可以进行修饰以损害补体激活。例如，在结合补体的Cl 组分后IgG抗体的补体激活可以通过使Cl结合基序(例如，Clq结合 基序)的恒定区中的氨基酸残基突变得到减少。已报道关于人IgGl 的D270、 K322、 P329、 P331各自的Ala突变显著减少抗体结合Clq 的能力并激活补体。对于鼠类IgG2b， Clq结合基序构成残基E318, K320和K322。 Idusogie等人，J. Immunology 164: 4178-4184( 2000 ); Duncan等人，Nature 322: 738-740 ( 1988 )。对于鼠类IgG2b鉴定的Clq结合基序E318、 K320和K322被认为 是其他抗体同种型共有的。Duncan等人，Nature 322: 738-740( 1988 )。 关于IgG2b的Clq结合活性可以通过用在其侧链上具有不合适的官能 性的残基替换3个指定残基中的任何一个被取消。不必仅用Ala替换 离子残基以取消Clq结合。还可以使用其他烷基取代的非离子残基， 例如Gly、 Ile、 Leu或Val，或此类芳香族非极性残基如Phe、 Tyr、 Trp和Pro代替3个残基中的任何一个，以便取消Clq结合。此外， 还可以使用此类极性非离子残基如Ser、 Thr、 Cys和Met代替残基320 和322而不是318，以便取消Clq结合活性。本发明还提供了具有受损的效应子功能的抗体，其中所迷抗体具 有经修饰的铰链区。人IgG对于其Fc受体的结合亲和力可以通过修饰 铰链区得到调节。Canfield等人，J. Exp. Med. 173:1483-1491( 1991 ); Hezareh等人，J. Virol, 75: 12161-12168 ( 2001 ) ; Redpath等人， Human Immunology 59: 720-727 ( 1998 )。特定氨基酸残基可以被突 变或删除。经修饰的铰链区可以包含衍生自与CH1结构域那种不同的 抗体种类或亚类的抗体的完整铰链区。例如，IgG类抗体的恒定结构 域(CH1)可以与IgG4类抗体的铰链区附着。备选地，新铰链区可以 包含天然铰链或重复单位的部分，其中重复中的每个单位衍生自天然 铰链区。在某些实施方案中，天然铰链区通过将一个或多个半胱氨酸 残基转变成中性残基例如丙氨酸，或通过将适当放置的残基转变成半 胱氨酸残基进行改变。参见，例如美国专利号5, 677, 425,此类改变 使用领域公认的蛋白质化学，以及优选地，遗传改造技术和如本文描 述的来进行。与trkB受体特异性结合和与具有受损的效应子功能的重链恒定 区融合的多肽也可以用于本文描述的方法。此类融合多肽的例子是免 疫粘附素。参见，例如美国专利号6, 153, 189。还可以使用本领域已知的制备具有受损的效应子功能的抗体的其 他方法。具有经修饰的恒定区的抗体和多肽可以在一种或多种测定法中进 行测试，以评估与起始抗体比较在生物活性中的效应子功能减少的水 平。例如，具有改变的Fc区的抗体或多肽结合补体或Fc受体(例如， 在小神经胶质细胞上的Fc受体)的能力，或改变的铰链区可以使用本 文乂〉开的测定法以及任何领域/>认的测定法进行评估。PCT W0 99/58572; Armour等人，Molecular Immunology 40: 585-593 ( 2003 ); Reddy等人，J. Immunology 164: 1925-1933 ( 2000 ); Song等人， Infection and Immunity 70: 5177-5184 (2002)。抗trkB激动剂抗体可以通过^f吏用表达trkB的一个或多个细胞外
结构域的免疫原来制备。免疫原的一个例子是具有高表达的trkB的细 胞，这可以如本文所描述的获得。可以使用的免疫原的另一个例子是 可溶蛋白(例如trkB免疫粘附素)，其包含trkB受体的细胞外结构 域或细胞外结构域的部分。宿主动物的免疫接种的途径和时间表一般与用于抗体刺激和生产 的确定和常规技术一致，如本文进一步描述的。用于生产人和小鼠抗 体的 一般技术是本领域已知的并在本文中得到描述。预期任何哺乳动物受试者包括人和由其的抗体生产细胞可以进行 处理，以充当用于生产哺乳动物包括人杂交瘤细胞系的基础。 一般地， 宿主动物用免疫原的量进行腹膜内接种，包括如本文描述的。杂交瘤可以由淋巴细胞和永生化的骨髄瘤细胞进行制备，使用 Kohler， B.和Milstein， C. ( 1975 ) Nature 256: 495-497 —般的或 如Buck, D. W.等人，(1982 ) In Vitro, 18: 377-381修改的体细 胞杂交技术。可用的骨髄瘤系包括但不限于，X63-Ag8. 653和来自Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif. ， USA 的那些可以在杂交中使用。 一般地，该技术涉及使用融合剂例如聚乙 二醇或通过本领域技术人员众所周知的电学方法使骨髓瘤细胞和淋巴 样细胞融合。融合后，细胞从融合培养基中进行分离，和在选择生长 培养基例如次黄噪呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT )培养基中生长，以消 除未杂交的亲本细胞。本文描述的培养基的任何一种补充或不补充血 清，可以用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另 一种备选方法，EBV永生化的B细胞可以用于生产本发明的抗trkB单 克隆抗体。必要时，杂交瘤进行扩增和亚克隆，并且通过常规的免疫 测定法操作(例如，放射性免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测 定法)就抗免疫原活性测定上清液。可以用作抗体来源的杂交瘤包含所有衍生物、生产对trkB或其部 分特异的单克隆抗体的亲本杂交瘤的后代细胞。生产此类抗体的杂交瘤可以使用已知操作在体外或体内进行培 养。必要时，单克隆抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化操作从培养 基或体液中进行分离，所述纯化操作例如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透 析、层析法和超滤。如果存在，那么不希望有的活性可以例如下述来去除通过在由与固相附着的免疫原制成的吸附剂上运行制剂，并且 使所需抗体与免疫原洗脱或释放。用人或其他种类的trkB受体、或人 或其他种类的trkB受体片段、或包含与蛋白质缀合的靶氨基酸序列的 人或其他种类的trkB受体或片段免疫接种宿主动物，所述蛋白质在待 免疫的种类中是免疫原性的，例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲 状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，使用双功能或衍生刑可以产生 抗体群体(例如单克隆抗体)，所述双功能或衍生剂例如马来酰亚胺 苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀 酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、S0C12、或RIN-ONR， 其中R和R1是不同的烷基。免疫原的另一个例子是具有高表达的trkB 的细胞，其可以得自重组方法，或通过分离或富集来自表达高水平的 trkB的天然来源的细胞。这些细胞可以具有人或其他动物来源，并可 以如直接分离的用作免疫原，或可以如此加工，使得免疫原性增加， 或trkB表达(或trkB的片段)得到增加或浓缩。此类处理包括但不 限于，用设计为增加其稳定性或免疫原性的试剂处理细胞或其片段， 所述试剂例如甲醛、戊二醛、乙醇、丙酮和/或各种酸。此外，在此类 处理前或后，细胞可以进行处理，以便富集所需免疫原，在这种情况 下是trkB或其片段。这些处理步骤可以包括本领域众所周知的膜分离技术。需要时，目的抗trkB抗体(单克隆或多克隆)可以进行测序，和 多核苷酸序列随后可以克隆到栽体内用于表达或增殖。编码目的抗体 的序列可以在载体中维持于宿主细胞中，和宿主细胞随后可以进行扩 增和冷冻用于未来使用。作为备选方法，多核苷酸序列可以用于遗传 操作，以使抗体"人源化"或改善亲和力，或抗体的其他特征。例如， 如果抗体在人中的临床试验和治疗中使用，那么恒定区可以改造为更 类似的人恒定区以避免免疫应答。可能希望处理抗体序列以获得对 trkB受体更大的亲和力和在激活trkB受体方面更大的功效。对本领
域技术人员显而易见的是，可以对抗trkB抗体进行一种或多种多核苷 酸变化，并且仍维持其对trkB细胞外结构域或trkB的表位结合的能 力。存在使单克隆抗体人源化的4个一般步骤。它们是(1)测定起 始抗体轻和重可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列，(2 )设计人 源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪个抗体构架区，(3)实际人 源化方法/技术，和(4)人源化抗体的转染和表达。参见，例如，美 国专利号4， 816， 567; 5， 807， 715; 5， 866， 692; 6， 331， 415; 5， 530， 101; 5, 693, 761; 5, 693, 762; 5, 585, 089; 6,180,370;和6， 548， 640.例 如，如果抗体在人中的临床试验和治疗中使用，那么恒定区可以改造 为更类似的人恒定区以避免免疫应答。参见，例如，美国专利号 5，997，867和5，866，692。包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的许多"人源化"抗 体分子已得到描述，包括具有与人恒定结构域融合的啮齿类动物或经 修饰的啮齿类动物V区及其关联的互补决定区(CDRs)的嵌合抗体。 参见，例如Winter等人Nature 349: 293-299 ( 1991 ) , Lobuglio 等人Proc, Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224 ( 1989 ) ， Shaw等 人J Immunol. 138: 4534-4538 ( 1987 ),和Brown等人Cancer Res. 47: 3577-3583 ( 1987 )。其他参考文献描述了在与合适的人抗体恒定 结构域融合前，移植到人支持构架区(FR)内的啮齿类动物CDRs。参 见，例如Riechmann等人Nature 332: 323-327 ( 1988 )， Verhoeyen 等人Science 239: 1534-1536 ( 1988 )，和Jones等人Nature 321: 522-525 ( 1986 )。另一篇参考文献描述了由重组镶盖的啮齿类动物构 架区支持的啮齿类动物CDRs。参见，例如欧洲专利公开号519, 596。 这些"人源化的"分子设计为使针对啮齿类动物抗人抗体分子的不希 望有的免疫应答降到最低，这限制了那些部分的治疗应用在人接受者 中的持续时间和效力。抗体恒定区可以这样改造，使得它是免疫学惰 性的，例如不引发补体介导的裂解或不刺激抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性(ADCC)。在其他实施方案中，恒定区如下述参考文献中所述
进行修饰Eur. J. Immunol. ( 1999 ) 29: 2613-2624; PCT申请号 PCT/GB99/01441;和/或英国专利申请号9809951. 8。参见，例如，PCT申请号PCT/GB99/01441;英国专利申请号 9809951.8。还可以利用的使抗体人源化的其他方法由Daugherty等 人，Nucl. Acids Res, 19: 2471-2476 ( 1991 )和在美国专利号 6, 180, 377 ; 6, 054, 297 ; 5, 997, 867 ; 5, 866,692 ; 6,210,671; 6, 350, 861;以及PCT/JHf号WO 01/27160中/>开。在另外一个备选方案中，全人抗体可以通过使用商购可得的小鼠 来获得，所述小鼠以进行改造以表达特异性人免疫球蛋白蛋白质。设 计为生产更需要的(例如，全人抗体)或更强的免疫应答的转基因动 物也可以用于产生人源化或人抗体。此类技术的例子是来自Abgenix, Inc. ( Fremont ，CA )的Xenomouse 了"和HuMAb-Mouse⑧以及来自Medarex， Inc. (Princeton, NJ )的TC Mouse ,在一个备选方案中，抗体可以使用本领域已知的任何方法进行重 组制备和表达。在另一个备选方案中，抗体可以通过噬菌体展示技术 进行重组制备。参见，例如，美国专利号5, 565, 332; 5, 580, 717; 5， 733， 743和6， 265， 150;和Winter等人，Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 ( 1994 )。备选地，噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 3": 552-553 ( 1990 ))可以用于在体外由来自未免疫供体的免疫球 蛋白可变(V)结构域基因库生产人抗体和抗体片段。根据这种技术， 抗体V结构域基因在框内克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白质 基因内，例如M13或fd，并作为功能抗体片段在噬菌体克隆表面上展 示。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DM拷贝，所以基于抗体 的功能性质的选择也导致编码显示那些性质的抗体的基因的选择。因 此，噬菌体模拟B细胞的某些性质。噬菌体展示可以以各种方式来进 行；关于综述，参见，例如，Johnson, Kevin S.和Chiswell， David J. , Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 ( 1993 )。 V基因区段的几种来源可以用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature 352: 624-628 ( 1991 )从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小型随机组 合文库中分离了各种多样的抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的v基因库，并且针对广泛多样抗原(包括自身抗原)的抗体可 以基本上根据由Mark等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 ( 1991 )， 或Griffith等人，EMB0 J. 12: 725-734 ( 1993 )描述的技术进行分 离。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率积聚突变(体细胞高度突 变)。引入的某些改变将赋予更高的亲和力，和显示高亲和力表面免 疫球蛋白的B细胞在后续抗原攻击期间优先进行复制和分化。这种天 然过程可以通过利用称为"链改组"的技术进行模拟。Marks,等人， Bio/Technol. 10: 779-783 ( 1992 ))。在这种方法中。通过逸菌体 展示获得的"初级"人抗体的亲和力，可以通过用得自未免疫供体的 V结构域基因的天然存在的变体(库)顺次替换重和轻链V区基因得 到改善。这种技术允许生产具有pM - nM范围中的亲和力的抗体和抗体 片段。用于制备极大型噬菌体抗体库(也称为"所有文库之母文库(the mother-of-all libraries )，，)的策略已由Waterhouse等人，Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 ( 1993 )进行描述。基因改组也可以用于 由啮齿类动物抗体衍生人抗体，其中人可以具有与起始啮齿类动物抗 体相似的亲和力和特异性。根据这种方法，这也称为"表位印迹"， 通过噬菌体展示技术获得的啮齿类动物抗体的重或轻链V结构域基因 用人V结构域基因的库替换，产生啮齿类动物-人嵌合体。对抗原的选 择导致分离能够恢复功能抗原结合位点的人可变区，即表位控制(印 迹)配偶体的选择。当重复该过程以便替换剩余的啮齿类动物V结构 域时，获得人抗体(参见1993年4月1日公开的PCT公开号WO 93/06213 )。与通过CDR移植的啮齿类动物抗体的常规人源化不同， 这种技术提供了全人抗体，其没有啮齿类动物来源的构架或CDR残基， 显而易见的是尽管上述讨论涉及人源化抗体，但讨论的 一般原则可应 用于用于例如在犬、猫、老大、马科动物和牛科动物中使用的定制抗 体。抗体可以是双特异性抗体，具有对于至少2种不同抗原的结合特 异性的单克隆抗体可以使用本文公开的抗体进行制备。用于制备双特
异性抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Suresh等人，l"6, Methods in Enzymology 121: 210)。 一般地，双特异性抗体的重组 生产基于2个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中2条重链具有不 同的特异性(Millstein和Cuello， 1983， Nature 305， 537-539 )。根据制备双特异性抗体的一种方法，具有所需结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。 融合优选用免疫球蛋白重链恒定结构域，包含至少部分铰链、CH2和 CH3区。优选具有包含对轻链结合所需的位点的第一个重链恒定区 (CH1)，存在于融合物的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合物 的DNAs，和需要时免疫球蛋白轻链，插入分开的表达栽体内，并且共 转染到合适的宿主生物体内。当在构建中使用不等比的3种多肽链提 供最佳得率时，这在实施方案中在调整3种多肽片段的相互比例方面 提供了更大的灵活性。然而，当至少2种多肽链以相同比表达导致高 得率时或当该比率没有特别的重要性时，可以将关于2种或所有3种 多肽链的编码序列插入1个表达载体中。在一种方法中，双特异性抗体由在1个臂中具有第一种结合特异 性的杂交免疫球蛋白重链，和在另一个臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)构成。这种不对称结构，在仅一半 的双特异性分子中具有免疫球蛋白轻链，有助于所需双特异性化合物 与不需要的免疫球蛋白链组合的分离。这种方法在PCT公开号W0 94/04690中得到描述。包含2种共价连接的抗体的异缀合物抗体也在本发明的范围内。 此类抗体已用于使免疫系统细胞把向不需要的细胞(美国专利号 4， 676， 980 )，和用于治疗HIV感染(PCT公开号W0 91/00360和W0 92/200373;和EP 03089 )。异缀合物抗体可以使用任何常规的交联 法进行制备。合适的交联剂和技术是本领域众所周知的，并在美国专 利号4, 676, 980中得到描述。抗体可以通过下述进行重组制备首先分离由宿主动物制备的抗 体，获得基因序列，和使用基因序列以在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组表达抗体。可以使用的另一种方法是在植物(例如烟草)、转 基因乳或其他生物体中表达抗体序列。用于在植物或乳中重組表达抗体的方法已得到公开。参见，例如，Peeters等人(2001 ) Vaccine 19: 2756; Lonberg， N.和D. Huszar ( 1995 ) Int. Rev. Immunol 13: 65; 和Pollock等人(1999 ) J Immunol Methods 231: 147。用于制备抗 体衍生物例如人源化、单链等的方法是本领域已知的。嵌合或杂交抗体也可以使用合成蛋白质化学的已知方法在体外进 行制备，所述方法包括涉及交联剂的那些。例如，免疫毒素可以使用 二硫化物交换反应或通过形成硫醚键进行构建。用于这个目的的合适 的试剂的例子包括亚氨疏醇盐(iminothiolate )和甲基-4-l^e^captobuty^imidate。还可以生产单链Fv片段，例如Iliades等人，1997 ， FEBS Letters, 409: 437-441中描述的。此类单链片段使用各种连接体的 偶联在Kortt等人，1997， Protein Engineering, 10: 423-433中得 到描述。用于抗体的重组生产和处理的各种技术是本领域众所周知的。抗体可以如1999年11月18日公开的PCT/〉开号W0 99/58572 中所述的进行修饰。这些抗体除针对乾分子的结合结构域外，还包含 具有这样的氨基酸序列的效应子结构域，所迷氨基酸序列与人免疫球 蛋白重链的恒定结构域的所有或部分基本上同源。这些抗体能够结合 靶分子，而不引发显著的补体依赖性裂解，或细胞介导的靶破坏。优 选地，效应子结构域能够特异性结合FcRn和/或Fc yRIIb。这些一般 基于衍生自2个或更多人免疫球蛋白重链CH2结构域的嵌合结构域。 以这种方式修饰的抗体优选用于在长期抗体疗法中使用，以避免关于 常规抗体疗法的炎症和其他不良反应。通过宿主动物的免疫接种或重组制备的抗体应显示出本文描述的 一种或多种trkB激动剂活性。免疫测定法和流式细胞分选技术例如荧光激活细胞分选(FACS ) 也可以用于分离对trkB特异的抗体。抗体可以与许多不同的载体结合。载体可以是活性和/或惰性的。
众所周知的载体的例子包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼 龙、淀粉酶、玻璃、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。 为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。本领域技 术人员将知道用于结合抗体的其他合适的栽体，或将能够使用常规实 验确定这点。编码激动剂抗trkB抗体的DNA可以如本领域已知的进行测序。一 般地，单克隆抗体使用常规操作容易地分离和测序(例如，通过使用 能够与编码单克隆抗体的重和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探 针)。杂交瘤细胞充当此类cDNA的优选来源。分离后，DNA可以置于 表达载体(例如PCT公开号WO 87/04462中公开的表达载体)内，所 述表达载体随后转染到否则不生产免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞内， 所述宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猴C0S细胞、中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞、或骨髄瘤细胞，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。 参见，例如，PCT乂^开号W0 87/04462, DNA还可以例如通过下述进行 修饰用关于人重和轻链恒定结构域的编码序列替代同源的鼠类序列， Morrison等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 ( 1984 )，或通过 使免疫球蛋白编码序列与关于非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序 列共价连接。以那种方式，制备具有本文的抗trkB单克隆抗体的结合 特异性的"嵌合"或"杂交"抗体。如本文所述的，编码激动剂抗trkB 抗体(例如其抗原结合片段)的DNA也可以用于在所需细胞中递送和 表达激动剂抗trkB抗体。DNA递送技术在本文中进一步描述。抗trkB抗体可以^吏用本领域众所周知的方法进行表征。例如，一 种方法是鉴定它与之结合的表位，包括解决抗体-抗原复合物的晶体结 构，竟争测定法，基因片段表达测定法，和基于合成肽的测定法，如 ^^ij如Harlow和Lane, ^^//7g J力f/6of/i'es， a Za6orafoTyi^fl/zi/fl7， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, l"9中的第11章中所述。在另外的例子中，表位作图可以用于测定 抗trkB抗体与之结合的序列。表位作图从各种来源商购可得，例如， Pepscan Systems ( Edelhertweg 15 ， 8219 PH Lelystad ， The
Netherlands),表位可以是线性表位，即包含在单段氨基酸中，或者 是由氨基酸的三维相互作用形成的构象表位，其可以无需包含在单段 中。各种长度(例如，长至少4-6个氨基酸)的肽可以进行分离或合 成(例如，重组地)，并用于使用抗trkB抗体的结合测定法。在另一 个例子中，抗trkB抗体与之结合的表位可以通过下述在系统筛选中进 行测定使用衍生自trkB细胞外序列的重叠肽，并测定经由抗trkB 抗体的结合。根据基因片段表达测定法，编码trkB的开放读码框随机 地或通过特定基因构建体进行断裂，并测定trkB的表达片段与待测试 的抗体的反应性。基因片段可以例如通过PCR产生，并且随后在放射 性氨基酸的存在下，在体外进行转录并翻译成蛋白质。抗体与放射性 标记的trkB片段的结合随后通过免疫沉淀和凝胶电泳进行测定。某些 表位还可以通过使用展示在噬菌体颗粒表面上的大型随机肽序列文库 (噬菌体文库)进行鉴定。可以用于表征抗trkB抗体的另外一种方法是使用已知与相同抗 原结合的其他抗体的竟争测定法，所述抗原即trkB细胞外结构域，以 确定抗trkB抗体是否结合与其他抗体相同的表位。竟争测定法是本领 域技术人员众所周知的。用于竟争测定法的抗体的例子包括下述抗 体6. 1. 2、 6.4.1、 2345、 2349、 2.5.1、 2344、 2248、 2250、 2253和 2256。参见PCT公开号WO 01/98361。表位作图还可以使用如PCT公开号WO 01/98361中描述的结构域 交换突变体来进行。 一般地，这种方法对于不与trkA或trkC显著交 叉反应的抗trkB抗体有用。trkB的结构域交换突变体可以通过用来 自trkC或trkA的相应结构域替换trkB的细胞外结构域来制备。每种 激动剂抗trkB抗体与各种结构域交换突变体的结合可以使用ELISA 或本领域已知的其他方法进行评估，并与它和野生型(天然)trkB的 结合进行比较。在另一种方法中，可以进行丙氨酸扫描。该抗原trkB 受体的单个残基被系统突变成另一种氨基酸(通常为丙氨酸)，并且 通过使用ELISA或本领域已知的其他方法测试经修饰的trkB与抗体的 结合的能力来评估改变的影响。 BDNF多肽本发明的方法中使用的trkB激动剂包括BDNF多肽。如本文所4吏 用的，"BDNF多肽"包括天然存在的成熟蛋白质(可互换地称为 "BDNF")，例如美国专利号5,180,820中所示的成熟的人BDNF，和 BDNF天然存在的氨基酸序列变体；BDNF的氨基酸序列变体；成熟的 BDNF (例如人)和所述氨基酸序列变体的肽片段；和经修饰形式的成 熟的BDNF和所述氨基酸序列变体和肽片段，其中多肽或肽已通过用除 天然存在的氨基酸外的部分置换进行共价修饰，只要氨基酸序列变体、 肽片段及其经修饰的形式显示出trkB激动剂和/或天然存在的成熟的 BDNF蛋白质的一种或多种生物活性。TrkB激动剂还包括融合蛋白和缀 合物，其包含本文描述的BDNF多肽实施方案中的任何一种，例如，与 半衰期延长部分例如PEG或肽缀合或融合的BDNF多肽。考虑的氨基酸 序列变体，肽片段(包括变体的片段)，或其经修饰的形式不包括任 何动物种类的NGF、 NT-4/5或NT-3。 BDNF多肽包括本文描述的任何一 个或多个实施方案。例如，BDNF多肽包含具有一个或多个氨基酸插入、 删除或置换的天然存在的序列。在某些实施方案中，BDNF多肽是哺乳动物BDNF多肽，其可以是 天然存在的哺乳动物BDNF，或衍生自天然存在的哺乳动物BDNF并具 有这样的序列的BDNF多肽，所述序列不匹配天然存在的非哺乳动物 BDNF的任何部分。在某些实施方案中，BDNF多肽是人BDNF多肽，其 可以是天然存在的人BDNF，或衍生自天然存在的人BDNF并具有这样 的序列的BDNF多肽，所述序列不匹配天然存在的非人BDNF的任何部 分。本发明的BDNF多肽，包括BDNF多肽(包括天然存在的BDNF )的 变体、肽片段、经修饰的形式、融合蛋白和缀合物的特征在于下述特 征中的任何(一种或多种)(a)与trkB受体结合；(b)与trkB 受体结合并激活trkB生物活性和/或由trkB信号功能介导的一种或多 种下游途径；(c)当外周施用时，与trkB受体结合并在灵长类动物 中增加体重和/或食物摄入；(d)当外周施用时，与trkB受体结合， 并治疗、预防、逆转或改善灵长类动物中的恶病质的一种或多种症状；(e)当外周施用时，与trkB受体结合，并治疗、预防、逆转或改善 灵长类动物中的神经性厌食的一种或多种症状；(f)当外周施用时， 与trkB受体结合，并治疗、预防、逆转或改善哺乳动物中的阿片样物 质诱导的呕吐的一种或多种症状；(g )促进trkB受体二聚化和活化； 和(h)增加trkB受体依赖性神经元存活和/或神经突长出。因此，所 有BDNF多肽(包括变体、片段和经修饰的形式)具有如上所述的功能。变体的生物活性可以使用本领域已知的方法和本文描述的方法在 体外和体内进行测试。与天然存在的BDNF蛋白质比较，BDNF多肽可 以具有增强的活性或减少的活性。在某些实施方案中，就上文描述(或 本领域已知的)的一种或多种生物测定法而言，与BDNF多肽由其衍生 的天然BDNF蛋白质比较，功能上等价的变体具有至少约50%、 60%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90 %或95 %中的任何一个的活性。在某些 实施方案中，功能上等价的变体在体外TrkB受体活化中(例如实施例 6中，以及在美国专利申请号2005/0209148和PCT />开号WO 2005/082401中描述的测定法)具有小于约0. 01 nM、 0.1 nM、 1 nM、 10 nM或100 nM中的任何一个的EC5。(半数最大有效浓度)。BDNF的氨基酸序列变体包括具有这样的氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列由于天然存在的BDNF (例如成熟的人BDNF )的序列内的一 个或多个氨基酸残基的插入、删除和/或置换，而不同于天然存在的 BDNF。氨基酸序列变体一般将与任何天然存在的BDNF (例如成熟的人 BDNF)至少约65。/。、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98 %或99%等同。在某些实施方案中，变体与成熟的人BDNF 的氨基酸序列至少约70%等同。在某些实施方案中，变体与成熟的人 BDNF的氨基酸序列至少约85%等同。在某些实施方案中，变体与成熟 的人BDNF的氨基酸序列至少约90%等同。在某些实施方案中，变体 与成熟的人BDNF的氨基酸序列至少约95%等同。将BDNF转变成NGF、 BDNF或NT-3的此类变体不包括在本发明的 范围内。因此，尽管用于引入氨基酸序列变体的位点是预定的，但突
变的性质本身无需是预定的。例如，为了优化在给定位点处的突变的性能，ala扫描或随机诱变在靶密码子或区域处进行，和表达的BDNF变体就优化的所需活性进行筛选。氨基酸序列缺失一般为约l个-30个残基，更优选地，约l个-IO个残基，和一般是邻接的。缺失可以在BDNF、 NGF、 NT-3和NT-4/5 中低同源性的区域内引入以修饰BDNF的活性。来自BDNF的与NT-4/5、 NT-3和NGF基本同源的区域中的缺失也许更可能更显著地修饰BDNF 的生物活性。可以选择连续删除的数目，以便保留受影响的结构域中 BDNF的三级结构，例如p折叠片或a螺旋。氨基酸序列插入包括长度为1个残基到包含1000个或更多残基的 多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列 内插入。序列内插入(即，在成熟的BDNF序列内的插入) 一般可以为 约1个-10个残基，更优选地，1个-5个，最优选地1个-3个。末 端插入的例子包括异源N末端信号序列与BDNF分子的N末端的融合， 以促进成熟的BDNF从重组宿主中分泌。此类信号一般将与预期的宿主 细胞同源，并且包括用于大肠杆菌的STII或lpp,用于酵母的oc因子， 和用于哺乳动物细胞的病毒信号例如疱渗gD。其他插入包括多肽与 BDNF的N或C末端的融合物。另 一组变体包括其中BDNF中的至少一个氨基酸残基和优选地仅1 个已被去除和不同的残基插入其位置中的那些变体。例子是精氨酸和 赖氨酸被其他氨基酸替换，以使得BDNF对经由丝氨酸蛋白酶的蛋白质 水解有抵抗力，从而制备更稳定的BDNF变体。对于置换诱变最感兴趣 的位点包括这样的位点，其中在BDNF、 NGF、 NT-3和NT-4/5中发现的 氨基酸就侧链体积、电荷或疏水性而言基本上不同，但其中在NGF、 NT-3和NT-4/5的各种动物类似物(例如，在所有动物NGFs,所有动 物NT-3，和所有BDNFs中)内在所选择的位点上还存在高度同源性。 这个分析将突出可能涉及营养因子的活性的区分的残基，和因此在这 些位点上的变体可以影响此类活性。其他感兴趣的位点是其中残基在 所有动物种类BDNF、 NGF、 NT-3和NT"/5中相同的位点，这种构象程
度暗示达到在所有4种因子共有的生物活性中的重要性。例如， 一个或多个氨基酸的置换包括保守置换。制备保守置换的 方法是本领域已知的。例如，ala (A)可以被val、 leu、 ile，优选 地被val置换；arg (R)可以被lys、 gln、 asn，优选地被lys置换； asn (N)可以被gln、 his、 lys、 arg，优选地被gln置换；asp(D) 可以被glu置换；cys (C)可以被ser置换；gln ( Q)可以被asn置 换；glu (E)可以被asp置换；gly (G)可以被pro置换；his(H) 可以被asn、 gln、 lys、 arg，优选地被arg置换；ile ( I)可以被leu、 val、 met、 ala、 phe、正亮氨酸，优选地被leu置换；leu(L)可以 被正亮氨酸、ile、 val、 met; ala; phe，优选地被ile置换；lys ( K) 可以被arg; gln、 asn,优选地被arg置换；met (M)可以被leu; phe; ile,优选地^皮leu置换；phe ( F)可以被leu、 val、 ile、 ala，优 选地被leu置换；pro (P)可以被gly置换；ser ( S )可以被thr置 换；thr (T)可以被ser置换；trp (W)可以被tyr置换；tyr(Y) 可以4皮trp、 phe、 thr、 ser，优选地被phe置换；val ( V)可以被ile; leu; met; phe、 ala;正亮氨酸,优选地被leu置换。在功能中的基本修饰可以通过选择在其对维持下述的影响方面显 著不同的置换来完成U)置换区域中的多肽主链的结构，例如作为 折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点上的电荷或疏水性，或(c)侧 链的体积。天然存在的残基基于共有的侧链性质进行分组(这些中的 一些可以包括在几个功能组内)(1) 疏水的正亮氨酸，met, ala， val， leu， ile;(2) 中性亲7jc的cys， ser, thr;(3) 酸性的asp, glu;(4) 碱性的asn， gln， his, lys， arg'，(5) 影响链定向的残基gly， pro;和(6) 芳香族的trp, tyr, phe。非保守置换将使得能够把这些种类中的一个的成员换成另 一个。 BDNF的氨基酸序列变体可以是天然存在的或可以合成制备，例如 通过将合适的核苷酸变化引入先前分离的BDNFDNA内，或通过体外合 成所需变体多肽。如上所述，此类变体可以包含来自成熟的BDNF的氨 基酸序列(例如，表l中所示的序列)内的一个或多个氨基酸残基的 删除、或插入或置换。制备删除、插入和置换的任何组合，以达到BDNF的氨基酸残基变体，条件是所得到的变体多肽具有所需特征。氨基酸 变化还可以导致在重组宿主中表达后BDNF的进一步修饰，例如，引入 或去除糖基化位点，或引入膜锚定序列(依照PCT W0 89/01041 )。在某些实施方案中，BDNF多肽包含由这样的核酸编码的氨基酸序 列，所述核酸在严格条件下与编码成熟的人BDNF的核酸序列杂交。变体多核苷酸还可以或备选地与天然基因或其部分或互补物基本上同源。此类多核苷酸变体在中等严格条件下能够与编码该多肽(或 互补序列)的天然存在的DNA序列杂交。本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并，存在编码如本 文所描述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天 然基因的核苷酸序列具有最低限度的同源性。不过，本发明特别预期 了由于密码子使用中的差异而改变的多核苷酸。此外，包含本发明提 供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是 由于一种或多种突变而改变的内源基因，所述突变例如核苷酸缺失、 添加和/或置换。所得到的mRNA和蛋白质可以但无需具有改变的结构 或功能。等位基因可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序 列比较)进行鉴定。本发明的方法中使用的TrkB激动剂还包括融合蛋白，其包含BDNF 的氨基酸序列(例如，人BDNF)或其功能肽片段。生物学活性的BDNF 多肽可以与序列例如增强免疫反应性的序列融合，促进多肽与支持物 或载体的偶联，或促进重折叠和/或纯化(例如，编码表位的序列，例 如Myc，衍生自流感病毒血凝素的HA， His-6， FLAG)。这些序列可以 与BDNF多肽在N末端或C末端上融合。此外，蛋白质或多核苷酸可以 与其他或多肽融合，所述序列增加其功能或指定其在细胞中的定位， 例如分泌序列。用于生产上文所迷的重组融合蛋白的方法是本领域已 知的。重组融合蛋白可以通过本领域众所周知的方法进行生产、重折 叠和分离。本文描述的BDNF多肽可以进行修饰以增加其在个体中的半衰期。 例如，BDNF多肽可以进行聚乙二醇化以减少全身性清除，伴随生物活 性的最低限度丧失。本发明还提供了包含与PEG分子连接的BDNF多肽 的组合物(包括药物组合物)。在某些实施方案中，PEG分子通过可 逆连接与BDNF多肽连接。聚乙二醇化的BDNF多肽的半衰期可以延长 超过非聚乙二醇化的BDNF多肽的半衰期约2倍、5倍、10-倍、15-倍、 20-倍和30-倍中的任何一个。PEG聚合物可以使用本领域已知的方法与BDNF多肽的各种官能团 进行连接。参见，例如，Roberts等人,Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476 ( 2002 ); Sakane等人户力織M 14: 1085-91 ( 1997 )。 PEG可以与多肽上的下述官能团进行连接氨基、羧基、经修饰的或 天然的N末端、胺基和巯基。在某些实施方案中， 一个或多个表面氨 基酸残基用PEG分子进行修饰。PEG分子可以具有各种大小(例如， 范围约2-40 kDa)。与BDNF多肽连接的PEG分子可以具有约2000、 10， 000、 15, 000、 20, 000、 25, 000、 30, 000、 35,000、 40, 000 Da中 的任何一个的分子量。PEG分子可以是单链或支链。为了使PEG与BDNF 多肽连接，可以使用在1个或2个末端上具有官能团的PEG的衍生物。 官能团基于在BDNF多肽上可用的反应基团的类型进行选择。使衍生物 与多肽连接的方法是本领域已知的。Roberts等人，Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476 ( 2002 ) 。 BDNF多肽和PEG之间的连 接也可以是这样的，使得它可以在个体中进行切割或天然降解(可逆 的或可降解的连接)，这可以改善半衰期而使活性的丧失降到最低。 在BDNF多肽上的PEG连接位点还可以通过使表面残基突变成具有PEG 反应基团的氨基酸残基例如半胱氨酸进行制备。BDNF多肽可以通过重组方法，即，通过表达编码BDNF多肽的核 酸来产生。在重组细胞培养物中，和任选地，来自细胞培养物的变体 多肽的纯化，例如通过变体的活性的生物测定法或通过在包含兔抗 BDNF多克隆抗体(这将与同样存在于天然BDNF上的变体的至少一个 免疫表位结合)的免疫亲和柱上吸附。约40个残基或更少的小型肽片 段通过体外方法方便地制备。编码BDNF多肽的DNA可以克隆到表达载体内用于在宿主细胞中表 达蛋白质。编码BDNF多肽的核酸的例子在美国专利申请公开号 2003/0203383中得到描述。编码以其成熟形式的BDNF多肽的DM可 以在其氨基末端上与分泌信号连接。这种分泌信号优选是通常在体内 指导BDNF由人细胞分泌的BDNF前序列。然而，合适的分泌信号还包 括来自其他动物BDNF的信号，来自NGF、 NT-2或NT-3的信号，病毒 信号，或来自相同或无关种类的分泌多肽的信号。任何宿主细胞(例 如大肠杆菌)可以用于表达蛋白质或多肽。表达的BDNF多肽可以进行纯化。BDNF多肽可以作为分泌的蛋白 质从培养基中进行回收，尽管当不含分泌信号直接表达时，它也可以 从宿主细胞裂解物中进行回收。可以使用本领域已知的蛋白质纯化方 法。生产BDNF多肽和纯化表达的BDNF多肽的方法是本领域已知的。 BDNF多肽可以在大肠杆菌中进行表达并且根据本领域已知的方法进 行重折叠。成熟的人BDNF还可以商购获得(例如，从MD Systems )。用于产生和生产NT-4/5多肽的方法也可以用于产生和生产BDNF 多肽。trkB激动剂的鉴定TrkB激动剂(例如抗体)可以使用领域7>认的方法进行鉴定，包 括下述方法中的一种或多种。例如，可以使用在美国专利号5， 766， 863 和5,891, 650中描述的激酶受体激活(KIRA)。这种ELISA类型的测 定法适合于通过测量受体蛋白质酪氨酸激酶(rPTK，例如trk受体) 的激酶结构域的自磷酸化来定性或定量测量激酶活化，以及用于鉴定 和表征所选择的rPTK的潜在激动剂或拮抗剂。测定法的第一个阶段涉 及激酶受体(在本文的情况下是trkB受体)的激酶结构域的磷酸化， 其中所述受体存在于真核细胞的细胞膜中。受体可以是内源性受体或 编码受体的核酸，或受体构建体可以转化到细胞内。 一般地，第一种 固相(例如，第 一个测定平板的孔)用此类细胞基本上同质的群体(例 如哺乳动物细胞系)进行包被，从而使得细胞与固相附着。通常，细 胞是附着的，并因此与第一种固相天然附着。如果使用"受体构建体"，那么它通常包含激酶受体和标记多肽的融合物。在测定法的ELISA部 分，标记多肽由捕获剂通常为捕获抗体识别。随后将分析物例如候选 激动剂加入具有贴壁细胞的孔中，从而使得酪氨酸激酶受体(例如， trkB受体)暴露于分析物(或与之接触)。这种测定法使得能够鉴定 关于目的酪氨酸激酶受体(例如trkB)的激动剂配体。暴露于分析物 后，贴壁细胞使用裂解緩沖液(它在其中具有增溶去污剂)和轻轻搅 动进行溶解，从而释放细胞裂解物，无需浓缩或澄清细胞裂解物，可 以直接对所述细胞裂解物实施测定法的ELISA部分。因此制备的细胞裂解物随后准备实施测定法的ELISA阶段。作为 ELISA阶段中的第一个步骤，第二种固相(通常为ELISA微量滴定板 的孔)用捕获剂(通常为捕获抗体)进行包被，所述捕获剂与酪氨酸 激酶受体特异性结合，或在受体构建体的情况下与标记多肽特异性结 合。第二种固相的包被如此进行，使得捕获剂与第二种固相附着。捕 获剂一般是单克隆抗体，但如本文实施例中所述，还可以使用多克隆 抗体或其他试剂。随后使获得的细胞裂解物暴露于附着的捕获剂，或 与之接触，从而使得受体或受体捕获剂与第二种固相附着(或捕获在 其中)。随后执行洗涤步骤，以便去除未结合的细胞裂解物，留下捕 获的受体或受体构建体。随后使附着或捕获的受体或受体构建体暴露 于抗磷酸酪氨酸抗体或与之接触，所述抗磷酸酪氨酸抗体鉴定酪氨酸激酶受体中磷酸化的酪氨酸残基。在优选实施方案中，抗砩酸酪氨酸 抗体与催化非放射性显色试剂的颜色变化的酶缀合(直接或间接地)。因此，受体的磷酸化可以通过试剂的后续颜色变化进行测量。酶可以 直接与抗砩酸酪氨酸抗体结合，或缀合分子(例如，生物素)可以与 抗磷酸酪氨酸抗体缀合，和酶随后可以经由缀合分子与抗磷酸酪氨酸抗体结合。最后，例如通过显色试剂中的颜色变化来测量抗磷酸酪氨 酸抗体与捕获的受体或受体构建体的结合。
最初鉴定后，候选物(例如，抗trkB单克隆抗体)的激动剂活性 可以通过已知测试靶向生物活性的生物测定法进一步证实和改善。例 如，候选物拮抗trkB的能力可以在PC12神经突长出测定法中进行测 试，使用用全长trkB转染的PC12细胞Uian等人，Cell Signal. 8: 365-70 ， 1996 )。这种测定法通过大鼠嗜铬细胞瘤(原文为 pheocytochroma ，疑为pheochromocytoma )细胞(PC12)响应经由 合适的配体的刺激的神经突长出进程。这些细胞表达内源性trkA并因 此响应NGF。然而，它们不表达内源性trkB并因此用trkB表达构建 体进行转染，以便引发对trkB激动剂的应答。使转染细胞与候选物一 起温育后，测量神经突长出，并计数例如具有超过细胞直径2倍的神 经突的细胞。在转染的PC12细胞中刺激神经突长出的候选物(例如抗 trkB抗体)证实trkB激动剂活性。trkB的活化也可以通过使用在胚胎发育的特定阶段时的各种特 定神经元进行测定。适当选择的神经元可以依赖trkB活化用于存活， 并且因此可以通过跟踪这些神经元在体外的存活来测定trkB的活化。 如杲候选物激活trkB，那么向合适的神经元的原代培养中加入候选物 将导致这些神经元至少数天的时间段的存活。这允许测定候选物(例 如抗trkB抗体)激活trkB的能力。在这种类型的测定法的一个例子 中，来自E15小鼠胚胎的结状神经节被切开、解离，并将所得到的神 经元以低密度在组织培养i中进行铺板。随后将候选抗体加入培养基 中，并且使平板温育24 - 48小时。这段时间后，通过各种方法中的任 何一种进行评估神经元的存活。接受激动剂的样品一般将显示超过接 受对照抗体的样品增加的存活率，并且这允许测定激动剂的存在。参 见，例如Buchman等人(1993 ) Development 118 ( 3 ) : 989-1001。TrkB激动剂可以通过其在各种细胞类型中激活下游信号的能力 进行鉴定，所述细胞天然地或在编码trkB的DNA转染后表达trkB。 这种trkB可以是人或其他哺乳动物(例如，啮齿类动物或灵长类动物) trkB。下游信号级联可以通过关于trkB表达细胞的各种生物化学或生 理参数的改变进行检测，例如蛋白质表达的水平或蛋白质的蛋白质砩 酸化，或关于细胞的代谢或生长状态的变化(包括神经元存活和/或神 经突长出，如本文所描述的)。检测相关生物化学或生理参数的方法 是本领域已知的。V.试剂盒本发明还提供了用于在本方法中使用的试剂盒。本发明的试剂盒包括包含纯化的trkB激动剂(例如，天然存在的NT-4/5或BDNF，和 抗trkB激动剂抗体)的一种或多种容器，和用于依照本文描述的本发 明的任何方法使用的说明书。 一般地，这些说明书包含根据本文描述 的任何方法施用trkB激动剂以治疗疾病的说明，所述疾病例如恶病 质、神经性厌食和阿片样物质诱导的呕吐。试剂盒可以进一步包含基 于鉴定那个个体是否具有疾病和疾病的状态选择适合于治疗的个体的 说明。涉及trkB激动剂的用途的说明书一般包括关于用于预期治疗的 剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装 (例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明 书一般是在标签或药品说明书上的书面说明书(例如，包括在试剂盒 中的纸片)，但机器可读说明书(例如，在磁或光存储盘上携带的说 明书)也是可接受的。标签或药品说明书指出组合物用于治疗本文描述的疾病(例如， 恶病质、神经性厌食和阿片样物质诱导的呕吐)。说明书可以提供用 于实践本文描迷的任何方法。本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于，管 形瓶、瓶、罐、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。还考虑 的是用于与特定装置组合使用的包装，所述特定装置例如吸入器、鼻 施用装置(例如，喷雾器)或输注装置例如微型泵。试剂盒可以具有 无菌入口 (例如容器可以是具有可由皮下注射针穿透的塞子的静脉内 溶液袋或管形瓶)。容器还可以具有无菌入口 (例如容器可以是具有 可由皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的 至少 一种活性剂是trkB激动剂。容器可以进一步包含第二种药学活性 剂。试剂盒可以任选提供另外的组分，例如緩冲剂和说明信息。通常， 试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标签或药品说明书。 提供下述实施例以举例说明而不是限制本发明。实施例实施例1: 每天NT-4/5输注在肥胖的狒狒中导致体重增加和食 欲过盛3只肥胖的雌性狒狒(体重范围20 - 30 kg)从第l天到第24天 每天接受一次人NT-4/5以2mg/kg的静脉内(IV)输注。3只另外的 肥胖的雌性狒狒(体重范围20 - 30 kg)从第l天到第24天每天接受 一次IV媒介物(PBS )输注。对于前45天每天测量食物摄入。对于前 53天动物每周称重一次，并随后分别在第81天和第109天时追踪观 察。图l显示每天NT-4/5输注在肥胖的狒狒中对体重的影响。如图1 中所示，与媒介物组比较，NT-4/5治疗组的体重显著增加；和NT-4/5 治疗组中的体重到第81天时回复媒介物组的水平。数据指出每天 NT-4/5输注在肥胖的狒狒中导致延长但可逆的体重增加。图2显示每天NT-4/5输注在肥胖的狒狒中对食物摄入的影响。如 图2中所示，与媒介物组比较，NT-4/5治疗組中的食物摄入显著增加； 和NT-4/5治疗组中的食物摄入到第33天时回复媒介物组的水平。数 据指出每天NT-4/5输注在肥胖的狒狒中导致可逆的食欲过盛。实施例2:每周2次NT-4/5输注在肥胖的狒狒中导致体重增加但 无食欲过盛3只肥胖的雌性狒狒(体重范围20 - 30 kg)从第l天到第39天 每周接受2次人NT-4/5以2mg/kg的静脉内(IV)输注。3只另外的 肥胖的雌性狒狒(体重范围20 - 30 kg)从第l天到第39天每周接受 2次IV媒介物(PBS )输注。对于前55天每天测量食物摄入。对于前 66天动物每周称重一次，并随后分别在第94天和第122天时追踪观 察。
图3显示每周2次NT-4/5输注在肥胖的狒狒中对体重的影响。如 图3中所示，与媒介物组比较，NT-4/5治疗组的体重显著增加；和 NT-4/5治疗组中的体重到第94天时回复媒介物组的水平。数据指出 每周2次NT-4/5输注在肥胖的狒狒中导致可逆的体重增加。图4显示每周2次NT-4/5输注在肥胖的狒狒中对食物摄入的影 响。如图4中所示，通过双因素ANOVA分析每周2次NT-4/5输注在肥 胖的狒狒中未显著改变食物摄入。Bonferroni事后检验分析未显示 NT-4/5治疗组(实心三角)与媒介物对照组(空心方块)之间的显著 配对差异。实施例3每天NT-4/5输注在消瘦的食蟹猴中导致体重增加和食 欲过盛3只消瘦的雌性食蟹猴(体重范围3-5 kg)从第l天到第31天 每天接受人NT-4/5以2 mg/kg的静脉内(IV )输注。3只消瘦的雌性 食蟹猴(体重范围3-5 kg)从第1天到第31天每周接受一次以0.6 mg/kg输注的IV聚乙二醇化的NT-4/5 (聚乙二醇化的NT4-G1S )。聚 乙二醇化的NT-4/5通过如美国专利申请公开号2005/0209148和PCT WO 2005/082401的实施例7中所述来产生引入人NT-4/5成熟序列 的甘氨酸1位置至丝氨酸的突变，并使PEG与第一个氨基酸丝氨酸附 着。3只另外的消瘦的雌性食蟹猴(体重范围3-5kg)从第l天到第 31天每天接受一次IV媒介物(PBS)输注。对于前50天每天测量食 物摄入。动物每周称重一次直至第50天。图5显示每天NT一/5输注在消瘦的雌性食蟹猴中对体重的影响。 如图5中所示，与媒介物组比较，每天NT-4/5治疗组而不是每周聚乙 二醇化的NT-4/5的体重显著增加。NT-4/5治疗组的体重仍未完全回 复媒介物组的水平。数据指出每天NT-4/5输注在消瘦的食蟹猴中导致 体重增加。图6显示每天NT-4/5输注在消瘦的雌性食蟹猴中对食物摄入的影 响。如图6中所示，与媒介物组比较，每天NT-4/5治疗组而不是每周 聚乙二醇化的NT-4/5治疗组中的食物摄入显著增加；和NT-4/5治疗 组中的食物摄入到第38天时回复媒介物组的水平。数据指出每天 NT-4/5输注在消痩的食蟹猴中导致可逆的食欲过盛。NT-4/5和聚乙二醇化的NT-4/5对体重的影响也通过皮下施用进 行测试。3只消瘦的雌性食蟹猴(体重范围3-5 kg)从第1天到第 21天每天接受人NT-4/5以2mg/kg的皮下(SC )注射。3只消瘦的雌 性食蟹猴(体重范围3-5 kg)从第l天到第21天每天接受一次以1 mg/kg注射的聚乙二醇化的NT-4/5的SC注射。3只另外的消瘦的雌性 食蟹猴(体重范围3-5kg)从第l天到第21天每天接受一次媒介物 (PBS )的SC注射。动物每周称重一次直至第21天。图7显示NT-4/5和聚乙二醇化的NT-4/5的每天SC注射在消瘦的 雌性食蟹猴中对体重的影响。如图7中所示，与媒介物组比较，NT-4/5 治疗组的体重显著增加。此外，与媒介物组比较，聚乙二醇化的NT-4/5 治疗组的体重也显著增加。实施例4: NT-4/5的每天皮下注射在NZW兔中显示对体重和食物 摄入没有显著影响5只雄性和5只雌性新西兰白(NZW)兔(体重范围3-4 kg)从 第1天到第15天接受人NT-4/5以2 mg/kg的皮下(SC )注射。5只 另外的雄性和5只雌性NZW兔(体重范围3-5 kg)从第l天到第15 天每天接受一次媒介物(PBS )的SC注射。对于前15天每天测量食物 摄入。动物每周称重一次直至第15天。对于体重或食物摄入在NT-4/5治疗组和媒介物组之间没有观察 到统计上显著的差异。比较在NT-4/5治疗的雄兔和媒介物雄兔之间， 以及NT-4/5治疗的雌兔和媒介物雌兔之间进行。实施例5: NT-4/5的单次注射在雪貂中不引起呕吐但可以减少吗 啡诱导的呕吐NT-4/5对呕吐的影响在具有约1 kg的体重的成年雌性雪貂 (Marshall Farm, CT)中进行研究。催吐剂(0.05 mg/kg吗啡6-葡 糖醛酸，M6G)作为阳性对照皮下给予，以确定在NT-4/5施用前的基 线。增加剂量的NT-4/5 ( 0. 1、 1或10 mg/kg)对6只雪貂(对于每
种剂量)单独皮下注射，以测试NT-4/5是否会引起任何不利效应，例 如干呕或呕吐。此外，2种剂量lmg/kg和10mg/kg的NT-4/5在M6G 前10分钟给予，以测试NT-4/5是否可以抑制M6G诱导的呕吐。将动 物送回居住笼，并就潜伏期、经过注射后60分钟的时间段的干呕和呕 吐次数进行观察。如图8中所示，0.1、 1或10 mg/kg NT-4/5单独的单次注射在雪 貂中不引起呕吐，而0. 05mg/kgM6G的单次SC注射有效诱导呕吐。1 mg/kg和10 mg/kg的NT-4/5在雪貂中显著减少M6G诱导的呕吐。为了测试在雪貂中可能负责NT-4/5的SC注射的抗呕吐效应的 trkB活化位点，测试在雪貂脑干中的trkB的c-Fos活化。对5只雌 性雪貂皮下注射10 mg/kg NT-4/5的单次剂量，随后为5分钟后静脉 内的10mg/kg顺铂。作为阳性对照，对另外4只雌性雪貂给予媒介物 注射的单次剂量，随后为5分钟后的顺钿。动物在l小时后通过戊巴 比妥钠(65 mg/kg ip)处死，通过用1 L/kg PBS随后为1 L/kg 4 %多聚曱醛，pH7. 3心内灌注进行固定。脑干的切片以30 um进行切 割，并使漂浮切片在0.1%Triton X-100 (溶于PBS )中稀释的10% 正常驴血清(NDS)中温育1小时，随后为在溶于含O. l%TritonX-100 和10%NDS的PBS的绵羊抗-Fos (1: 1， 000, OA-ll-824， Genosys Biotechnologies, Cambridge, UK)中于4C温育48小时。切片在 PBS中进行洗涤，并随后在生物素化的抗绵羊IgG二抗溶液中在室温 下温育60分钟。染色通过使用抗生物素蛋白生物素复合物技术 (Vectastain Elite抗生物素蛋白生物素复合物(ABC) Kit, Vector) 进行显现。简言之，切片在ABC试剂中在室温下温育60分钟，并随后 在包含3, 3-二氨基联苯胺(0. 5mg/ml)的溶液中温育30 - 60秒。脑 干切片随后固定在玻片上以干燥24小时，在50、 70、 95和100%乙 醇中各脱水4分钟，并随后在二甲苯中进行清洁，这之后将它们固定 并进行观察。孤束核(NTS)的核和亚核的边界在用曱酚紫中染色的邻 近的切片中进行评估。c-Fos免疫反应性神经元核的数目在3个水平 上对于最后区、背侧(原文为doral，疑为dorsal )迷走神经核(DMNX)
和NTS的所有亚核进行两侧测定，所述3个水平沿着背侧迷走神经复 合物(DVC)的首尾程度，0. 5-1. 0 mm嘴和0.5 mm尾至闩，和在闩 上。计数3个切片/水平/动物并求平均值。数据通过使用AN0VA与 Tukey氏事后检验(Prism; GraphPadSof tware， San Diego， CA)进 行比较。与媒介物注射的动物比较，NT-4/5处理显著增加最后区中的 c-Fos阳性核的数目(图9A， P-0.0009,斯氏t检验)。与之对比， 与媒介物注射的动物比较，NT-4/5处理明显减少背侧迷走神经核中的 c-Fos阳性核的数目(图9B， P-O. 0047，斯氏t检验)。另一方面， NT-4/5处理不显著改变其他脑干核中的c-Fos阳性核的数目，包括NTS 的多个亚核以及下丘脑的室旁核。最后区与大多数其他脑区不同，位于血脑屏障外并可完全接近循 环大分子(关于近期例子，参见Yang和Ferguson, 2003， Regul. Pept. 112 (1-3) : 9-17) 。 c-Fos的诱导是已知的经由其配体例如BDNF和 NT-4/5的trkB活化的立即早期事件(Ip等人1993， J. Neurosci. 13 (8 ) : 3394-405和Marsh等人1993， J. Neurosci. 13 (10): 4281-92)。这些数据共同暗示最后区构成全身递送的NT-4/5或其他trkB激 动剂的至少部分真正的"外周可接近的"靶。c-Fos表达在背侧迷走 神经核(图9B)中的减少可能反映经由NT-4/5预处理的呕吐回路的 部分减弱。实施例6: trkB激动剂抗体的产生和筛选^于/^;卓乂發戎rr^9淡动^戎沐邦尤^凝辨；单只Balb/C小 鼠以常规时间表用8 ug人TrkB细胞外结构域作为抗原注射5次。His 标记的人TrkB细胞外结构域(残基31 - 430 >使用栽体pTriEx-2 Hygro (Novagen， Madison WI)在293细胞中进行表达。TrkB细胞外结构 域使用Ni-NTA树脂经由制造商的说明书(Qiagen, Valencia, CA)进 行纯化。对于前4次注射，抗原通过使人TrkB与RIBI佐剂系统和铝 混合进行制备。总共8 ug抗原经过ll天的过程约每3天经由注射给 予颈的颈背、脚垫和IP。在第13天时，对小鼠实施安乐死并取出脾芯片根据供应商的说明书用N-乙基-N'- (3-二甲基氨丙基)-碳化二 亚胺(原文为carbodiinide，疑为carbodi imide )盐酸化物(EDC ) 和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS )进行活化。人trkB-Fc融合蛋白("htrkB")(或任何其他trkB，例如大鼠trkB)可以稀释到10 mM乙酸钠pH 5. 0 内，并以0. 0005 mg/mL的浓度注入活化芯片上。使用经过单个芯片通 道的变速流时间，可以达到2个抗原密度范围200-400 (共振单位)(RU)用于详细的动力学研究和500-1000 RU用于筛选测定法。芯片 可以用乙醇胺封闭。再生研究已显示Pierce洗脱緩沖液(产品号 21004， Pierce Biotechnology, Rockford， IL)和4 M NaCl ( 2: 1) 的混合物有效去除结合的Fab，同时在芯片上的htrkB活性保持超过 200次注射。HBS-EP緩冲液(0. OIMHEPES， pH7.4， 0,15NaCl， 3 mM EDTA， 0. 005 %表面活性剂P29)用作用于BIAcore测定法的运行緩冲 液。纯化的Fab样品的系列稀释(0. 1 - 10x估计的KD)以100nL/分 钟注入l分钟，并且允许高达2小时的解离时间。Fab蛋白质的浓度 通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳进行测定，4吏用已知浓度的Fab (如 通过氨基酸分析测定的)作为标准。动态结合速率(k。n)和解离速率(k。ff)(一般在251C下测量)通过使用BIAevaluation程序使数据 与1: 1的郎缪尔(Ungmuir)结合模型(Karlsson, R. Roos， H. Fagerstam， L. Petersson, B. (1994) . Methods Enzymology 6: 99-110)拟合同时获得。平衡解离常数(KD)值计算为k。ff/k。n。在某些实施方案中，抗trkB激动剂多肽(包括抗体)具有受损的 效应子功能。如本文所使用的，具有"受损的效应子功能"(可与术 语"免疫学惰性的"互换使用)的抗体或多肽指没有任何效应子功能 或具有减少的效应子功能活性(与具有未修饰的或天然存在的恒定区 的抗体或多肽比较)的抗体或多肽，例如在下述中的任何一种或多种 中无活性或具有减少的活性a)引发补体介导的裂解；b)刺激抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);和c)激活小神经胶质细胞。 效应子功能活性可以减少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99 %和100%中的任何一个。在某些实施
取出子宫角并提取在胚胎期时的E15胚胎。结状神经节被切割，随后 受胰蛋白酶作用，机械解离，并在用聚L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的 96孔平板中在成分确定的、无血清培养基中以200 - 300个细胞/孔的 密度进行铺板。抗TrkB抗体的激动剂活性以剂量响应方式一式三份地 相对于人BDNF进行评估。培养48小时后，对细胞实施在Biomek FX 液体处理工作站(Beckman Coulter)上进行的自动化的免疫细胞化学 方案。该方案包括固定(4%曱醛，5%蔗糖，PBS)、透化(溶于PBS 的0. 3%TritonX-100)、非特异性结合位点的封闭(5%正常山羊血 清，0. 1%BSA， PBS)以及与一抗和二抗顺次温育以检测神经元。针对 蛋白质基因产物9.5 (PGP9. 5， Chemicon)的兔多克隆抗体用作一抗， 所述基因产物9.5是确定的神经元表型标记。Alexa Fluor 488山羊 抗兔(Molecular Probes)连同核染料Hoechst 33342 (Molecular Probes) —起用作次级试剂，以标记培养物中存在的所有细胞的核。 在Discovery-l/Gen11 Imager (Universal Imaging Corporation) 上进行图像釆集和图l象分析。图4象在关于Alexa Fluor 488和Hoechst 33342的2个波长上自动获得，对于Imager的基于图像的自动聚焦系 统，核染色用作参考点，因为它存在于所有孔中。选择合适的物镜和 成像位点的数目/孔以覆盖每个孔的完整表面。自动化的图像分析设置 为计数在培养48小时后每个孔中存在的神经元的数目，基于其用抗 PGP9. 5抗体的特异性染色。图像仔细设定的阈值以及基于形态学和荧 光强度的选择性滤波器的应用导致神经元/孔的精确计数。测定每种假 定的TrkB激动剂抗体的EC50s (在下表2和图11中显示)，并与天 然配体的那种进行比较。下表2显示了鉴定的5种抗trkB抗体及其对小鼠神经元存活的活 性和对人trkB的磷酸化活性。
表2克隆HuTrkB ELISARatTrkB ELISA小鼠神经元存 活测定法 (评估的ECso)人KIRA测定法 (EC5。)18H6++0. 01 pM0.5 nM38B8++0.2 pM5 nM36D1++5 pM5 nM37D12++50 pM56 nM23B8++11 pM50 nM戎"i^欢动浙戎傳考小葳辨戍^^^.'雄性C57B6退休的育种小 鼠(年龄8 - 12个月)得自Charles River Laboratories ( Hollister 机构)，并允许在具有12小时光/暗循环的温度/湿度受控环境中适应， 在注射前随意使用食物和水至少5天。每只小鼠用异氟烷进行麻醉， 以修剪头盖骨上的毛发部分。将小鼠固定在立体定位性外科仪器(Kopf 型号900 )上，进行麻醉并用设为中等的电热垫保持温暖。将聚维酮 碘在头骨的剃刮部分上进行摩擦以使该区域灭菌。在颅上紧在耳后开 始朝向眼制造长约l cm的小的中间-纵向切口。打开头盖骨，并用棉 签清洁头盖骨表面直径约lcm的圃形空间，以去除任何结締组织。表 面用浸入30%过氧化氢中的棉签进行清洁，以显示前卣。使用钻头作 为探针以测量头盖骨深度，颅进行水平和垂直调整以确保它在钻孔前 是7K平的。从中间0. 5 mm到侧面0. 5 mm，以及从前面0. 5 mm到后面 0.5血m的深度的偏差(在前卣上调零)降到最低，以在±0. 05咖的 差异内。根据小鼠脑寰推(Franklin, K. B. J. & Paxinos， G. ， 7Xe Ars//z //2 ^ereofaAr/c Coorcf/刀"es. Academic Press, San Diego, 1997 )，关于单个、侧面、下丘脑内注射的坐标如下距离前 卤后1.30 mm;距离中线-O. 5mm;深度，距离头盖骨表面5. 70 mm (在 前卤上)。通过头盖骨钻小孔，避免与脑接触。将钻子替换为与 Hamilton注射器(型号84851 )附着的有斜面的26计量针，并且送回 相同坐标。将2 ul化合物经过2分钟的过程增加地注入外侧下丘脑。 在注射后针保持在这个位置上30秒，随后提高1 mm。另外30秒后， 将针提高1 mm。 30秒后，将针完全取出。随后关闭切口并用2-9 mm
创伤夹(Autoclip， Braintree Scientific, Inc. ， Braintree， MA) 结合在一起。注射在第0天时进行。每天监控体重和食物摄入直至第 15天。如图12A和图12B中所示，抗体18H6和36D1以指定剂量的颅内 注射在小鼠中显著减少体重和食物摄入。以指定剂量给予的对照IgG 抗体和23B8不显著影响食物摄入或体重。双因素AN0VA与Bonferroni 事后检验用于统计分析。这指出当直接对CNS注射时，抗trkB激动剂 抗体对体重和食物摄入具有在性质上类似于NT-4/5，天然trkB激动 剂的影响。实施例7: trkB激动剂抗体的外周注射在猴中导致增加的食物摄 入和体重成年消瘦的、雌性食蟹猴(在基线时称重3-5 kg)接受小鼠单 克隆激动剂抗体38B8的静脉内注射，和另外3只动物每周接受2次媒 介物。每天监控食物消耗和每周监控体重。统计分析通过使用PRISM (GraphPad Software Inc. ， San Diego, CA)来进行。所有数据和 曲线图以平均值±平均值的标准误(SEM )表示。数据通过2-因素ANOVA 与Dunnet氏事后检验进行分析( P<0. 05, " P<0. 01， '.' P<0. 001)。用5 mg/kg trkB激动剂抗体38B8每周2次注射处理的猴在2周 内显示出在累积食物摄入中40%的增加(图13A)和重量中10%的增 加(图13B)，指出trkB酪氨酸激酶受体的特异性活化介导增加的食 物摄入，增加的热摄取并增加体重。应当理解本文描述的实施例和实施方案仅用于举例说明性目的， 和关于其的各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明显的并且应包 括在本申请的精神和范围内。
权利要求
1. 用于治疗灵长类动物中的恶病质的方法，其包括外周施用有效量的NT-4/5。
2. 权利要求l的方法，其中所述灵长类动物是人。
3. 用于治疗灵长类动物中的神经性厌食的方法，其包括外周施用 有效量的NT-4/5。
4. 权利要求3的方法，其中所述灵长类动物是人。
5. 用于治疗哺乳动物中的阿片样物质诱导的呕吐的方法，其包括 外周施用有效量的NT-4/5。
6. 权利要求5的方法，其中所述哺乳动物是人。
7. 用于治疗灵长类动物中的恶病质的方法，其包括外周施用有效 量的trkB激动剂。
8. 权利要求7的方法，其中所述灵长类动物是人。
9. 权利要求7或8的方法，其中所述trkB激动剂是抗trkB激动 剂抗体。
10. 权利要求7-9中任一项的方法，其中所述激动剂是trkB选 择性的。
11. 用于治疗灵长类动物中的神经性厌食的方法，其包括外周施 用有效量的trkB激动剂。
12. 权利要求ll的方法，其中所述灵长类动物是人。
13. 权利要求11或12的方法，其中所述trkB激动剂是抗trkB 激动剂抗体。
14. 权利要求11-13中任一项的方法，其中所述激动剂是trkB 选择性的。
15. 用于治疗哺乳动物中的阿片样物质诱导的呕吐的方法，其包 括外周施用有效量的trkB激动剂。
16. 权利要求15的方法，其中所述哺乳动物是人。
17. 权利要求15或16的方法，其中所述trkB激动剂是抗trkB 激动剂抗体。
18. 权利要求15-17中任一项的方法，其中所述激动剂是trkB 选择性的。
19. NT-4/5或其药学上可接受的盐在制备用于外周施用的药物中 的用途，所述药物用于治疗恶病质、神经性厌食、不希望有的重量减 轻或阿片样物质诱导的呕吐。
20. trkB激动剂或其药学上可接受的盐在制备用于外周施用的药物中的用途，所述药物用于治疗恶病质、神经性厌食、不希望有的重 量减轻或阿片样物质诱导的呕吐。
21. 权利要求20的用途，其中所述trkB激动剂是trkB选择性的。
22. 权利要求20或21的用途，其中所述trkB激动剂是抗trkB 激动剂抗体。
23. 用于治疗灵长类动物中不希望有的重量减轻的方法，其包括 外周施用有效量的NT-4/5。
24. 权利要求23的方法，其中所述灵长类动物是人。
25. 权利要求23或24的方法，其中所述不希望有的重量减轻与 衰老相关。
26. 权利要求2、 24或25中任一项的方法，其中所述人具有小于 约25. 0 kg/m2、 24. 0 kg/m2、 23. 0 kg/m2、 22. 0 kg/m2、 21. 0 kg/m2、 20 kg/m2、 19.0 kg/m2和18. 5 kg/m2中的任何一个的体重指数。
27. 用于治疗灵长类动物中不希望有的重量减轻的方法，其包括 外周施用有效量的trkB激动剂。
28. 权利要求27的方法，其中所述灵长类动物是人。
29. 权利要求27或28的方法，其中所述trkB激动剂是抗trkB 激动剂抗体。
30. 权利要求27 - 29中任一项的方法，其中所述激动剂是trkB 选择性的。
31. 权利要求8 - 10或28 - 30中任一项的方法，其中所述人具有 小于约25. 0kg/m2、 24. 0kg/m2、 23. 0kg/m2、 22. 0kg/m2、 21. 0 kg/m2、 20 kg/m2、 19.0 kg/m2和18. 5 kg/m2中的任何一个的体重指数。
32. 权利要求27-31中任一项的方法，其中所述不希望有的重量 减轻与衰老相关。
33. 权利要求4或12-14中任一项的方法，其中所述人具有小于 约18.5 kg/m2、 17.5 kg/m2或16.5 kg/m2中的任何一个的体重指数。
全文摘要
本发明涉及通过外周施用trkB激动剂用于治疗不希望有的体重减轻(例如与恶病质或与衰老相关的)、进食障碍(例如神经性厌食)、或阿片样物质诱导的呕吐的方法。本发明还涉及包含trkB激动剂的组合物和试剂盒。
文档编号A61K45/00GK101400367SQ200780008394
公开日2009年4月1日 申请日期2007年2月1日 优先权日2006年2月2日
发明者A·罗森塔尔, J·C-Y·林, J·R·斯特拉顿 申请人:瑞纳神经科学公司