专利名称：一种产朊假丝酵母表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及产朊假丝酵母一种转化系统的建立， 用于表达外源蛋白的技术领域。
背景技术：
大肠杆菌f.C0//表达系统是目前为止最为有效和方便的表达系统，但外源
蛋白在Aco//中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内。￡"7/ 作为表达宿主，无法进行特定的翻译后修饰，特别是对真核基因的表达，可能 导致产物失去生物活性。为了克服大肠杆菌表达系统的不足，需要发展新的真 核表达系统。酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作筒便，成本低廉， 适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真 核蛋白质生产制备工具。
产朊假丝酵母是一种极重要的工业微生物，常被用于生产多种有用的生物 物质，如谷胱甘肽及一些氨基酸和酶类。它和啤酒酵母、克鲁维酵母被美国食 品与药品安全管理局(Food and Drug Administration, FDA )认证为可作为食 品添加剂的酵母，能运用于食品、制药业以及畜禽的饲料中。目前使用较多的 酿酒酵母和曱醇酵母与产肽假丝酵母相比均存在着不同的缺陷，如大量表达时 酿酒酵母常常会发生质粒丢失的现象，且重组蛋白常发生超糖基化；在有些实 验中，分泌性的蛋白滞留于壁膜间隙中，使分离纯化十分困难，而且在发酵中 通常有乙醇的产生，难以对其进行高密度发酵。现阶段广泛使用的曱醇酵母，
3如毕赤酵母、汉逊酵母表达系统，尽管具有高表达、高稳定、高分泌的特点， 但它们不是食品酵母，在诱导中需要添加曱醇，在部分行业不能被广泛接受。
另外，产朊假丝酵母本身还具有一些特点①不具有酵解抑制有氧氧化效应 (cra^ree-/2e^">e),因而在严格好气的条件下生长不会产生乙醇；②产朊 假丝酵母属多倍体，而且其基因组中rDNA属高度重复单元，使用此重复序列作 为整合载体同源重组位点可使外源基因与宿主染色体之间发生多拷贝同源重 组；③发酵密度高，在高密度发酵中细胞干重可达到92g/L;④在廉价的糖蜜中 就能生长；⑤作为添加剂可直接使用，无需进行酶制剂的发酵生产和添加。因 而产朊假丝酵母作为基因工程表达宿主具有很大的潜力。
目前产朊假丝酵母表达载体尚未商品化，探索一条可行的产朊假丝酵母表 达载体构建方法或构建出商品化的产朊假丝酵母表达载体将具有重要的意义。
发明内容
针对目前产朊假丝酵母是多倍体无有性世代，难于获得营养缺陷型宿主用 于构建转化系统，这给产朊假丝酵母转化体系的建立带来很大障碍的现状，已 报道没有可行的商品化的产朊假丝酵母表达载体。本发明提供了 一种产朊假丝 酵母表达载体及其构建方法。
本发明构建出了一种通用的产朊假丝酵母表达载体，并提供了一条可行的 产朊假丝酵母表达载体构建方法。
本发明以pBR322载体作为基本骨架，以产朊假丝酵母基因组腿A为模板， 采用定点突变法获得放线菌酮抗性基因，同样以产朊假丝酵母基因组DNA为模 板，采用PCR方法获得其rDNA片段和GAP启动子-终止子片段，构建具有放线 菌酮抗性的产朊假丝酵母表达载体。并以木聚糖酶基因为目的基因，构建重组表达载体，采用电击法转化产朊假丝酵母。对转化后的产朊假丝酵母进行酶活 测定，以此来检测产朊假丝酵母表达载体是否构建成功及外源基因能否在产朊
假丝酵母中成功表达。具体操作如下
(1) 采用相关数据库对产朊假丝酵母L41基因序列进行分析，设计两对引 物，采用套叠PCR方法对产朊假丝酵母L41基因第56位氨基酸序列进行定点突 变，获得放线菌酮抗性基因。
(2) 以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，扩增出所需的产朊假丝酵母rDNA。
(3) 产朊假丝酵母中的3-磷酸甘油醛(GAP)启动子是一种很强的组成型启 动子，根据GAP启动子-终止子序列设计两对引物，分别扩增出GAP启动子、终止 子片段，并通过设计合适的酶切位点在启动子终止子之间引入多克隆位点。
(4) 以pBR322为产朊假丝酵母表达载体改造的骨架，将克隆好的放线菌 酮抗性基因、rDNA片段、GAP启动子-多克隆位点-终止子片段构建至pBR322相 应位置，即得到产朊假丝酵母表达载体。
本发明通过将重组质粒线性化，采用电击法转化产朊假丝酵母，用放线菌 酮抗性平板筛选转化子，并釆用逐步提高抗性浓度以及PCR的方法进行进一步薛 选和鉴定。
挑选阳性转化子进行发酵培养，分别收集菌体和发酵液，对发酵液和超声 波石皮石争后的菌体采用还原糖法对表达产物进行酶活测定。同时，对发酵液和超 声波破碎后的菌体进行SDS-PAGE分析。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，达到以下有益效果。
本发明通过提供一种产朊假丝酵母整合表达载体及其构建方法，为探索一 条可行的产朊假丝酵母表达载体构建方法或构建出商品化的产朊假丝酵母表达载体将具有重要的意义。也可使得产朊假丝酵母可直接作为饲料添加剂，为我 国饲料工业节省大量的人力物力财力，同时还可为产朊假丝酵母在食品工业、 制药业等领域的应用奠定基础。
图1为产朊假丝酵母同源整合表达载体pGLR9K的质粒图谱。 图2为含目的基因的重组表达载体的质粒图谱。
具体实施例方式
实施例一引物设计
根据GenBank中公布的C "〃/^各基因序列结合pBR322质粒序列特征设 计引物并引入合适的酶切位点，其中，引物P5和R5是根据文献设计。引物如 下
Pl: 5， -GGATATCTTACAGCGAGCACTCAA-3'(引入A" RV酶切位点)
Rl: 5， —AGGTACCGCTAGCTCTAGAATGTTGTTTGT-3，(引入1> I， I和I 酶切位点)
P2: 5， -Uctagagctagcggtacctatgacttttat-3，(引入I， yVZ e I和//w I 酶切位点)
R2: 5， -gggatccACGTGTAATACCAGG-3'(引入泡/z HI酶切^f立点) P3: 5' -cgatatcTGCCAGTAGTCATATGC-3'
R3: 5， -cgatatcTGACTTGCGCTTACTAG-3，(在两引物的5，端都引入Aco RV 酶切位点)
6P4: 5， -CgtcgacAGTAAGTATGAAAAGAGC-3，(引入&7 I <立点)
R4: 5， -GggatccGG GTTTGGTCTATGTTGCT-3，(引入勘m HI酶切位点)
P5: 5， -AACCAAGCAAGTTTTCCAC-3， (c^编码C/刀)
R5: 5， -GTGGAAAACTTGCTTGGTT-3'
P6: 5， -TATCTAGAATGGCCGAGAGCACGCT-3，(引入Z&I酶切位点) R6: 5， -ggtacctcaggtgcgggtcc-3，(引入J/ " I酶切位点) 实施例二同源整合表达载体pGLR9K的构建
以G ""/h基因组为模板，以P4/R5为引物进行PCR，获得L41基因上游片段； 同样以G 〃"7h基因组为模板，以P5/R4为引物进行PCR,获得L41基因下游片段。 分别回收两片段，以两片段等量混合为模板，以P4/R4为引物进行PCR,获得CYH 抗性基因。PCR反应条件为94°C 5min; 94。C变性30s, 56。C退火30s, 72。C延 伸2min, 30循环，72。C延伸10min。回收目的片段连接至载体; M "-r rec"r上(命名为pr-d)进行测序分析。
以C 〃"7h基因组为模板，以P1/R1为引物进行PCR,获得酵母GAP启动子 (GAP-p)基因片段；同样以C "〃/h基因组为模板，以P2/R2为引物进行PCR, 获得酵母GAP终止子(GAP-t)基因片段。PCR条件同上。回收两片段分别连接至 载体/ M "-s/zzz/7/e rec"r上(分别命名为/ 71-ft°， ； 77^7)进行测序分析。
以C Z7"7A基因组为才莫板，以P3/R3为引物进行PCR,获得18S rDNA片l殳。 PCR条件同上。回收目的片革殳构建至载体pMD19-T simple vector上(命名为 / 7W(^)进行测序分析。
才是取pT-GP和pT-GT质粒，分别采用fcoRV/ffe I和Zfe I/A/z HI进行酶切，回收目的片段。同样提取pBR 3 2 2质粒采用fco W 〃/进行酶切，回收目的片
段，采用三片段连接法，用T4 DNA连接酶将这三片段同时连接，获得质粒pBR-GAP。
4是耳又pT-CYH和pBR-GAP质粒，分别采用HI/fe/ I进行酶切。回收目的片 段，用T4 DNA连接酶进行连接，获得质粒pBR-G-L。
4是取pT-18S和pBR-G-L质粒，分别采用Aco RV进行酶切。回收目的片l殳，用 7￥ "A^连接酶进行连接，获得质粒pGLR9k。转化大肠杆菌DH5 a , 4是耳又质粒后采 用酶切和PCR方法鉴定阳性克隆并保存备用。参见附图1
实施例三含目的基因的重组表达载体的构建
以质粒pUC19-XA为模板，以P6/R6为引物进行PCR，获得xynA目的基因片段。 PCR条件为94°C 5min; 94。C变性30s， 58。C退火30s， 72。C延伸l. 5min， 30循 环；72。C延伸10min。回收目的基因克隆至载体pMD19-T simple vector上(命 名为pT-XA)进行测序分析。
提取/77SO质粒，采用Jfe II进行酶切，回收目的片段构建至载体 pGLR9K多克隆位点上，获得质粒pGLXR。转化大肠杆菌DH5 a ,筛选鉴定阳性克 隆并保存备用。参见附图2
实施例四电转化C w"7/s
提取质粒pGLXR，分别采用&oRI和处s I限制性内切酶线性化，回收目的 片段保存待用。
接种G ""7/s菌林于20mL YPD液体培养基中，30。C培养至OD 600 =1. 5 ~ 2. 0， 离心收集菌体。5mL水预冷的灭菌水洗2次，加入5mL山梨醇(lmol/L),冰上放置 Smin,离心，细胞重悬于lmol/L山梨醇中。将60 |a L菌体移出至一新的无菌 E卯endorf管中，加入100ug线性化质粒(10 ja L ~ 20 ju L )，轻弹混匀质粒和感受态，尽数吸出转移至O. 2cm型的电穿孔转化杯中。转化杯置于冰浴中5 10min， 保持低温。电击电压为1KV,脉冲时间为4 6mS。向电击转化杯中加入O. 5mL 4 。C预冷的lmol/L的山梨醇溶液，混匀后转移至小试管中，于28。C复苏5h左右， 涂布于含CYH抗生素平板上，置于3(TC培养，直至长出菌落。
转化子在含有50ug/mL CYH的YPD液体培养基中连续继代三次，转入无抗性 YPD培养基中连续培养数代后，继续在不同浓度梯度(50， 60, 75， 100ug/mL)的CYH 选择培养基中筛选。复筛采用PCR方法挑取数个电转化后的酵母单菌落，富集 培养后分别提取基因组，用外源基因两侧特异引物扩增筛选。
实施例五xynA基因的表达4全测
从平板上挑取经过PCR复筛后的阳性菌落到液体YPD选择培养基中，30。C培 养过夜，按l: 100的比例接种至20mL新鲜的YPD选择培养基中，3(TC培养72h后， 分别收集菌体和发酵液，菌体用超声波破壁，采用DNS法测定其胞内外Xylanase酶活。
酶活定义为50。C, pH5. 6条件下lmin产生lumol的木糖所需的酶量为一个酶 活单位(U )。
实施例六Southern Motting分析
以质粒pGLXR为模板，P7/R7为引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序同 1.4.1。扩增产物采用l. 0%琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段，以制备 探针。挑选经PCR检测为阳性的酵母转化子基因组及未转化的酵母基因组进行 0. 8%琼脂糖凝胶电泳，之后转膜进行Southem bloUing分析，未转化的酵母基 因组为阴性对照，具体方法参照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I说明书进行。结果表明，挑选的3个转化子均显示出杂交带，而
9阴性对照未显示出杂交带，充分证明目的基因整合至产朊假丝酵母染色体上， 从而表明本研究成功构建出产朊假丝酵母整合表达载体，进一步说明本研究所 采用的构建方法是可行的。
权利要求
1、一种产朊假丝酵母整合型表达载体，其特征在于，以pBR322为基本骨架，以放线菌酮(CYH)为抗性基因，以18S rDNA片段为介导序列，以GAP启动子-终止子为启动子-终止子，携带外源基因在产朊假丝酵母中进行表达中获得。
2、 如权利要求1所述的产朊假丝酵母表达载体构建方法，其特征在于，所 述的表达载体构建方法具体操作如下(1) 对产朊假丝酵母L41基因序列进行分析，设计两对引物，采用套叠PCR 方法对产朊假丝酵母L41基因第56位氨基酸序列进行定点突变，获得放线菌酮 抗性基因；(2) 以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，扩增出所需的产朊假丝酵母18S r脆片段；(3) 产朊假丝酵母中的GAP启动子是一种很强的组成型启动子，根据其GAP 启动子-终止子序列设计两对引物，分别扩增出GAP启动子、终止子片段，并通 过设计合适的酶切位点在启动子终止子之间引入多克隆位点；(4) 以pBR322为产朊假丝酵母表达载体改造的骨架，将克隆好的放线菌 酮抗性基因、rDNA片段、GAP启动子-多克隆位点-终止子片段构建至pBR322相 应位置，得到产朊假丝酵母表达载体。
3、 一种以木聚糖酶基因为目的基因构建的产朊假丝酵母表达载体，其特征 在于，将木聚糖酶基因插入权利要求1所述的载体，采用电击法转化产朊假丝 酵母，将木聚糖酶基因在产朊假丝酵母中的表达中获得的重组表达载体。
全文摘要
本发明公开了一种工业微生物-产朊假丝酵母的表达载体，本发明还同时提供了产朊假丝酵母表达载体的构建方法。本发明通过以pBR322载体作为基本骨架，以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，采用定点突变法获得放线菌酮抗性基因，同样以产朊假丝酵母基因组DNA为模板，采用PCR方法获得其rDNA片段和GAP启动子-终止子片段，构建以18S rDNA介导的具有放线菌酮抗性的产朊假丝酵母整合型表达载体，用于产朊假丝酵母表达外源蛋白，广泛应用于饲料添加剂、食品工业及制药业等领域。
文档编号C12N15/81GK101487019SQ20081007301
公开日2009年7月22日 申请日期2008年11月27日 优先权日2008年11月27日
发明者包慧芳, 崔卫东, 杨红兰, 炜 王, 詹发强 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所