专利名称：：一种化妆品中链球菌的检验方法
技术领域：
：本发明涉及化妆品^:生物才企验
技术领域：
。具体的说，本发明涉及一种化妆品中细菌的4全验
技术领域：
。
背景技术：
：化妆品在人们的日常生活中使用很普遍，因此对其安全性的检测和评估显得尤为重要。化妆品因原料中存在油脂、蛋白质、淀粉、维生素、水分等众多营养性成分，为微生物的滋生和繁殖提供了良好的营养环境。虽然通过添加防腐剂来防止化妆品变质，但在生产和使用过程中仍无法避免微生物的污染。微生物将化妆品中的营养成分代谢分解，致使化妆品腐败变质，不仅使化妆品的色、香、味及剂型发生变化，而且带给使用者的健康造成严重危害。因此，化妆品中一些有害微生物的分离与检测是当前化妆品卫生质量控制的重要问题。目前有关化妆品微生物检验标准通常只涉及到细菌总数、粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌四个项目，就安全性而言，现有检测标准明显存在滞后现象。实际上，污染化妆品的微生物种类很多，有细菌、真菌和酵母菌等。目前从化妆品中检出对人体致病的细菌有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏杆菌、粪大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌和链球菌等；真菌主要有青真菌、曲真菌、交链孢真菌等。其中，链球菌能引起感染性疾病，如链球菌存在于化妆品中则易引起皮炎、毛嚢炎和疗肿等现象，但是没有相应的检测方法。为不断加强对进出口化妆品的安全性检测，建立化妆品中链球菌的检验方法具有重要意义。
发明内容针对目前没有建立起完整的检测化妆品中链球菌的检验方法，也未见国内外文献报道。化妆品中链球菌导致一些疾病实际一直困扰着人们。本发明提供了一种化妆品中链球菌的斗企验方法。本发明的技术方案本发明针对化妆品中存在链球菌的可能性，并根据链球菌的特征，釆用多种链球菌增菌培养基、多种链球菌分离培养基对不同种类化妆品进行链球菌的分离；并同时采用标准链球菌菌林人工污染化妆品后，对选择的多种链球菌增菌培养基、多种链球菌分离培养基进行确证实验。为此，本发明建立了一种化妆品中链球菌的检验方法。本领域所熟知，链球菌广泛分布于大自然中，该菌呈圆形或卵圆形的革兰氏阳性细菌，无芽孢，无动力，过氧化氬阴性，不耐热，本发明通过反复实验确定建立一定培养条件，如培养基成分、培养温度和时间、PH等，建立起适合检测化妆品中链球菌的检验方法体系。常见的大部分链球菌均采用鲜血平板和哥伦亚琼脂平板进行分离培养，对需进行前期增菌培养的链球菌均采用匹克氏增菌液、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、营养肉汤、血清肉汤等增菌液。现已报道的链球菌分离方法，主要针对某一种类进行分离鉴定，如肺炎链球菌、猪链球菌、嗜热链球菌、溶血性链球菌等，而实际上，化妆品中为抑制细菌生长添加了一定的防腐剂，增加了对化妆品中链球菌的难度。本发明根据化妆品中链球菌特性，首次采用SCDLP、脑心浸液培养基和叠氮钠葡萄糖肉汤作为前期增菌液，血琼脂、脑心浸液琼脂、KF琼脂作为分离培养基，建立了检测化妆品中链球菌的前增菌和分离实验整体检测技术体系。而本发明选择含有中和剂的SCDLP作为前增菌液作为本发明的关键技术点。本发明具体的，针对化妆品中链球菌属的分离，釆用了SCDLP作为前增菌液、血琼脂、脑心浸液琼脂作为分离培养基相互组合后而建成的化妆品中4连3求菌分离的完整检测方法。本发明具体提供了一种化妆品中链球菌的检验步骤如下一、前期增菌培养取1:10稀释样品10mL加入到90mLSCDLP液体培养基，置36。C士1。C、4培养24小时。二、分离培养从培养液中挑取培养物，划线接种到血琼脂、脑心浸液琼脂平板上，置36。C士rC培养24h。血琼脂上链球菌菌落特征呈灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，菌落直径约0.5mm-2mm。在脑心浸液琼脂平板上，其菌落呈灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，菌落直径约0.5mm-2mm。三、染色镜检挑取可疑的菌落，革兰氏染色，镜检为链状或双排列的革兰氏阳性球菌。四、4妻触酶实-睑取一块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用接种环挑取链球菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后加一滴3%过氧化氬溶液，30s之内，出现气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。五、万古霉素实验挑取可疑的菌落接种于已加入万古霉素(0.5)ag/L-4.0iag/L)的脑心浸液琼脂培养基中，置36。C士l。C培养18-24h。链球菌均不能生长。六、结果报告结合上述特征及相应数据，可以清楚的判断，分析样品经增菌分离培养后，有可疑菌落生长，结合相应菌体的菌落特点，经证实为革兰氏阳性链状或双排列的球菌，接触酶实验为阴性、万古霉素敏感者，即可报告被检样品中检出链球菌。同时，本发明通过比较其生长曲线以确定增菌培养基为SCDLP、脑心浸液培养基和叠氮钠葡萄糖肉汤，最佳培养链球菌的为SCDLP培养基，其组分为:17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾、2.5g葡萄糖、l.Og卵磷脂、7.0g吐温80、1000ml蒸馏水。本发明中选用的五种菌曱型溶血链球菌、星座链球菌、酿脓链球菌、粪链球菌和乳酸链球菌，本领域熟知，所选用的五种菌种都是导致腐败的主要链球菌，是链球菌的典型菌种，都已公开报道，本领域技术人员可通过公众获得。5本发明在制备样品处理中引用了化妆品微生物标准检验方法总则部分(GB7918.1-87)。通过实施本发明具体的技术指标，实现本
发明内容，可以达到以下有益效果。通过采用了SCDLP作为前增菌液、血琼脂、脑心浸液琼脂作为分离培养基相互组合后而建成的化妆品中链球菌分离的完整检测方法，经证实为革兰氏阳性链状或双排列的球菌，接触酶实验为阴性、万古霉素敏感者,能够准确的判定化妆品中有链球菌的存在，以及科学判定作为化妆品被污染的程度。图1所示为甲型溶血链球菌在脑心浸液培养基、叠氮钠葡萄糖肉汤和SCDLP中的生长曲线，其中SCDLP-令，脑心浸液培养基-固，叠氮钠葡萄糖肉汤-A。图2所示为星座链球菌在脑心浸液培养基、叠氮钠葡萄糖肉汤和SCDLP的生长曲线，其中SCDLP-,脑心浸液培养基-疆，叠氮钠葡萄糖肉汤-A。图3所示为酿脓链球菌在脑心浸液、叠氮钠葡萄糖肉汤和SCDLP中的生长曲线，其中SCDLP-令，脑心浸液培养基-■，叠氮钠葡萄糖肉汤-A。图4所示为粪链球菌在脑心浸液、叠氮钠葡萄糖肉汤和SCDLP的生长曲线，其中SCDLP-，脑心浸液培养基-B,叠氮钠葡萄糖肉汤-▲。图5所示为乳酸链球菌在脑心浸液、叠氮钠葡萄糖肉汤和SCDLP的生长曲线，其中SCDLP-令，脑心浸液培养基-■，叠氮钠葡萄糖肉汤-A。图6所示为化妆品中链球菌的检验流程图。具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另夕卜，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指体积重量百分比计。本发明中设备和材料有36°C±1。C的恒温培养箱、高压蒸气灭菌锅、0°C~fC冰箱、10x~lOOx显微镜、最大称重达2000g,感量0.1g的天平、lml(具0.01ml刻度)、5ml(具O.lml刻度)和lOml(具O.lml刻度)的灭菌吸管、16mmx160mm和18mmx180mm的灭菌试管、直径90mm的灭菌培养皿、pH计、pH试纸、酒精灯、灭菌剪子、均质器和镊子等。实施例一为确定SCDLP、脑心浸液培养基和叠氮钠葡萄糖肉汤是否可作为链球菌的前期增菌液，将5种标准菌抹接入上述三种前增菌培养基中，37。C培养，每隔4小时从各增菌液中吸取lmL培养液，用无菌生理盐水十倍梯度稀释后，选择合适稀释度涂布于脑心浸液琼脂，进行菌落计数，连续进行48小时的实验，通过比较其生长曲线以确定最佳增菌培养基。选用星座链球菌CMCC(B)32116、酿脓链球菌CMCC(B)32002、粪链球菌CMCC(B)32223、曱型溶血性链球菌CMCC(B)32205和乳酸链球菌作为标准菌，分别将其制成0.5麦氏浓度的菌液，用无菌生理盐水十倍梯度稀释，分别取lml至SCDLP、脑心浸液培养基和叠氮钠葡萄糖肉汤中，37。C培养，每隔4小时进行菌落计数，连续进行48小时计数。结果见附图1、图2、图3、图4、图5.由附图1、图2、图3、图4、图5可见，除乳酸链球菌在SCDLP培养液中生长相对较弱外，其它链球菌生长的都较好。说明三种培养基都可作为前增菌液，但最佳的还是SCDLP培养基。从附图中还可看出，几种标准菌林在培养20~30小时期间基本为生长的最高峰。因此标准确定培养时间为24小时是合适的。实施例二为确定血琼脂、脑心浸液琼脂和KF琼脂是否适合作为链球菌的分离培养基。将等量合适浓度的5种标准菌株分别接入血琼脂、脑心浸液琼脂及KF琼脂中，37。C培养24小时后计数，并观察在三种琼脂培养基中的生长特性，生长数量等，以确定最佳链球菌的分离培养基。选用星座链球菌CMCC(B)32116、酿脓链球菌CMCC(B)32002、粪链球菌CMCC(B)32223、曱型溶血性链球菌CMCC(B)32205和乳酸链球菌作为标准菌，分别将其制成0.5麦氏浓度的菌液，用无菌生理盐水十倍梯度稀释，取lmL涂布于血琼脂、脑心浸液琼脂和KF琼脂，37。C培养24小时并计数，统计各标准菌抹在三种琼脂上的菌落个数(CFU/mL)。结果见表l表l.5种链球菌在血琼脂、脑心浸液琼脂和KF琼脂上的生长情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可见，5种标准菌抹均能在血琼脂和脑心浸液琼脂上生长，在KF琼脂培养基上生长较弱。血琼脂和脑心浸液琼脂分离结果相差不大。实施例三人工污染化妆品分离链球菌选用星座链球菌CMCC(B)32116、酿脓链球菌CMCC(B)32002、粪链球菌CMCC(B)32223、曱型溶血性链球菌CMCC(B)32205和乳S吏《连球菌作为标准菌，分别将其制成调节至0.5个麦氏浓度，按1%的量分别掺入6种化妆品中(嫩肤水(液体)、柔肤水(液体)、洁面乳(膏类)、保湿乳(乳剂半固体)、营养霜(油性)、香水(气雾剂及有机溶剂))，充分混勻。将充分混匀的液体、半固体等样品参照GB7918.1-87(化妆品微生物标准检验方法总则)进行样品制备。取1:10稀释的样品10mL接种到90mLSCDLP液体培养基中，置37。C培养箱，培养24h。自上述增菌培养液中，取12接种环，划线接种在血琼脂和脑心浸液琼脂，置37。C培养箱培养，24h后统计分离情况，参见附图6。结果见表2、表3、表4。表2:SCDLP作为增菌液时划线于血琼脂、脑心浸液琼脂分离结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注屮表示分离出；一表示未分离出由表2、表3、表4可见，6种化妆品被人工污染5种标准菌抹后，分别用SCDLP、脑心浸液培养基和叠氮钠葡萄糖肉汤增菌，在血琼脂、脑心浸液琼脂上分离。结果表明用SCDLP作为增菌液，化妆品中链球菌分离出的概率最大。实施例四增菌培养基的制备1、SCDLP液体培养基组分17.0g酪蛋白胨、3.0g大豆蛋白胨、5.0g氯化钠、2.5g磷酸氢二钾、2.5g葡萄糖、l.Og卵磷脂、7.0g吐温80、1000ml蒸馏水2、制法将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2~7.4分装，121。C高压灭菌20min。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25。C左右使用。用日本多胨可代替酪蛋白胨和大豆蛋白胨。实施例五分离培养基的制备一、脑心浸出液培养基1、成分10g蛋白胨、12.5g牛脑浸粉、2.0g葡萄糖、5.0g牛心浸粉、5.0g氯化钠、2.5g-寿酸氬二钠、1000ml蒸馏水2、制法将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2~7.4分装，121。C高压灭菌20min。冷却至25。C左右^f吏用。二、叠氮钠葡萄糖肉汤1、组分15g胰蛋白胨、4.5g牛肉膏粉、7.5g葡萄糖、0.2g叠氮钠、7.5g氯化钠、1000ml蒸馏水2、制法将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2~7.4分装，115。C高压灭菌15min。冷却至25。C左右使用。三、血琼脂1、成分100mL豆粉琼脂、5mL-10mL脱纤维羊血(或兔血)2、制法在pH7.4~7.6加热溶化琼脂，冷到50°C，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可分装灭菌试管，置成斜面。亦可用其它营养丰富的基础培养基配制血琼脂。实施例六选才奪上海4全测点、福建检测点、库尔勒4全测点、阿拉山口4全测点、新疆乌鲁木齐检测点进行验证。10实验方法分别将星座链球菌、酿脓链球菌、粪链球菌、曱型溶血性链球菌和乳酸链球菌5种标准菌制成调节至0.5个麦氏浓度，按1%的量分别掺入6种化妆品嫩肤水(液体)、柔肤水(液体)、洁面乳(膏类)、保湿乳(乳剂半固体)、营养霜(油性)、香水(气雾剂及有机溶剂)，充分混匀。将充分混匀的液体、半固体等样品参照GB7918.1-87(化妆品微生物标准检验方法)进行样品制备。取1:10稀释的样品10mL接种到90mLSCDLP液体培养基中，置37。C培养箱，培养24h。自上述增菌培养液中，取12接种环，划线接种在血琼脂和脑心浸液琼脂，置37。C培养箱培养，24h后统计分离情况，参见附图6。室间验证结果见表5表10。表5上海检测点室间验证结果表5.a.SCDLP作为增菌液时划线血琼脂分离结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注+表示分离出；-表5.b.SCDLP作为增<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注十表示分离出；一表示未分离出表6福建检测点室间验证结果表6.a.SCDLP作为增齒液时划线血琼脂分离结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>粪链球菌++++++乳酸链球齒++++++注+表示分离出；一表示未分离L表6.b.SCDLP作为增菌液时划线脑《、浸液琼脂分离结果嫩肤水(液体)柔肤水(液体)洁面乳(膏类)保湿乳(乳剂半固体)营养霜(油性)香水(气雾剂及有机溶剂)甲荆溶血性链球齒++++++虽座链球菌++_+++酿脓链球菌++—+++粪链球菌++++++乳酸链球菌++++++注+表示分离出；一表示未分离出表7新疆库尔勒检测点室间验证结果表7.aSCDLP作为增菌液时划线血琼脂分离结果嫩肤水(液体)柔肤水(液体)洁面乳(膏类)保湿乳(乳剂半固体)营养霜(油性)香水(气雾剂及有机溶剂)甲荆溶血性链球齒++++++眾座链球齒++—+++酿脓链球齒++_+++粪链球菌++++++乳酸链球菌++++++注+表示分离出；一表示未分离山表7.b.SCDLP作为增菌液时划线脑心浸液琼脂分离结果嫩肤水(液体)柔肤水(液体)洁面乳(膏类)保湿乳(乳剂糊本)营养霜(油性)香水(气雾剂及有机溶剂)甲观溶血性链球菌++++++虽座链球菌++_+++酿脓链球菌++—+++粪链球菌++++++乳酸链球菌++++++注+表示分离出；一表示未分离出表8新疆阿拉山口检测点室间验证结果表8.aSCDLP作为增菌液时划线血琼脂分离结果嫩肤水(液体)柔肤水(液体)洁面乳(膏类)保湿乳(乳剂半l古l体)营养霜(油性)香水(气雾剂及有机溶剂)甲型溶血性链球齒++++++尼座链球齒++一++酿脓链球齒++_++十粪链球齒+++++十乳酸链球齒++++++注十表示分离山；一表示未分离出12表8.b.SCDLP作为增菌液时划线脑心浸液琼脂分离结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注+表示分离出；一表示未分离出表9新疆乌鲁木齐检测点室间验证结果表9.aSCDLP作为增菌液时划线血琼脂分离结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注屮表示分离出；一表示未分离出表9.b.SCDLP作为增菌液时划线脑心浸液琼脂分离结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注+表示分离出；一表示未分离出室间验证实验结果表明六种化妆品经人工污染5种标准菌抹后，在5家实验室的测试结果基本一致。SCDLP作为增菌液，血琼脂、脑心浸液琼脂作为分离培养基均能从化妆品中培养和分离出链球菌。权利要求1、一种化妆品中链球菌的检验方法，通过选择培养基或培养液培养，分离培养、染色镜检，经接触酶、万古霉素实验，鉴定获得具体腐败微生物的方法，其特征在于，采用了SCDLP作为前增菌液培养，以血琼脂、脑心浸液琼脂作为分离培养基。2、如权利要求1所述的化妆品中链球菌的4全验方法，其特征在于，所述的SCDLP作为前增菌液中，按体积或重量比计，取1:10稀释化妆品样品10mL加入到90mLSCDLP液体培养基，置36°C±1°C、培养24小时。3、如权利要求1所述的化妆品中链球菌的4全验方法，其特征在于，所述的血琼脂、脑心浸液琼脂作为分离培养基，从培养液中挑取培养物，划线接种到血琼脂、脑心浸液琼脂平板上，置36。C士l。C培养24h。4、如权利要求1所述的化妆品中链球菌的检验方法，其特征在于，所述的接触酶、万古霉素实验中，取一块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用接种环挑耳又菌落涂在滤纸片上，按W/V计，加入3°/。过氧化氬溶液，30s之内，出现气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性，经证实为革兰氏阳性链状或双排列的球菌，接触酶实验为阴性、万古霉素敏感者,检测出化妆品中链球菌。全文摘要公开了一种化妆品中链球菌的检验方法。针对国内外没有报道检测化妆品中链球菌的方法。通过对采用采用了SCDLP作为前增菌液、血琼脂、脑心浸液琼脂作为分离培养基，并经接触酶实验、万古霉素系列生化试验，鉴定确定化妆品中主要存在链球菌的腐败微生物。对保证化妆品安全具有重要意义。文档编号C12Q1/14GK101423863SQ200810073010公开日2009年5月6日申请日期2008年11月27日优先权日2008年11月27日发明者刘小兰,季新成,田延河,辉窦,蒋刚强,玲黄申请人:新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心