一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙m的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程制酶领域，具体设及一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪武M的方法。
【背景技术】
[0002] 甜味剂是一类广泛应用于食品、饮料及糖果生产的食品添加剂，其既可W在食品 的生产过程中添加，也可W在家庭烘赔时经过适当稀释作为薦糖的替代品使用。甜味剂包 括天然甜味剂和人工甜味剂，前者如薦糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等，后者如阿斯己甜、糖精 等。甜菊糖是一类从植物甜菊中提取出来的天然甜味剂，目前已被广泛用在食品及饮料中。 甜菊的提取物中含有包含瑞鲍迪武在内的多种甜菊糖，天然提取的甜菊糖不同的批次成分 差异较大，需要后续的提纯。目前商业化的产品瑞鲍迪武A包含一些其它的甜菊糖如瑞鲍 迪武C，D及F等。提取的方法制备的甜菊糖通常还有混有一些杂质，有可能对其使用范围 造成一定的影响。瑞鲍迪武M相较于瑞鲍迪武A具有优势，但其在甜菊叶中的含量极少，且 只在甜菊Morita植株中被检测到（2010，J.Appl.Glycosci.，57, 199-209)。目前尚未有瑞 鲍迪武M的商业化生产。
[0003] 中国专利文献CN103397064A公开了一种酶法制备瑞鲍迪武M的方法，该方法利用 大肠杆菌制备的UDP-葡萄糖基转移酶或含有UDP-葡萄糖基转移酶的大肠杆菌，在葡萄糖 基供体存在的情况下，催化瑞鲍迪武A或瑞鲍迪武D生成瑞鲍迪武M。上述方法中，所利用 的生产UDP-葡萄糖基转移酶的基因工程菌--大肠杆菌并不是安全的菌株（GRAS，general regardedassafe),其在培养过程中会产生毒素，生产的瑞鲍迪武M不能直接应用，并且大 肠杆菌为原核生物，UDP-葡萄糖基转移酶的基因来自于真核生物，因为真核生物和原核生 物的蛋白表达过程的复杂程度不同，用原核细菌表达真核来源的酶，会影响酶的活性。酿酒 酵母是公认安全的菌株，但是在酵母菌中表达外源基因的表达量较低。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中含有UDP-葡萄糖基转移酶的大肠 杆菌在制备瑞鲍迪武M的过程中因工程菌自身产生毒素使生产的瑞鲍迪武M存在安全问 题，提供一种通过公认安全菌株酶法制备瑞鲍迪武M的方法，该方法可W较低的成本，较短 的周期生产出高纯度的瑞鲍迪武M产品。
[0005] 为解决W上技术问题，本发明采取如下技术方案：
[0006] 一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪武M的方法，利用含有UDP-葡萄糖基转移酶的 重组酿酒酵母或其制备的UDP-葡萄糖基转移酶，在葡萄糖基供体存在的情况下，催化瑞鲍 迪武A或瑞鲍迪武D生成瑞鲍迪武M，所述重组酿酒酵母通过W下方法构建：在质粒中引入 强启动子得到载体质粒，将UDP-葡萄糖基转移酶基因通过酶切位点插入到所述载体质粒 上置于所述强启动子控制之下得到表达载体，然后转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母。
[0007] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊（Stevia rebaudiana)的UGT-A和 / 或来自水稻（Oryzasativa)的UGT-B。
[0008] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述UGT-A的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO. 1 所示氨基酸序列具有至少60%的一致性；所述来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列表中 SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列具有至少60%的一致性。
[0009] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述UGT-A的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 1 所示，所述UGT-B的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO. 3所示。
[0010] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述酶切位点为化ndlll和甜al。
[0011] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述强启动子为AD肥或TEF1。
[0012] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述质粒为PYES2。 阳013] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述载体质粒的构建方法为：在质粒内部引入 Agel酶切位点，通过Agel/Hindlll位点引入强启动子。
[0014] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4742。
[0015] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由薦糖、薦糖 合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系。
[0016] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，将重组酿酒酵母在细胞通透剂作用下形成重组酿 酒酵母透性细胞用于催化。
[0017] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，将重组酿酒酵母进行培养，于冰浴中超声波破碎， 将破碎液离屯、，收集上清液冻干，获得UGT-A或UGT-B的冻干粉用于催化。
[0018] 上述制备瑞鲍迪武M的方法中，所述催化的反应在溫度4°C~50°CW及抑5. 0~ 9. 0的水相体系中进行。
[0019] 由于W上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
[0020] 1、本发明提供的利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪武M的方法，通过制备高安全性的 重组酿酒酵母制备UDP-葡萄糖基转移酶的进行催化生产，生产的瑞鲍迪武M安全性高，可 W直接作为食品添加剂使用。
[0021] 2、本发明提供的利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪武M的方法，采用酿酒酵母作为工 程菌，在质粒PYES2上通过Agel/Hindlll酶切位点引入强启动子AD肥或TEF1，替换PYES2 质粒上原有的Gal启动子，通过Hindlll和甜al位点插入来源于真核生物的UDP-葡萄糖 基转移酶基因构建表达载体，UDP-葡萄糖基转移酶基因位于强启动子控制下，在酿酒酵母 BY4742培养过程中不需要诱导可W直接表达，节省了发酵时间和步骤，并且相对于原核工 程菌生产的UDP-葡萄糖基转移酶活性更高，UDP-葡萄糖基转移酶催化底物的转化率最高 为90 %，经纯化，生产的瑞鲍迪武M纯度大于99 %。
[0022] 3、本发明提供的利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪武M的方法，生产的瑞鲍迪武M安 全性好、纯度高，不用后续处理，直接用于食品添加剂，从而显著缩短了生产周期，提高了产 量，降低了成本。
【附图说明】
[0023] 下面将通过附图和【具体实施方式】进行一步说明本发明。
[0024] 图1为制备的瑞鲍迪武M的iHNMR图。
【具体实施方式】 阳0巧]W下瑞鲍迪武A、瑞鲍迪武D、瑞鲍迪武M分别简称RebA、RebD和RebM，S者的 结构式分别参见式I、II和III。
[0026]
[0027] 本发明主要提供四条合成RebM的路线： 阳02引 路线一：
[0029]
[0030]路线二：
[0031]
[0036] 根据本发明，所用的UGT-A或UGT-B可W酶冻干粉形式存在或存在于重组酵母细 胞中。
[0037]UGT-A或UGT-B的获得方法如下：
[0038] 利用分子克隆技术、基因工程技术获得UGT-A或UGT-B的重组酿酒酵母表达菌株， 然后将重组酿酒酵母发酵，制备得到含有UGT-A或UGT-B的重组细胞，或者制备得到UGT-A 或UGT-B的冻干粉。
[0039] 本发明所述的分子克隆技术和基因工程技术如无特殊说明均是已知的。分子克隆 技术可参见《分子克隆实验指南》第S版（J.沙姆布鲁克著，2005)。
[0040] 采用基因工程技术构建本发明重组菌株的表达步骤如下：
[0041] (1)根据UGT-A、UGT-B或SUS的氨基酸序列或者UGT-A、UGT-B或SUS基因的核巧 酸序列合成UGT-A、UGT-B或SUS基因片段，连入PUC57载体； 柳42] 0)通过PCR、双酶切、连接，将各基因片段插入重组质粒祀ZAD肥、pEZTEFl、 祀ZADH1相应的酶切位点中，使各基因置于不同启动子的控制之下；
[0043] (3)将表达载体转化进入酿酒酵母BY4742中，得到UGT-A或UGT-B或SUS的重组 酿酒酵母表达菌株。 W44] 利用含有UGT-A或UGT-B的重组酿酒酵母表达菌株制备含有UGT-A或UGT-B的重 组细胞，或者UGT-A或UGT-B的冻干粉。
[0045] 上述方法的具体步骤见下述实施例。
[0046] 实施例1制备含UGT-A的重组酿酒酵母细胞
[0047]根据pYES2 质粒序列，设计引物pYES2-AgeI-F(GATGATCCACTAGTAACCGGTAGAAGCCG CCG)和pYES2-AgeI-R(CGGCGGCTTCTACCGGTTACTAGTGGATCATC)，通过扩环PCR，在pYES2 质粒 内部引入Agel切点，得到质粒pYES2-AgeI。
[0048] WINVSc2 基因组为模板，设计引物AD肥-F(CACTAGTAACCGGTGCAAAACGTAGGGGC) 和八0肥-3佑10：40〔0：440(：17614174〔6414146)，？0?扩增得到40肥启动