一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，根据本发明的培养方法，包括以下步骤：1）通过三次扩增获得发酵工作种子液；2）发酵前准备：向发酵罐中添加泡敌、发酵培养基，将发酵工作种子液接种于发酵罐；3）发酵：控制发酵条件，当生长至OD600=20时，开始补料流加培养直至发酵结束；4）当OD600=30时，添加IPTG诱导表达，结束后离心，即得目的菌体。本发明采用的培养方法和培养基具有高稳定表达的特性，通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平较高，且工艺简便，稳定性好，易于工业化大生产。
【专利说明】一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组大肠杆菌的培养方法，尤其是一种生产瑞替普酶的大肠杆菌 培养方法，属于微生物发酵工程领域。
【背景技术】
[0002] 现今心脑血管疾病已是人类健康的最大威胁之一，患病人数逐年上升，而且发病 年龄也越发年轻化，田文静等在"乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达"（中国生 化药物杂志，2011，32 (5))-文中指出全世界每年心血管疾病患者多达1300万。在中国， 每年需要进行脑梗塞、心肌梗塞等血栓类疾病治疗的人数就上百万，因此研制和生产高效 的溶栓药就显得十分必要。赵友春等在"第三代溶血栓药物研究进展"（药学进展，2004， 28(2) : 72-75)中介绍到，目前溶栓药物已发展到第三代，具有快速溶栓，治愈率高，半衰期 长，副作用小等优点，在临床上具有较强的竞争性，但价格也比较昂贵。所以，生产出低成本 的溶血栓药物具有显著的经济效益和重大的社会意义。另外，赵友春等在"提高溶栓新药瑞 替普酶生产得率的中试研究"（化工科技，2003，11(1): 15-17)-文中报道，目前多数是 对瑞替普酶菌株的构建和复性纯化研究，而鲜有报道实际生产中是如何进行菌株工业化发 酵生产。
【发明内容】
[0003] 因此，本发明的目的是提供一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，从而可以稳 定表达瑞替普酶。
[0004] 为达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0005] (1)种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
[0006] 第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在LBA培养基上活化，然后挑 取一个单菌落到l〇mlLBA培养基，在35?37°C，110_140rpm，培养至0D600=0. 8-1. 0,得到 一级种子培养液；
[0007] 第二次扩增：将一级种子液按5%_10%的接种量接种至100mlLB培养基，在35? 37°C，110_140rpm，培养至 0D600=0. 8-1. 0,即得二级种子液；
[0008] 第三次扩增：将二级种子液以3%_7%的接种量接入1. 5LLB培养基，在35? 37°C，110_140rpm，培养至0D600=0. 8-1. 2,即得发酵工作种子液；
[0009] (2)发酵前准备：罐体及管道灭菌，配制培养液并添加消泡剂；校正溶氧电极，pH 电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；
[0010] (3)发酵：控制发酵条件，发酵温度30-37°C，用氨水调节pH值为6.6-6. 9,初始溶 氧量25-30%，调节转速为150-250rpm，每隔两小时转速提升20-30rpm，当0D600=20-22时， 开始用懦动泵加入补料培养基，进行补料，补料的流加速度为6-7ml/min;
[0011] (4)诱导：当0D600=30-32时，开始添加IPTG10-12ml进行诱导，诱导表达结束后， 收集菌液，离心，分离，即得目的菌体。
[0012] 其中，上述生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，所述步骤（2)中发酵罐为19L 的发酵罐，所述培养液由纯化水、发酵培养基、酵母提取液组成，所述酵母提取液浓度为 12%-18%。
[0013] 所述步骤（3)中发酵时间为22-26小时。
[0014] 所述步骤（4)中IPTG的浓度为120g/L，用量为10-12ml，诱导时间为4-5小时；离 心转速为8000-9000rpm，温度4°C，离心25-40分钟。
[0015] 上述生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，所述培养基组成为：
[0016]LBA培养基：每升H20中蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨节西林 钠 100mg;
[0017] 发酵培养基：A液：每升H20 中含KH2P04 2 5-40g、K2HP04 ? 2H20 57. 5-80g、 (NH4)2S04 1 7.5-25.8g、FeS04 ? 7H20 0? 008-0. 015g;
[0018]B液：每升4〇 中含CaCl2 .2H20 0? 8-1. 6g、CoCl2 .6H20 1. 60-2. 93g、CuS04.5H20 1. 5-2. 5g、FeS04 ? 7H20 1. 80-2. 87g、MnS0 4 ?H20 1. 0-1. 93g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 60-2. 67g;
[0019]C液：每升H20 中含 20% 酪蛋白 25. 0-42. 0ml、1MMgS04 1 6.0-37.0ml、50mg/ml 卡那霉素l〇. 0-23. 5ml、70% 葡萄糖 772. 5-867. 5ml、40%(NH4)2S04 80-120ml、5% 柠檬酸 1. 5-5. 0ml；
[0020] 补料培养基：D液：每升H20中含20%酪蛋白1. 67-2. 22ml、lMMgS04 10. 42-17. 36ml、50mg/ml卡那霉素 0? 56-1. 11ml、A液 55. 56-83. 33ml、70% 葡萄糖 208. 33-347. 22ml、40%(NH4)2S04 20-30ml、水 518. 76-703. 46ml。
[0021] 优选地，上述生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，所述培养基组成为：
[0022] LB培养基：每升H20中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g;
[0023]发酵培养基：A液：每升H20 中含KH2P04 30_35g、K2HP04?2H20 62. 5-75. 0g、 (NH4)2S04 20-23.33g、FeS04 ? 7H20 0? 010-0. 013g;
[0024]B液：每升H20 中含CaCl2?2H20 1. 0-1. 4g、CoCl2?6H20 2. 0-2. 53g、CuS04?5H20 1. 8-2. 2g、FeS04 ? 7H20 2. 0-2. 67g、MnS04 ?H20 1. 20-1. 73g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 80-2. 47g;
[0025] C液：每升4〇 中含 20%酪蛋白 30. 0-37. 0ml、lMMgS04 21. 5-32.0ml、50mg/ml卡那 霉素 13. 0-20. 0ml、70% 葡萄糖 797-843ml、40%(NH4)2S04 90-110ml、5% 柠檬酸 2. 5-4. 0ml;
[0026] 补料培养基：D液：每升H20中含20%酪蛋白1. 80-2. 08ml、lMMgS04 12. 50-15. 28ml、50mg/ml卡那霉素 0? 69-0. 97ml、A液 62. 50-76. 39ml、70% 葡萄糖 243. 05-312. 50ml、40%(NH4)2S04 2 2-28ml、水 564. 78-657. 46ml。
[0027] 进一步地，一种生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，制备步骤如下：
[0028] (1)种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：
[0029] 第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在LBA培养基上活化，然后挑 取一个单菌落到l〇mlLBA培养基，在37°C，125rpm，培养至0D600=0. 8-1. 0,得到一级种子 培养液；
[0030] 第二次扩增：将一级种子液按5%的接种量接种至100mlLB培养基，在37°C， 125rpm，培养至0D600=0. 8-1. 0,即得二级种子液；
[0031]第三次扩增：将二级种子液以5%的接种量接入1. 5LLB培养基，在37°C，125rpm， 培养至0D600=0.8-1. 2,即得发酵工作种子液；
[0032] (2)发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB 液，121 °C灭菌20分钟，冷却至30°C时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml， 600mlC液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种 子液全部接种于发酵罐中；
[0033] (3)发酵：控制发酵条件，发酵温度37°C，用氨水调节pH值为6. 6-6. 9,初始溶氧 量30%，调节转速为200rpm，发酵20-26小时，每隔两小时转速提升25rpm，当0D600=20时， 开始用懦动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为6-7ml/min;
[0034] (4)诱导：当0D600=30时，开始添加浓度为120g/L的IPTG12ml进行诱导，5小 时诱导表达结束后，收集菌液，4°C、转速为9000rpm条件下离心30分钟，分离，即得目的菌 体。
[0035] 利用本发明的培养方法和培养基，通过有效控制发酵过程中的关键参数，提高了 瑞替普酶的单位产量，降低了生产成本，具有工艺简便，表达稳定的特点，对大规模工业生 产具有非常重要的意义。
【具体实施方式】：
[0036] 下面结合实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0037] 制备实施例：
[0038] 下面制备实施例中制备各目的菌体的试剂所用的方法、仪器和操作方式均为本领 域常规的方法、仪器和操作方式，其中所用的各种试剂均为生化试剂、分析纯，购自普通生 化试剂公司，其余设备等来源如下表1所示：
[0039]表1
[0040]
【权利要求】
1. 一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于，制备步骤如下： (1) 种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液： 第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在LBA培养基上活化，然后挑取一 个单菌落到l〇ml LBA培养基，在35?37°C，110_140rpm，培养至0D600=0. 8-1. 0,得到一级 种子培养液； 第二次扩增：将一级种子液按5%-10%的接种量接种至100ml LB培养基，在35?37°C， 110-140rpm，培养至0D600=0. 8-1. 0,即得二级种子液； 第三次扩增：将二级种子液以3%-7%的接种量接入1. 5L LB培养基，在35?37°C， 110-140rpm，培养至0D600=0. 8-1. 2,即得发酵工作种子液； (2) 发酵前准备：罐体及管道灭菌，配制培养液并添加消泡剂；校正溶氧电极，pH电极， 然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中； (3) 发酵：控制发酵条件，发酵温度30-37°C，用氨水调节pH值为6. 6-6. 9,初始溶氧量 25-30%，调节转速为150-250rpm，每隔两小时转速提升20-30rpm，当0D600=20-22时，开始 用蠕动泵加入补料培养基，进行补料，补料的流加速度为6-7ml/min ; (4) 诱导：当0D600=30-32时，开始添加IPTG 10-12ml进行诱导，诱导表达结束后，收 集菌液，离心，分离，即得目的菌体。
2. 根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤 (2) 中发酵罐为19L发酵罐，所述培养液由纯化水、发酵培养基、酵母提取液组成，所述酵母 提取液浓度为12%_18%。
3. 根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤 (3) 中发酵时间为22-26小时。
4. 根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤 (4) 中IPTG的浓度为120g/L，用量为10-12ml，诱导时间为4-5小时。
5. 根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述步骤 (4)中离心转速为8000-9000rpm，温度4°C，离心25-40分钟。
6. 根据权利要求1所述的生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，其特征在于：所述培养 基组成为： LBA培养基：每升H20中蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠 100mg ； 发酵培养基：A 液：每升 H20 中含 KH2P04 2 5-40g、K2HP04 ? 2H20 57. 5-80g、（NH4)2S0417. 5-25. 8g、FeS04 ? 7H20 0? 008-0. 015g ; B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 0? 8-1. 6g、CoCl2 ? 6H20 1. 60-2. 93g、CuS04 ? 5H20 1. 5-2. 5g、FeS04 ? 7H20 1. 80-2. 87g、MnSO 4 ? H20 1. 0-1. 93g、Na2Mo04 ? 2H20 1. 60-2. 67g ; C 液：每升 H20 中含 20% 酪蛋白 25. 0-41. 67ml、1M MgS04 1 6 . 67-36 . 67ml、50mg/ ml 卡那霉素 10. 0-23. 33ml、70% 葡萄糖 600-1000ml、40%(NH4)2S04 80-120ml、5% 柠檬酸 1. 67-5. 0ml ； 补料培养基：D 液：每升 H20 中含 20% 酪蛋白 1. 67-2. 22ml、1M MgS04 1 0 . 42-17 . 36ml、 50mg/ml 卡那霉素 0? 56-1. 11ml、A 液 55. 56-83. 33ml、70% 葡萄糖 208. 33-347. 22ml、 40% (NH4) 2S04 20-30ml、水 518. 76-703. 46ml。
7. 根据权利要求1-5任一所述的培养方法，其特征在于：制备步骤如下： (1) 种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液： 第一次扩增：将表达瑞替普酶的大肠杆菌工程菌株在LBA培养基上活化，然后挑取一 个单菌落到l〇ml LBA培养基，在37°C，125rpm，培养至0D600=0. 8-1. 0,得到一级种子培养 液； 第二次扩增：将一级种子液按5%的接种量接种至100ml LB培养基，在37°C，125rpm， 培养至0D600=0. 8-1. 0,即得二级种子液； 第三次扩增：将二级种子液以5%的接种量接入1. 5L LB培养基，在37°C，125rpm，培养 至0D600=0. 8-1. 2,即得发酵工作种子液； (2) 发酵前准备：在19L发酵罐中添加纯化水8L、5ml泡敌和1200mlA液、150mlB液， 121°C灭菌20分钟，冷却至30°C时，再加入之前单独灭菌的15%酵母提取物500ml，600mlC 液；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全 部接种于发酵罐中； (3) 发酵：控制发酵条件，发酵温度37°C，用氨水调节pH值为6. 6-6. 9,初始溶氧量 30%，调节转速为200rpm，发酵22-26小时，每隔两小时转速提升25rpm，当0D600=20时，开 始用蠕动泵进行补料，加D液，补料的流加速度为6-7ml/min ; (4) 诱导：当0D600=30时，开始添加浓度为120g/L的IPTG 12ml进行诱导，5小时诱导 表达结束后，收集菌液，4°C、转速为9000rpm条件下离心30分钟，分离，即得目的菌体。
8. 根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于：所述培养基组成为： LBA培养基：每升H20中蛋白胨10g，酵母提取液5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠 100mg ； 发酵培养基：A 液：每升氏0 中含 KH2P04 3 2 . 50g、K2HP04 ? 2H20 68. 75g、（NH4)2S04 21. 67g,FeS04 ? 7H20 0. 012g ； B 液：每升 H20 中含 CaCl2 ? 2H20 1. 20g、CoCl2 ? 6H20 2. 27g、CuS04 ? 5H20 2. 0g、 FeS04 ? 7H20 2. 33g、MnS04 ? H20 1. 47g、Na2Mo04 ? 2H20 2. 13g ; C液：每升1120 中含 20%酪蛋白 33. 33ml、lM MgS04 26 . 67ml、50mg/ml 卡那霉素 16. 67ml、 70% 葡萄糖 800ml、40%(NH4)2S04 1 00ml、5% 柠檬酸 3. 33ml ; 补料培养基：D液：每升H20中含20%酪蛋白1. 94ml、lM MgS04 1 3 . 89ml、50mg/ml卡那 霉素0.831111、六液 69.441111、70%葡萄糖 277.781111、40%(順4)2504 251111、水611.121111。
【文档编号】C12N1/21GK104342396SQ201310326179
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】窦啟玲, 窦雅琪, 罗力, 王军 申请人:贵州益佰制药股份有限公司