温敏型谷氨酸棒杆菌、培养基、胶粒及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种温敏型谷氨酸棒杆菌、培养基、胶粒及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸产生菌细胞膜结构与功能上的特异性变化，从而使得细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的模式。目前谷氨酸发酵采用的菌株一般为生物素缺陷型谷氨酸菌株和温度敏感型谷氨酸突变菌株。其中生物素缺陷型谷氨酸菌株对于发酵底物中生物素波动敏感性很高，而表面活性剂法发酵操作繁琐以及青霉素法发酵产量低的缺陷。
[0003]相对于国内目前使用的生物素缺陷型谷氨酸菌株，温度敏感突变谷氨酸菌株仅需要控制温度即可实现谷氨酸的生产，其代谢控制的步骤较为简便，具有更好的生产应用前景。但是，研究表明:传统温度敏感型谷氨酸菌株对于谷氨酸集聚前后环境条件变化较为敏感，关键点在于发酵温度、转变时间、以及谷氨酸分泌时期的营养环境影响条件。在单一的发酵体系中，多因素同时的改变本身的操作性较困难，同时所导致的不确定性因素较多
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是为了克服生物素缺陷型谷氨酸菌株对于发酵底物中生物素波动敏感性很高，表面活性剂法操作繁琐以及青霉素法产量低；以及传统温度敏感型谷氨酸菌株对于谷氨酸集聚前后环境条件变化较为敏感，均不利于谷氨酸连续化生产，而提供了一种温敏型谷氨酸棒杆菌、培养基、发酵方法、胶粒及制备方法和应用(此处最好与发明名称一致，请确认)。本发明的温敏型谷氨酸棒杆菌的发酵培养基及其发酵方法能够短时间内提高谷氨酸棒杆菌的菌体密度，从而提高产物的比生产率，且其胶粒的制备方法采用固定化包埋技术，操作简单，包埋效率较高，在用于谷氨酸的连续化生产中能够很好的消除生长环境的波动对谷氨酸连续化生产的影响。
[0005]固定化技术是提高生物催化剂利用效率和生物反应速率的最有效方法之一，有助于实现高效率的连续化和重复化的生产过程，更有利于谷氨酸钠的分离提取。因此采用固定化完成生长阶段的微生物密度较高的谷氨酸生产菌的生长，进而投入到生产谷氨酸的环境中，可消除生长环境的波动对谷氨酸连续化生产的影响。
[0006]本发明最终是通过以下技术方案解决上述技术问题的。
[0007]本发明提供了一种温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006。
[0008]本发明还提供了一种所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的培养基，其包含下列质量的组分:8kg的葡萄糖，2kg的甘蔗糖蜜，5kg的玉米浆，12kg的KH2P04，0.24kg的MgS04.7Η20，0.26g的FeS04，0.26g的MnS04，6mg的生物素和30?50g的消泡剂，以上质量以12?14L的培养基计，所述的发酵培养基的pH值为7.0。
[0009]本发明还提供了一种所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的发酵培养方法，其包含下列步骤:将所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006接种于所述的培养基中发酵培养，即可。其中，所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的接种量较佳地为15%?18%。所述的发酵培养期间，发酵培养基的pH值较佳地为7.0?7.2。所述的发酵培养的搅拌速度较佳地为180?240r/min ;温度较佳地为32?33°C，时间较佳地为8?12h。
[0010]本发明还提供了一种温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006海藻酸钠钙盐固定化细胞胶粒的制备方法，其包含下列步骤:
[0011](1)将2%?3%的海藻酸钠水溶液(质量百分比)，灭菌融化后冷却至室温；
[0012](2)将20%?40%的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的菌悬液与步骤⑴中的海藻酸钠水溶液以1:9的体积比混合，充分搅拌制成均匀的混合液；
[0013](3)用电子蠕动泵通过硅胶管将混合液吸入后由另一管口挤压出；
[0014](4)将挤压出的珠粒滴入2%?4%的CaCl2水溶液中，固定化4?8h，即可。
[0015]本发明还提供了一种上述制备方法制得的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒。
[0016]本发明的固定化温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒，其包埋率较佳地在95%以上，连续发酵6次以上。
[0017]本发明还提供了一种所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒在谷氨酸连续化生产中的应用。
[0018]本发明的谷氨酸的生产方法，其包含下列步骤:将上述固定化温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒，采用柱式流化床生物反应器进行谷氨酸的连续化反应，即可。其中，所述的流化床生物反应器中条件控制为:葡萄糖的含量为12?18g/L，温度较佳地为36?38°C，pH值较佳地为7.2?7.4。
[0019]本发明谷氨酸的生产方法，谷氨酸产量> 100g/L。
[0020]在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0021]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0022]本发明的积极进步效果在于:
[0023]1、本发明的发酵培养方法，通过掌握温度敏感型菌株的生长曲线，采用高密度菌体发酵技术，短时期内提高谷氨酸棒杆菌的菌体密度，从而提高产物的比生产率，减少培养体积、强化下游分离提取，缩短谷氨酸生产周期。
[0024]2、利用海藻酸钠固定化技术，方法简单，包埋效率较高，保持了细胞的多酶系统的稳定性，并避免了谷氨酸分泌累积的反馈抑制，有利于后期谷氨酸钠的分离提取；制备得到的温度敏感型谷氨酸棒杆菌胶粒具有良好的透气性，而通过柱式流化床生物反应器，有利于底物和产物分子的扩散交换和氧的传递，非常适合温度敏感型谷氨酸发酵突变菌株发酵生产谷氨酸。
[0025]3、本发明的发酵生产方法解决了生物素缺陷型谷氨酸菌株对于发酵底物中生物素波动敏感性很高，表面活性剂法操作繁琐以及青霉素法产量低；以及传统温度敏感型谷氨酸菌株对于谷氨酸集聚前后环境条件变化较为敏感，均不利于谷氨酸连续化生产的难题。
[0026]4、与传统谷氨酸温度敏感菌株发酵技术相比，采用固定化技术制得细胞胶粒，再进行谷氨酸发酵工艺，生产效率提高20?30% ;同时由于后期生物转化体系较为纯净，更有利于后期谷氨酸钠的分离提取，有利于谷氨酸大规模连续化生产，且生产成本低。
【具体实施方式】
[0027]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0028]实施例1
[0029]温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的发酵培养基，其包含下列质量的组分:8kg的葡萄糖,2kg 的甘鹿糖蜜，5kg 的玉米衆，12kg 的 KH2P04,0.24kg 的 MgS04.7H20,0.26g 的 FeS04,
0.26g的MnS04，6mg的生物素和30?50g的消泡剂，以上质量以12L的发酵培养基计，发酵培养基的pH值为7.0。
[0030]温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的发酵方法，其包含下列步骤:将15%的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006，在32?33°C和180r/min的条件下，接种于上述发酵培养基中发酵培养8h，即可。在发酵培养期间，发酵培养基的pH值控制在7.0?7.2之间。
[0031]温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒的制备方法，其包含下列步骤:
[0032](1)称取适量的海藻酸钠，加入蒸馏水活生理盐水，配制成约2?3%的海藻酸钠水溶液(质量比)，灭菌融化后冷却至室温；
[0033](2)将20%?40%的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006菌悬液与步骤(1)中的海藻酸钠水溶液以1:9的体积比混合，充分搅拌制成均匀的混合液；
[0034](3)用电子蠕动泵通过硅胶管将混合液吸入后由另一管口挤出，并滴入2%的CaCl2水溶液中，固定化4h，形成直径为2mm的均匀固定化温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒，用无菌水洗涤后备用。
[0035]上述制备方法制得的固定化温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒，其包埋率在95%以上，可连续发酵6次以上。
[0036]谷氨酸的生产方法，其包含下列步骤:将上述温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒，采用柱式流化床生物反应器进行谷氨酸的连续化反应，即可。其中，所述的流化床生物反应器中葡萄糖的含量为12?18g/L，温度为36°C，pH值为7.2。上述谷氨酸的生产方法，谷氨酸产量彡100g/L。
【主权项】
1.一种温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006。2.—种如权利要求1所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的培养基，其特征在于，其包含下列质量的组分:8kg的葡萄糖，2kg的甘蔗糖蜜，5kg的玉米浆，12kg的ΚΗ2Ρ04，0.24kg的MgS04.7Η20，0.26g的FeS04，0.26g的MnS04，6mg的生物素和30?50g的消泡剂，以上质量以12?14L的培养基计，所述的发酵培养基的pH值为7.0。3.—种如权利要求1所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006发酵培养的方法,其特征在于包含下列步骤:将所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006接种于如权利要求2所述的培养基中发酵培养，即可。4.如权利要求3所述的发酵培养的方法，其特征在于，所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的接种量为15%?18% ;在发酵培养期间，发培养基的pH值为7.0?7.2 ;所述的发酵培养的搅拌速度为180?240r/min ;温度为32?33°C，时间为8?12h。5.一种温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006海藻酸钠钙盐固定化细胞胶粒的制备方法，其特征在于包含下列步骤: (1)将2%?3%的海藻酸钠水溶液，灭菌融化后冷却至室温； (2)将含20%?40%的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的菌悬液与步骤(1)中的海藻酸钠水溶液以1:9的体积比混合，充分搅拌制成均匀的混合液； (3)用电子蠕动泵通过硅胶管将混合液吸入后由另一管口挤压出； (4)将挤压出的珠粒滴入2%?4%的CaCl2水溶液中，固定化4?8h，即可。6.一种如权利要求5所述的制备方法制得的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒。7.一种所如权利要求6所述的温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006胶粒在谷氨酸连续化生产中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种温敏型谷氨酸棒杆菌、培养基、胶粒及制备方法和应用。该培养基，包含葡萄糖，甘蔗糖蜜，玉米浆，KH2PO4，MgSO4·7H2O，FeSO4，MnSO4，生物素和消泡剂。该发酵培养方法为：将温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006接种于所述的培养基中发酵培养，即可。该TCT006固定化细胞胶粒的制备方法包含：(1)将海藻酸钠水溶液，灭菌融化后冷却至室温；(2)将温敏型谷氨酸棒杆菌TCT006的发酵液与海藻酸钠水溶液混合；(3)通过硅胶管将混合液吸入后挤压出；(4)将挤压出的珠粒滴入CaCl2水溶液中，固定化，即可。本发明使谷氨酸钠易于分离提取，有利于大规模连续化生产，且生产成本低。
【IPC分类】C12R1/15, C12N11/10, C12P13/14, C12N11/04, C12N1/20
【公开号】CN105274018
【申请号】CN201410290140
【发明人】吴坚
【申请人】上海冠生园天厨调味品有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年6月24日