一种高产l-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵方法
【技术领域】
[0001] 高产L-丝氨酸菌株谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵工艺，本发明涉及微生物利用 糖质原料生产L-丝氨酸的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] L-丝氨酸属于非必需氨基酸，具有重要的生理功能和应用价值，广泛应用于医药、 食品和化工领域。目前L-丝氨酸的生产主要依赖于蛋白水解法、酶法转化法及微生物前体 发酵法，然而这些方法存在产量小，生产成本高，环境污染大等问题，不适合进行大规模工 业化生产L-丝氨酸。微生物发酵法利用可再生的糖质原料直接代谢生产L-丝氨酸是一 种绿色环保可持续的生产方式，已经成为研究L-丝氨酸工业化生产的热点。然而这种生产 方法由于受到菌株的限制，始终没有获得进一步的突破，这也使得L-丝氨酸成为瓶颈氨基 酸。
[0003] 谷氨酸棒杆菌（CbiTfldacieri?? 應）是重要的氨基酸生产菌株，广泛 应用于发酵法生产谷氨酸、赖氨酸和缬氨酸等。谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的主要代谢网络 图见图1。目前在构建高产L-丝氨酸的菌株研究中，主要集中于解除L-丝氨酸对L-丝氨 酸合成途径关键酶3-磷酸甘油酸（PGDH)的反馈抑制现象，降低L-丝氨酸的降解途径等。 本实验室以一株诱变的谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a (CGMCC No. 8667)通过解除L-丝 氨酸对PGDH的反馈抑制，降低L-丝氨酸的降解的手段获得了能够利用蔗糖直接发酵生产 L-丝氨酸的重组菌株SYPS-062-33a SS。与此同时，在L-丝氨酸合成的途径中存在着代谢 流的竞争现象，过量的改变代谢流流向L-丝氨酸途径会导致减少代谢流流向丙酮酸途径 和三羧酸循环，这会显著的降低谷氨酸棒杆菌的生长速率。通过代谢工程的手段虽然能够 有效的提高L-丝氨酸的糖酸转化率，但是由于减少了代谢流流向三羧酸循环会导致谷氨 酸棒杆菌生产速率降低，直接影响L-丝氨酸的生产效率，不利于工业化生产L-丝氨酸，这 也成为微生物发酵法生产L-丝氨酸亟需解决的难题。为了解决代谢流过量流向L-丝氨酸 途径导致L-丝氨酸的生产效率降低的问题，本专利提出了代谢工程改造和发酵工艺相结 合的策略，一方面通过代谢工程手段转变代谢流从糖酵解途径流向L-丝氨酸合成途径，提 高了 L-丝氨酸的糖酸转化效率；另一方面通过添加营养成分满足代谢改造后导致的谷氨 酸棒杆菌对营养物质的需求，解决菌体生长缓慢的问题，提高L-丝氨酸的生产强度。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了提高谷氨酸棒杆菌利用可再生的糖质原料（如蔗糖）产 L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度。通过代谢工程的手段改变蔗糖代谢流量流向 L-丝氨酸途径，提高L-丝氨酸产量和糖酸转化率，同时通过添加营养成分玉米浆提高谷氨 酸棒杆菌的生长速率和蔗糖消耗速率，使L-丝氨酸的生产强度得到进一步提高。本发明选 用的菌株为保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年12月31日，保藏编号为 CGMCC No. 8666,分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum) 33a SS。
[0005] 选择将代谢流流向L-丝氨酸竞争途径，即支链氨基酸方向的关键酶缬氨酸：丙酮 酸氨基转移酶的编码基因在基因组水平上进行敲除，随后进一步对代谢流流向该途 径的限速酶乙酰羟酸合酶（AHAS)在基因组水平上进行了弱化，使代谢流成功的从支链氨 基酸方向流向了 L-丝氨酸合成方向，最终获得了一株缬氨酸：丙酮酸氨基转移酶敲除，乙 酰羟酸合酶弱化的重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS arMC-T i/tW。将该菌株在有添加 营养成分玉米浆的发酵培养基上进行培养，能够有效的提高细胞的生长速率及L-丝氨酸 的产量，糖酸转化率和生产强度。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 分别按照如下实验方案将进行基因敲除和对乙酰羟酸合酶（AHAS)进行弱化，最 后获得重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS arMC-T ih#。
[0007] 1)基因扩增：根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计引 物以谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS基因组DNA为模板，分别扩增目的基因上游序列和下 游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段，再将该片段连接至pMD19-T，对目 的基因序列进行测序验证，确证重组克隆质粒序列的准确性； 2) 重组敲除质粒的构建：将所述步骤（1)中的连接有目的片段进行双酶切处理，将目 的片段连接至相同双酶切处理的质粒pKlSmobmc汉转化至凡co/i JM109感受态细胞，筛 选验证阳性克隆； 3) 基因的重组整合：提取步骤（2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒 pKlSmobsaM-职电激转化至谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS及其系列衍生菌株感受态 细胞，通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株。
[0008] 4)重组菌株的验证：利用引物通过PCR扩增验证重组菌株。重复上述实验即可获 得了重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a SS arMC-T ih#。
[0009] 5)将步骤（4)获得的重组菌株在接种至含有2 g/L的玉米浆的发酵培养基中发酵 培养96 h，定时取样检测生物量，糖浓度和氨基酸浓度。
[0010] 其中步骤（5)所述的发酵培养基为（g/L):蔗糖100;硫酸铵30;碳酸钙60; MgSO4 · 7H20 0· 5 ;FeS04 · 7H20 0· 02; MnSO4 · H2O 0· 02;原儿茶酸 30 mg;生物素 50μ g; 硫胺素450 μ g;调节初始pH为7. 2。
[0011] 本发明的的优点和积极效果如下： 通过代谢工程的手段成功的将代谢流从糖酵解途径流向支链氨基酸方向转向了 L-丝 氨酸合成途径，提高了重组菌株的L-丝氨酸的产量和糖酸转化率。通过添加营养物质玉米 浆成分能够有效的补给由于代谢流改变导致菌株对营养物质的需求，提高了菌株的生长速 率，蔗糖的利用速率，进一步的提高了 L-丝氨酸的生产强度。这样结合代谢工程的手段和 发酵工艺优化的策略成功的提高了 L-丝氨酸的产量，糖酸转化率和生产强度，是非常适合 工业化大规模生产L-丝氨酸，有效的解决了微生物发酵利用糖质原料生产L-丝氨酸存在 产量低，生产强度弱的问题。
[0012]
【附图说明】
[0013] 图1为谷氨酸棒杆菌生产L-丝氨酸的代谢网络示意图 图2为用于基因 ariJ敲除的敲除质粒pKlSmobsacifeKiJ构建图。泳道M:DL_5000 DNA Marker;泳道1 :引物和ai^-2获得的上游序列；泳道2 :引物ai^-3和ai^-4 获得的下游序列；泳道3 :引物arM-l和进行交叉PCR扩增上下游融合片段获得 的缺失的片段ariJ泳道4 :片段arM与敲除质粒pK18mob sac及连接后的双酶切验证 图3为重组菌SYPS-062-33a SS arM的PCR验证aria是否成功敲除图。泳道M : DL-5000 DNA Marker;泳道13和14 :为重组菌成功敲除基因 a代a后缺失片段；其他泳道 为未成功敲除基因后的片段 图4为用于基因敲除的敲除质粒pKlSmobsaH 构建图。泳道M:DL-5000 DNA Marker;泳道1 :引物和获得的上游序列；泳道2 :引物和 获得的下游序列；泳道3 :引物和进行交叉PCR扩增上下游融合片 段获得的缺失的片段C-T i/t#永道5 :片段C-T 与敲除质粒pK18mob sac及连接后的 双酶切验证 图5为重组菌SYPS-062-33a SS arMC-T 勺PCR验证是否成功敲除图。泳 道M :DL-5000 DNA Marker;泳道1，8, 11和15 :为重组菌成功敲除基因 ihA后缺失片段； 其他泳道为未成功敲除基因 i7M后的片段 图6为比较不同菌株的乙酰羟酸合酶酶活。A :重组菌SYPS-062-33a SS ; B :重组菌 SYPS-062-33a SS 重组菌 SYPS-062-33a SS arMC-T 冰
【具体实施方式】
[0014] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应指出，以下实例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
[0015] 实施例1 :重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062_33a SS arM的构建 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计用于构建敲除的重组敲除质粒 的引物，引物序列如下： avtA-Ι: -GAAAAGCTTAAGGCCCTGCAGTAGTG-3, {Η?η?ΙΙΙ) avtA-2\ ^ - CCCATCTGTTAAACTTAAACCAAACGGCTGAACATTGCTT-3, avtA-3: 5f - GGTTTAAGTTTAACAGATGGGGGTGTGCGCAAAATCGG-3, avtA-4: 5f - ATTCTAGACCTGCGCTGCCACGTTGT-3, (J^aI) 分别用引物和扩增上游片段，以引物和扩增下游片段， 分别用琼脂糖凝胶电泳纯化上下游片段，见图2,长度分别为507bp和548bp ;分别以上游片 段和下游片段作为模板，以引物和进行交叉PCR扩增上下游融合片段，利用 琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，结果见图2。将目的片段用限制性内切酶Λ?αΙΙΙΙ和ZhI 酶切后回收片段与用相同的限制性内切酶处理的pKISmobsaci?混合，Τ4 DNA Iigase过夜 处理。连接产物转化至凡cWiJM109。挑取单菌落培养提取质粒，"ialIII和油al酶切鉴 定，见图2,该转化子含有重组敲除质粒pKISmob