专利名称：治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，特别是一种治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋 白疫苗及减毒活菌载体疫苗。
背景技术：
胃炎和消化性溃疡是人类的常见病和多发病，胃癌也是发病率和死亡率较高 的恶性肿瘤之一。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性活动性胃炎、消化 性溃疡的最主要病因，同时与胃腺癌和胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相 关(Nomura A, Stemmermann GN, Chyou PH et al. Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among JapaneseAmericans in Hawaii. N-Engl-J-Med. 1991, 325(16) :1132-1136. ；Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al.Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N-Engl-J-Med. 1991, 325(16) :1127-1131. ；Dunn BE, Cohen H, Blaser MJ.Helicobater pylori. Clin-Microbiol-Rev. 1997,10 (4) 720-741. ；Parsonnet J, Shmuely H, Haggerty T. Fecal and oral shedding of Helicobacter pylori from healthy infected adults. J-Am-Med-Assoc. 1999,282(23) :2240_2245.)，世界卫生组织已将Hp列为I类致癌因子。 大量的流行病学研究资料表明，Hp感染呈全球分布。在发达国家，Hp感染率约为40 50 %，而在发展中国家可达 50 60 % (Lee A. Prevention of Helicobacter pylori infection. Scand-J-Gastroenterol. 1996. Suppl 215 :11-15.)。据统计，在中国平均感染 率为58.07% (王凯娟，王润田.中国幽门螺杆菌感染流行病学Meta分析.中华流行病学 杂志.2003,24(6) :443-446.)。目前质子泵抑制剂加两种抗生素的三联疗法是全球推荐的 Hp根除治疗一线方案，但是随着抗生素在Hp感染治疗中的广泛应用，Hp耐药株的发生率不 断上升，以致Hp根除的难度加大(胡伏莲.幽门螺杆菌耐药性及治疗失败原因分析.中国 消化内镜.2009，3 (3) :1-8.)。且存在费用昂贵、根除率低、停药后的复发与再感染、病人的 依从性差等问题。疫苗是控制感染性疾病最为经济有效的办法，通过疫苗刺激机体产生不同于自然 感染导致的特异性免疫应答，可以达到预防或者治疗Hp感染的目的。国内外竞相研究Hp 疫苗，迄今已有Hp全菌灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、减毒活菌载体疫苗、核酸疫苗等研 究，目前，仅有我们研制的“口服重组Hp疫苗”(国药证字S20090002)获得成功。尿素酶是一种能水解尿素的金属酶，约占Hp菌体蛋白总量的8% -10%，与Hp 在胃内定植能力相关，并能引起炎症细胞反应，损伤胃上皮细胞。尿素酶B亚基(UreB) 是目前疫苗Hp研究的首选保护性抗原(Lee A. Vaccination against Helicobacter pylori. J-Gastroenterol. 1996,31 Suppl 9:69-74·)。细胞毒素相关基因蛋白(CagA)， 是Hp重要的毒力因子之一，CagA阳性菌株感染比阴性菌株更易增加十二指肠溃疡和胃 癌等严重胃肠疾病发生的危险性。空泡形成细胞毒素A(VacA)是一种Hp毒素，它可引
4起胃上皮细胞发生空泡样变，诱导细胞凋亡，抑制T细胞增殖，是Hp长期定植感染的因 素之一 (Backert S, Meyer TF. Type IV secretion systems and their effectors in bacterial pathogenesis.Curr-Opin-Microbiol. 2006,9(2) :207_217. ；Amieva MR, El-Omar EM. Host-bacterialinteractions in Helicobacter pylori infection. Gastroenterology. 2008,134(1) :306-323.)。HpCagA、VacA 和 UreB 均具有良好的抗原 性，能够通过粘膜免疫的方式显著地降低Hp在胃组织中的定植水平，表现出一定的保护 作用。在细菌感染过程中，由于宿主与致病菌之间的复杂作用机制，单一的抗原组分的 疫苗难以产生完全而有效的保护作用。现有的研究表明，单一 Hp抗原的免疫保护率几 乎均低于80%，2种及2种以上抗原组合可获得理想的保护效果(Telford JL, Ghiara P. Prospects for the development of a vaccine against Helicobacterpylori. Drugs. 1996,2 (6) 799-804. ；Ruggiero P, Peppoloni S, Berti D, et al.New strategies forthe prevention and treatment of Helicobacter pylori infection. Expert-Opin-Investig-Drugs. 2002，11 (8) : 1127-1138.)。用于 Hp 疫苗的保护性抗原相对 分子质量较大，构建完整的基因工程重组融合蛋白难以表达或表达率极低。选择大分子蛋 白中具有免疫保护功能的蛋白片段来替代全长蛋白分子，仍可以发挥有效免疫应答作用， 且为基因工程重组疫苗的构建带来便利。Hp特殊的定植环境决定了粘膜免疫是较好的疫苗免疫方式，粘膜免疫不仅能够 激发强烈的体液免疫，同时还能较好的诱导局部的IgA抗体水平的升高。粘膜免疫系统是 机体免疫系统的重要组成部分，主要包括肠粘膜相关淋巴组织和支气管粘膜相关淋巴组织 等，它在机体防御功能方面发挥着独特的作用。由肠系膜淋巴结，以及分散在粘膜固有层和 肠上皮中的大量淋巴细胞组成免疫诱导部位和免疫效应部位。胃肠道等粘膜表面各种免疫 细胞通过摄取、加工和提呈抗原，产生并分泌针对该抗原的抗体(主要为slgA)，后者能与 携带此抗原的载体如细菌、病毒等发生特异性结合反应，阻止其定植粘膜表面或侵袭机体， 从而起到一定的免疫防御作用。但是，粘膜免疫的最大缺陷是易对抗原产生免疫耐受，即使 提高抗原量，机体或粘膜产生的抗原特异性slgA水平却很低，对携带相应抗原的微生物的 感染几乎没有免疫防御能力或极弱、极易导致免疫耐受性的发生。鼠伤寒沙门菌是一种常见的侵袭性胞内菌，通过基因工程方法减毒后对宿主致 病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，口服后可在肠道寄生繁殖，可以被小肠M细胞摄 取，穿过肠上皮屏障，因其细菌抗原也同时被APC细胞递呈给免疫细胞而诱导特异性的 免疫应答反应(Sirard JC, Niedergang F，Kraehenbuhl JP. et al. Live attenuated Salmonella :aparadigm of mucosal vaccines. Immunol-Rev. 1999，171 :5_26.)， 被 认为是粘膜免疫的理想载体，是目前最常用的减毒活疫苗载体之一。减毒活载体疫 苗具有安全性高、可以口服给药、保护时间长、副作用小、价格低廉、易于生产、储存和 运输等优点。目前已有多个重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗进入临床研究(Konadu EY, Lin FY, et al. Phase 1 and phase 2 studies ofSalmonella enterica serovar paratyphi A 0-specific polysaccharide-tetanus toxoid conjugates inadults, teenagers，and 2_to 4-year-old children in Vietnam. Infect-Immun. 2000,68(3) 1529-1534. ；Tacket C0， Sztein MB， et al.Phase 2 clinical trial of attenuated Salmonella entericaserovar typhi oral live vector vaccine CVD 908—htrA in
5U. S. volunteers. Infect-Immun. 2000，68 (3) 1196-1201. ；Cunningham C，Nemunaitis J. A phase I trial of genetically modifiedSalmonella typhimurium expressing cytosine deaminase(TAPET-CD, VNP20029)administeredby intratumoral injection in combination with 5-fluorocytosine for patients with advanced ormetastatic cancer.Protocol no :CL_017.Version Apri1 9,2001.Hum-Gene-Ther. 2001， 12(12) :1594-1596. ；Toso JF, Gill VJ, et al· Phase I study of the intravenous administration of attenuatedSalmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J-Clin-Oncol. 2002,20(1) :142_152.)。根据美国食品与药物管理机构(FDA) 的规定，活疫苗中不能存在抗药质粒，且在人和动物体内也无法以抗生素来维持重组质粒 的稳定性。为了在没有抗生素存在条件下，外源保护性抗原能在减毒伤寒沙门菌中稳定 表达，目前已发展起来一种新型的质粒载体系统，即载体-宿主平衡致死系统。平衡致死 系统是一种以营养选择标志代替抗生素抗性标志为主要特征的质粒-染色体平衡致死系 统，也叫载体-宿主平衡致死系统(Tacket CO, Kelly SM，Schodel F. et al. Safety and immunogenicity in humans of an attenuated Salmonellatyphi vaccine vector strain expressing plasmid—encoded hepatitis B antigens stabilized by theAsd—balanced lethal vector system. Infect-Immun. 1997,65(8) :3381_3385· ；Chen H,M. SchifferliD. Mucosal and systemic immune responses to chimeric fimbriae expressed by Salmonellaenterica serovar typhimurium vaccine strains. Infect-Immun. 2000， 68(6) :3129-3139.)。减毒鼠伤寒沙门菌株x4550中的天冬氨酸β半醛脱氢酶基因(asd) 缺失，由于该asd基因编码的天冬氨酸β半醛脱氢酶是二氨基庚二酸(DAP)生物合成途径 中的必需酶，而DAP是革兰阴性细菌细胞壁肽聚糖的基本组成成分，因此asd基因的突变引 起DAP合成的缺乏，导致该突变株成为营养缺陷型菌株。在无外源性DAP的培养条件下，溶 菌死亡。该菌株如被转入含有asd基因的表达质粒，因载体与缺陷型宿主菌构成遗传互补， 则该菌株可稳定携带质粒传代表达。在这一条件下，重组质粒成为细菌生存所必需，一旦转 化子质粒丢失，细菌则由于不能合成必需物质而无法在正常培养基上生长。因此，凡是能在 正常培养基上生长的细菌，必定包含重组质粒，从而构成了平衡致死系统。利用“载体_宿 主平衡致死系统”构建的减毒沙门菌活疫苗更是显示出良好的应用前景。
综上所述，充分综合利用Hp CagA.VacA和UreB的抗原特性，使这几种抗原特性协 同发挥出来，并克服其在粘膜免疫方面存在的易产生耐受性等问题，提供一种用于治疗和 预防Hp感染的疫苗，将给胃炎和消化性溃疡患者带来莫大的福音，但目前并没有这方面的 报道。
发明内容
本发明针对上述领域的空白，提供一种治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋 白疫苗及活疫苗。一种治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗，包括一段重组融合蛋白， 其特征在于所述重组融合蛋白由来源于幽门螺杆菌的幽门螺杆菌细胞毒素相关基因蛋白 CagA,空泡形成细胞毒素VacA及尿素酶亚基UreB的具有免疫保护功能片段线性连接构成。所述幽门螺杆菌细胞毒素相关基因蛋白CagA的免疫保护功能片段CagA16tl的氨基
6酸序列如Seq ID No. 1所示；所述空泡形成细胞毒素VacA的免疫保护功能片段VacA62的氨 基酸序列如Seq ID No. 2所示；所述尿素酶亚基UreB的免疫保护功能片段UreB138的氨基 酸序列如Seq ID No. 3所示。所述重组融合蛋白疫苗具有CagA16tl-VacA62-UreB138的连接顺序。所述重组融合蛋白疫苗的CagA16(1、VaCA62、UreB138之间的连接采用连接肽。所述重组融合蛋白疫苗具有如Seq ID No. 4所示的氨基酸序列编码上述重组融合蛋白疫苗的基因。所述基因具有Seq ID No. 5所示核苷酸序列。一种重组质粒，包括骨架载体和外源基因，外源基因片段包括编码上述重组融合 蛋白疫苗的基因。所述重组质粒的骨架载体为含有天冬氨酸β半醛脱氢酶基因片段的伤寒沙门氏 菌质粒ΡΥΑ3149。一种治疗和预防幽门螺杆菌感染的减毒活菌载体疫苗，包括载体菌和表达免疫原 的外源质粒，所述载体菌为减毒活菌，所述外源质粒为上述重组质粒，所述减毒活菌指通过 基因工程方法减毒后对宿主的致病性显著降低，且保留了对胃、肠的粘膜或细胞的侵染能 力的菌株。所述减毒活菌为减毒鼠伤寒沙门菌株。所述减毒鼠伤寒沙门菌株为缺失了天冬氨酸β半醛脱氢酶基因的菌株X 4550。上述治疗和预防幽门螺杆菌感染的减毒活菌载体疫苗的制备方法，步骤如下(1)以幽门螺杆菌基因组为模板，分别扩增具有Seq ID No. 12,Seq ID No. 13,Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段。(2)连接扩增得到三个基因片段，并构建到含有天冬氨酸β半醛脱氢酶基因片段 的骨架载体ΡΥΑ3149上，筛选重组质粒；(3)重组质粒转入宿主菌χ455°中，扩增Seq ID No. 12、Seq ID No. 13、Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段的 引物分别如下cagA160Pl/cagA160P2 5-gcg IgaattcI gaaacgctcaatcaagaac-3，5-gctacctcctccacttccgcctccttgtgagcctgtgagttggtcttc-3 ；VacA62P l/vacA62P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCTTAGGCACTAACAGCATTAGTAATGT3，5GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCGATAAGATACTTGTAATTGTCGGGGT3 ；ureB138Pl/ureB138P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGACACTTTGAATGAAGCTGGTTGTG3，5GCGAAGCTTAAAATTCTTTCTTGTTTTTGTCAG3。本发明的目的在于提供治疗和预防幽门螺杆菌感染的疫苗，从Hp 26695中筛选 CagA, VacA和UreB蛋白具有免疫保护功能的片段，通过分子生物学方法克隆重组基因，构 建重组表达质粒，表达得到重组融合蛋白。从实施例4的结果可以看出，该重组融合蛋白 具有良好的免疫原性，能够刺激实验鼠产生抗HP的特异性免疫反应，而口服空质粒转化菌
7菌的实验鼠没有产生抗HP的抗体。本领域技术人员基于现有文献中对CagA、VaCA和UreB 三种蛋白的报道，可能选择不同的有免疫功能的片段，然后根据本发明提供的技术方案构 建而得的载体所表达的重组融合蛋白疫苗都在本发明的保护范围内。本发明中，对CagA、 VacA和UreB蛋白具有免疫保护功能的片段的最优选择如下=CagA16tl蛋白的氨基酸序列 如 GenBank :NP_207343. 1 (231-390 位氨基酸，Seq ID No. 1) ；VacA62 蛋白的氨基酸序列 如 GenBank :NP_207680. 1 (744-805 位氨基酸 Seq ID No. 2) ；UreB138 蛋白的氨基酸序列如 GenBank :ΝΡ_206872· 1 (250-387 位氨基酸 Seq ID No. 3)。其中编码CagA16Q、VacA62 和 UreB138 的核酸序列分别为cagA16(1、VacA62 和 ureB138。CagA160覆盖了 GenBank公布的Hp 26695菌株HP0547基因的核酸序列688-1167 位(SeqID No. 12)，包含引入的上游酶切位点和下游Linker核酸序列全长513bp。VacA62覆盖了 GenBank公布的Hp 26695菌株HP0887基因的核酸序列2230-2415 位(SeqID No. 13)，包含引入的上、下游Linker核酸序列全长234bp。UreB138覆盖了 GenBank公布的Hp 26695菌株HP0072基因的核酸序列748-1161 位(SeqID No. 14)，包含引入的上游Linker和下游酶切位点核酸序列全长448bp。本发明构建的重组融合蛋白中，CagA16Q、VacA62和UreB13以线性排列连接，而以 CagA160-VacA62-UreB138的顺序排列时其免疫效果最佳；本发明进一步优选在CagA16(1、 VacA62和UreB13三个元素的相互连接处加入(GGGS) 2 3，(GGGGS) 2 3，(RSIAT) 2 3或 RPACKIPNDLKQKVMNH肽链为柔性Linker，本领域技术人员可根据Linker的常规要求设计 其它多种连接肽，都能到达本发明的目的。本发明优选氨基酸序列为GGGSGGGS(Ge0rgeRA， Heringa J. An analysis of protein domain linkers :their classification and role inprotein folding. Protein Engineering, 2002,15(11) :871_879.)的肽链为连接肽。本发明还提供了编码上述重组融合蛋白的基因序列，其中一种如Seq ID No. 5所 示。本领域技术人员根据本发明提供基因序列，能够构建出表达重组融合蛋白疫苗的重组 质粒、工程菌，用于生产本发明要求保护的重组融合蛋白疫苗。本发明构建的一种重组质粒的骨架载体采用含有天冬氨酸β半醛脱氢酶基因片 段的伤寒沙门氏菌质粒ΡΥΑ3149，该重组质粒可用于转入到缺失天冬氨酸β半醛脱氢酶基 因的减毒菌中构建一种具有载体-宿主平衡致死系统的工程菌，以适宜作为人或动物的疫
田ο本发明的一个重要贡献是提供一种治疗和预防幽门螺杆菌感染的减毒活菌载体 疫苗，是采用减毒活菌作为载体菌，以上述表达重组融合蛋白的质粒为外源质粒构建的工 程菌。采用的减毒活菌指通过人工的如基因工程方法敲除其致病基因使其对人的致病性大 大降低即减毒，并保留了对人或动物的肠胃组织、粘膜、细胞的侵染力的细菌。这样的工程 菌作为疫苗，能够携带表达免疫原的外源基因定植于人或动物的胃肠道而不致病，刺激胃 肠道组织发生免疫应答反应而合成针对免疫原的特异性抗体，保护机体免受具有相同免疫 原的细菌侵袭而致病，由于活疫苗长期定植于胃肠道组织，能够刺激机体保持长期的抗体 合成能力，因此比灭活疫苗的一次性免疫具有更好的保护作用，特别适合于预防和治疗幽 门螺杆菌引起的胃炎、肠炎这种易反复感染发作的病。本发明优选采用减毒的沙门氏伤寒杆菌作为载体菌，转入本发明构建的重组质粒 后得到减毒活菌载体疫苗。减毒鼠伤寒沙门菌是一种常见的侵袭性胞内菌，通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低仍保留良好的侵袭力，且能稳定表达外源基因，可直接 用于免疫保护试验，不需纯化所表达的靶抗原，免去了蛋白质后处理的复杂工序，口服后经 口、鼻、直肠等粘膜途径免疫能诱导强大而特异的免疫反应，可以被小肠M细胞摄取，穿过 肠上皮屏障，因其细菌抗原也同时被APC细胞递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反 应，被认为是粘膜免疫的理想载体，是目前最常用的减毒活疫苗载体之一。由于本发明提供的减毒活菌载体疫苗主要用于预防和治疗HP感染，考虑到用 于人体或动物的活疫苗不能含有抗性基因，因此无法采用抗生素来筛选构建的阳性工 程菌，因此本发明优选采用沙门氏伤寒杆菌菌株(Salmonella typhimurium χ 4550/ AsdXya-NalrCrp-)作为载体菌，由于其突变缺失了天冬氨酸β半醛脱氢酶基因(asd)，需 提供外源的二氨基庚二酸(DAP)，否则因无法正常合成细胞壁而发生溶菌死亡，需要转入携 带有asd基因的外源质粒才可在正常培养基上生长，因此是一种理想的营养缺陷型筛选菌 株。本发明中转入了含有asd基因的重组质粒，如以pYA3149为骨架载体的重组质粒，得到 一种具载体-宿主平衡死亡系统的工程菌，符合口服活疫苗的标准，可广泛用于治疗和预 防HP的感染。实验数据表明该疫苗具有很多优点①可以稳定表达Hp融合蛋白基因；② 免疫后可诱导粘膜和系统免疫应答；③安全有效，方法简便，成本低，具有显著的经济效益。 以这种菌株免疫Hp感染的小鼠，小鼠能生成抗Hp的特异性抗体(图8)，并能清除小鼠胃 内Hp或降低小鼠胃内Hp定植量(表1，表2)，因此本发明可以作为治疗和预防Hp感染的 候选疫苗。本发明还提供上述活疫苗的制备方法，其主要包括以下步骤(1)通过 PCR 方法，分别从 Hp 26695 基因组 DNA 中克隆 CagA16(1、VacA62 和 UreB138 的DNA片段；(2)采用重叠PCR的方法，将步骤(1)中克隆得到的DNA片段连接成融合基因；(3)将融合基因构建到载体质粒上，测序鉴定；(4)将融合基因构建到表达载体上，转化宿主菌株χ 4550 (Salmonella typhimurium χ 4550/AsdXya-NarCrp-)，得到重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗；
图1. cagA160、vacA62和ureB138核酸琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道1 为核酸(DNA)分子量标准(TaKaRa，IOObp DNA Ladder Marker, D505A)，泳道 2 为 cagA160PCR 扩增产物(513bp)，泳道 3 为 vacA62PCR 扩增产物(234bp)， 泳道4为ureB138PCR扩增产物(448bp)。图2.为CagA160-VaCA62的琼脂糖凝胶电泳图其中泳道1 为核酸(DNA)分子量标准(TaKaRa，IOObp DNA Ladder Marker, D505A)，泳道2为cagA160-vacA62融合基因的PCR扩增产物(723bp)。图3. cagA160-vacA62-ureB138 的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1 为核酸(DNA)分子量标准(TaKaRa，IOObp DNA Ladder Marker, D505A)，泳道 2 为 cagA160-vacA62-ureB138 融合基因的 PCR 扩增产物(1147bp)。图4.为重组质粒pET 22b (+) -cagA160-vacA62-ureB138的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳 图
其中泳道1 为核酸(DNA)分子量标准(TaKaRa, Wide Range DNA Marker (100 6，000)，D518A)，泳道 2 为重组质粒 pET 22b (+) -cagA160-vacA62-ureB138EcoR I 和 Hind III 双酶切(5474bp+1135bp)产物。图5.为重组质粒pYA3149-CagA16(1-VaCA62-ureB138的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道1 为核酸(DNA)分子量标准(TaKaRa, Wide Range DNA Marker (100 6，000)，D518A)，泳道 2 为重组质粒 pYA3149-cagA16(l-vacA62-ureB138EcoR I 和 Hind III 双 酶切(3681bp+1135bp)产物。 图6.为SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达。其中泳道1为蛋白质分子量标准(Fermentas，#SM0671)，泳道2为空载体菌 (X 4550 (PYA3149))诱导24h对照，泳道3为重组减毒伤寒沙门菌疫苗株x 4550 (pYA3149_ cagA160-vacA62-ureB138)诱导24h，泳道4为重组减毒伤寒沙门菌疫苗株x 4550 (pYA3149_c agA160-vacA62-ureB138)诱导12h，泳道5为重组减毒伤寒沙门菌疫苗株χ 4550 (pYA3149_ca gA160-vacA62-ureB138)诱导8h，泳道6为重组减毒伤寒沙门菌疫苗株x 4550 (PYASHQ-CagA1 60-vacA62-ureB138) i胃帛 4h。图7.为Western检测重组蛋白的免疫反应性。其中泳道1为蛋白质分子量标准(Fermentas，#SM0671)，泳道2为空载体菌 (X 4550 (PYA3149))诱导24h对照，泳道3为重组减毒伤寒沙门菌疫苗株x 4550 (pYA3149_ cagA160-vacA62-ureB138)诱导 24h。图8.为重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗口服免疫BALB/c小鼠，ELISA方法检测免 疫后Hp特异性血清IgG和胃粘膜IgA抗体结果纵坐标表示450nm处吸光值。图9融合基因cagA16Q-VacA62-ureB138构建示意10pYA3149-cagA16Q-vacA62-ureB138 质粒构建示意图
具体实施例方式实施例1 获得 HpDNA 片段 CagA16tl、VacA62 和 UreB1381.引物设计及合成以GenBank公布的Hp 26695基因组(NC_000915)中核酸序列设计引物，上游引 物5’端引入EcoR I酶切位点，下游引物5’端引入Hind III酶切位点，中间引物引入柔性 Linker (GGGSGGGS)序列(图 9)。引物设计如下 引物由上海生工生物技术有限公司合成。2. PCR 扩增目的 DNA1)模板的制备用“细菌基因组DNA提取试剂盒” (TIANGEN，DP302)抽提Hp 26695(购自美国标准 菌种收藏所American Type Culture Collection，ATCC，本单位有保存，可向公众发放作为 验证试验使用)基因组，操作按说明书进行。2) PCR 扩增以Hp 26695 基因组 DNA 为模板，分别用 CagA16tlPl 和 cagA16(1P2 扩增 cagA16(1， VacA62Pl 和 vacA62P2 扩增 VacA62，UreB138Pl 和 ureB138P2 扩增 UreB138。采用宝生物工程 (大连)有限公司(RaKaRa)高保真 DNA 聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase, Code DROlOA)进行PCR扩增，反应体系如下反应物体积
5xPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)20μ1
dNTP Mixture (各 2.5mM)8μ1
Pl (ΙΟμΜ)2μ1
Ρ2 (ΙΟμΜ)2μ1
Hp 26695 基因组Ιμ DNA (lOOng/μΙ)
PrimeSTAR HSΙμ
DNA Polymerase (2.5 U/μΙ)
灭菌蒸馏水_66μ1PCR 反应条件为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 45s，30 个循环；72°C完全延伸lOmin。反应完毕后取3 μ 1 PCR反应产物，2. 0%琼脂糖凝胶电泳检 测(图1)。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，得到cagA16(1、VacA62和UreB138DNA片段。
实施例 2 构建 cagA16Q-VacA62-ureB138 融合基因1.重叠延伸PCR获得CagA16Q-VaCA62融合基因以回收的CagA16tl和VacA62基因片段为模板，CagA160Pl和vacA62P2为引物进行PCR 扩增，反应体系如下
反应物体积
5xPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)20μ1
dNTP Mixture (各 2.5mM)8μ1
回收的 cagA160 (25ng^l)2μ1
回收的 vacA62 (lOng/μΙ)2μ1
PrimeSTAR HSΙμ DNA Polymerase (2.5 U/μΙ)
灭菌蒸馏水63μ1PCR 反应条件为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 10个循环；加入 CagA16tlPl (10 μ Μ)和 vacA62P2 (10 μ Μ)各 2 μ 1 ；94°C变性 30s，56°C退火30s， 72°C延伸2min，30个循环；72°C完全延伸lOmin。反应完毕后取3 μ 1 PCR反应产物，2.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。图2中显示融合基因片段大小与预计一致，表明重叠延伸得到融合 基因。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，得到CagA16trvacA62融合基因。2.重叠延伸 PCR 获得 cagA16Q-vacA62-ureB138 融合基因以回收的CagA16Q-VaCA62融合基因和UreB138基因片段为模板，CagA160Pl和
12ureB138P2为引物进行PCR扩增，反应体系如下
反应物体积
5xPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)20μ1
dNTP Mixture (各 2.5mM)8μ1
回收的 cagA160-vacA62 (25ng/W)2μ1
回收的 UreBu8 (15ng^l)2μ1
PrimeSTAR HSΙμ DNAPolymerase (2.5 U/μΙ)
灭菌蒸馏水63μ1PCR 反应条件为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 10 个循环；加入 CagA160Pl(IOyM)和 ureB138P2 (10 μ M)各 2μ 1 ；94°C 变性 30s，56°C 退火 30s，72°C延伸2min，30个循环；72°C完全延伸lOmin。反应完毕后取3 μ 1 PCR反应产物， 2. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。图3中显示融合基因片段大小与预计一致，表明重叠延伸得 到融合基因。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，得到CagA16crvacA62-UreB138融合基因。实施例3 重组质粒 pET 22b (+) -cagA160-vacA62-ureB138 的构建1.酶切将获得的CagA16(1-VaCA62-ureB138融合基因与pET 22b (+)质粒，分别用宝生物工程 (大连)有限公司限制性内切酶EcoR I和Hind III做双酶切，按照说明书操作。酶切鉴定结 果如图4所示。琼脂糖凝胶电泳，分别回收5. 5kb载体片段和1. Ikb cagA160-vacA62-ureB138 融合基因片段。2.连接通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体 摩尔数比一般为1 2 10的原则，进行连接反应(使用宝生物工程(大连)有限公司连 接试剂盒)，连接反应体系如下cagA160-vacA62-ureB138 酶切回收产物 4 μ 1 ；pET 22b (+)质粒载体 1 μ 1 ；连接溶液 5μ1。总体积10μ 1，16°C连接反应2小时。3.转化将连接产物，转化Ecoli DH5a，氨苄抗性筛选阳性重组子。4.鉴定重组质粒挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落，抽提质粒，用EcoR I和Hind III做双酶切 鉴定，鉴定正确后回收基因片段(图4)。质粒送上海生工生物技术有限公司测序，融合基因 片编码的蛋白序列与预计完全一致(见序列表)。实施例4重组质粒pYA3149-cagA16(1-vacA62-ureB138的构建及融合蛋白在重组减毒 沙门菌中的表达及抗原性检测1.质粒抽提抽提质粒pYA3149(美国Washington大学Roy Curtiss III博士惠赠，本单位有
13保存，可向公众发放作为验证试验使用)以及PET 22b(+)-cagA16(1-vacA62-ureB138。2.酶切反应载体pYA3149 以及 pET 22b (+)-cagA16(|-vacA62-ureB138p 均用 EcoR I 和 Hind III 双酶切。琼脂糖凝胶电泳，回收后酶切目的片段。3.连接反应通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体 摩尔数比一般为1 2 10的原则，进行连接反应(使用宝生物工程(大连)有限公司连 接试剂盒)，连接反应体系如下cagA160-vacA62-ureB138 酶切回收产物 4μ 1 ；ρΥΑ3149 质粒载体 1μ 1 ；连接溶液 5 μ 1。总体积 10 μ 1，16°C连接反应 2 小时得至IJ pYA3149-cagA16Q-vacA62-ureB138 (见图 3)。4.转化将连接产物，电转减毒鼠伤寒沙门菌株X 4550 (美国Washington大学Roy Curtiss III博士惠赠，本单位有保存，可向公众发放作为验证试验使用)，电转条件为电 压2500V,电容25uF,电阻200 Ω，电转杯2mm，放电时间3 5ms。LB平板筛选阳性重组子。5.鉴定重组表达质粒挑取LB平板上的单个菌落，抽提质粒，用EcoR I和Hind III做双酶切鉴定，鉴定 正确(图5)。质粒pYA3149-cagA16(1-vacA62-ureB138构建成功(图10)，并得到重组减毒伤 寒沙门菌疫苗株 χ 4550 (pYA3149-cagA160-vacA62-ureB138)。6.表达鉴定1)重组工程菌的诱导取鉴定正确的重组工程菌接种于5ml LB培养液中，37°C摇床培养(200r/min)过 夜。次日将过夜培养的重组工程菌按的比例转种于20ml LB培养液中，37°C摇床培 养(200r/min)待0D600 = 0. 8时，加入IPTG至终浓度为lmmol/L诱导，于诱导24小时 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，同时作空载体菌(χ 4550 (pYA3149))诱导对照。2) SDS-PAGE检测重组蛋白的表达取Iml诱导24小时的菌液，离心，100μ 1双蒸水重悬沉淀，加入100μ 1 2χ SDS-PAGE上样缓冲液，混勻，沸水浴10分钟。SDS-PAGE电泳(4%浓缩胶10%分离胶)，考 马斯亮蓝染色，与预染Marker (Fermentas，#SM0671)对照分析电泳结果，有与设计的重组 融合蛋白理论分子量(41kd)相符的蛋白表达(图6)。7.抗原性检测1) Western检测重组蛋白的免疫反应性以兔抗Hp全菌抗血清鉴定重组蛋白的免疫反应性，结果表明重组蛋白与兔抗Hp 全菌抗血清有很好的免疫反应性(图7)。2)动物实验检测重组蛋白的免疫原性将2. OX IO8Cfu (菌落形成数)重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗口服免疫BALB/c小 鼠，经ELISA检测(图8，*:p< 0.01)，经统计学分析(t检验)，口服疫苗组与PBS (磷酸 盐缓冲液，PH7. 0)组比较，免疫后Hp特异性血清IgG和胃粘膜IgA抗体均有显著差异，ρ < 0. 01 ；空质粒菌组与PBS组比较差异不显著，ρ > 0. 05。
结果表明，该疫苗可诱生BALB/c小鼠产生高效价的抗Hp的血清IgG抗体和胃粘 膜分泌型IgA抗体，而口服免疫等量空质粒菌(x4550(pYA3149))不会诱生抗Hp的抗体， 证实重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗具有良好的免疫原性。实施例5重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗治疗及预防Hp感染动物实验1.预防Hp感染动物实验按动物实验检测重组蛋白的免疫原性方法免疫小鼠，各组小鼠于免疫后4周同时 灌喂制备好的Hp菌液。所有实验动物提前24小时断食、断水，每次每只灌喂菌液0. 2ml，约 2. OX IO8CfuHp菌液；上、下午各一次，间隔6小时，术次灌喂后2小时供食水。分别灌喂等 量空质粒菌(χ 4550 (pYA3149))和PBS作为对照。攻毒后第4周所有实验动物均处死并采集标本，处死前24小时断食水。解剖小 鼠，取出鼠胃，沿胃大弯剖开，用生理盐水轻轻冲掉胃内残留物，将一半胃粘膜组织涂布Hp 培养基，三线法划线接种，微需氧培养，观察Hp攻毒后小鼠Hp的定植情况(表1)。表1重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗预防Hp感染效果 经统计学分析(χ 2检验)，疫苗组与空质粒菌组和PBS组比较，Hp感染动物数均 有显著差异，P <0.01 ；空质粒菌组与PBS组比较差异不显著，ρ > 0. 05。结果显示疫苗免疫组小鼠胃内Hp感染率显著低于空质粒菌对照组和PBS对照 组，保护率为83. 3%，且感染的小鼠胃内Hp定植量显著低于空质粒菌对照组和PBS对照组。结论该重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗口服免疫小鼠，与空质粒菌免疫和未免疫 组相比，可产生针对Hp活菌攻击的抵抗力，有预防Hp感染的作用。2.治疗Hp感染动物实验按预防Hp感染动物实验中的方法，建立Hp感染小鼠动物模型。感染后8周，将 2. 0 X IO8Cfu重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗经口灌入小鼠胃免疫。分别灌喂等量空质粒菌 (Χ 4550 (pYA3149))和PBS (磷酸盐缓冲液，pH7. 0)作为对照。免疫后6周，按预防Hp感染 动物实验中的方法，观察免疫治疗后小鼠Hp的定植情况(表2)。表2重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗治疗Hp感染效果 经统计学分析(X 2检验)，疫苗组与空质粒菌组和PBS组比较，治疗后未检测到 Hp动物数及治疗后Hp定植量明显减少动物数均有显著差异，ρ <0.01 ；空质粒菌组与PBS 组比较差异不显著，P >0. 05。结果显示疫苗免疫组小鼠胃内Hp定植量比空质粒菌对照组和PBS对照组均显著 下降，保护率为76. 7% ；部分小鼠胃内Hp甚至得到清除，Hp清除率为43. 3%。结论该重组减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗口服免疫Hp感染的小鼠，与空质粒菌免疫 和未免疫组相比，可对小鼠胃内定植的Hp活菌产生免疫治疗效果，有治疗np感染的作用。
权利要求
一种治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗，包括一段重组融合蛋白，其特征在于所述重组融合蛋白由来源于幽门螺杆菌的幽门螺杆菌细胞毒素相关基因蛋白CagA、空泡形成细胞毒素VacA及尿素酶亚基UreB的具有免疫保护功能片段线性连接构成。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白疫苗，所述幽门螺杆菌细胞毒素相关基因蛋白 CagA的免疫保护功能片段CagA16tl的氨基酸序列如Seq ID No. 1所示；所述空泡形成细胞 毒素VacA的免疫保护功能片段VacA62W氨基酸序列如Seq ID No. 2所示；所述尿素酶亚基 UreB的免疫保护功能片段UreB138的氨基酸序列如Seq ID No. 3所示。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白疫苗，具有CagA16ci-VacA62-UreB138的连接顺序。
4.根据权利要求2或3所述的重组融合蛋白疫苗，所述CagA16(1、VacA62、UreB138之间采 用连接肽。
5.根据权利要求4所述的重组融合蛋白疫苗，所述重组融合蛋白具有如SeqID No. 4 所示的氨基酸序列。
6 一种重组质粒，包括骨架载体和外源基因，所述外源基因包括编码权利要求1 5任 一所述重组融合蛋白疫苗的基因。
7.根据权利要求6所述的重组质粒，所述骨架载体为含有天冬氨酸β半醛脱氢酶基因 片段的伤寒沙门氏菌质粒ΡΥΑ3149。
8.一种治疗和预防幽门螺杆菌感染的减毒活菌载体疫苗，包括载体菌和表达免疫原的 外源质粒，所述载体菌为减毒活菌，所述外源质粒为上述重组质粒，所述减毒活菌指通过基 因工程方法减毒后对宿主的致病性显著降低，且保留了对胃、肠的粘膜或细胞的侵染能力 的菌株。
9.根据权利要求8所述的减毒活菌载体疫苗，所述减毒活菌为减毒鼠伤寒沙门菌株。
10.根据权利要求9所述的减毒活菌载体疫苗，所述减毒鼠伤寒沙门菌株为缺失了天 冬氨酸β半醛脱氢酶基因的菌株χ 4550。
11.权利要求10所述减毒活菌载体疫苗的制备方法，步骤如下(1)以幽门螺杆菌基因组为模板，分别扩增具有SeqID No. 12, Seq ID No. 13, Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段。(2)连接扩增得到三个基因片段，并构建到含有天冬氨酸β半醛脱氢酶基因片段的骨 架载体ρΥΑ3149上，筛选重组质粒；(3)重组质粒转入宿主菌χ4550中，扩增Seq ID No. 12、Seq ID No. 13、Seq ID No. 14所示核苷酸序列的基因片段的引物 分别如下CagA160 Pl/cagA160 P2 5-gcg IgaattcI gaaacgctcaatcaagaac-3 ,5-gctacctcctccacttccgcctccttgtgagcctgtgagttggtcttc-3 ；VacA62 Pl/VacA62 P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCTTAGGCACTAACAGCATTAGTAATGT3,5GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCGATAAGATACTTGTAATTGTCGGGGT3 ；UreB138 Pl/ureB138 P2 5GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGACACTTTGAATGAAGCTGGTTGTG3，5GCGAAGCTTAAAATTCTTTCTTGTTTTTGTCAG3。
全文摘要
本发明“治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗”，属于生物制药领域。本发明提供的重组融合蛋白疫苗及表达该重组融合蛋白的减毒活菌载体疫苗，其特征在于所述重组融合蛋白由来源于幽门螺杆菌的幽门螺杆菌细胞毒素相关基因蛋白CagA、空泡形成细胞毒素VacA及尿素酶亚基UreB的具有免疫保护功能片段线性连接构成，通过动物实验验证其免疫原性及免疫保护性。该活疫苗具有以下优点，①可以稳定表达Hp融合蛋白基因；②免疫后可诱导粘膜和系统免疫应答；③方法简便，成本低，具有显著的经济效益。可以作为治疗和预防Hp感染的候选疫苗。
文档编号A61P31/04GK101905018SQ20101013964
公开日2010年12月8日 申请日期2010年4月6日 优先权日2010年4月6日
发明者余抒, 刘开云, 吴超, 毛旭虎, 石云, 解庆华, 邹全明, 郭刚, 陈立 申请人:中国人民解放军第三军医大学