专利名称：重组幽门螺杆菌热休克蛋白60的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组幽门螺杆菌热休克蛋白60。
背景技术：
受幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的后果是萎缩性胃炎和消化性溃疡，粘性、产酸或产胃蛋白酶的胃上皮细胞变性，被视为癌前期损害。胃癌居全球第二，发生的全部胃癌中约有60％大概是幽门螺杆菌感染的结果(Parsonnet等，1991；Nomura等，1991)。许多工业化国家中受到感染的人有20％以上在其一生中患上胃溃疡或十二指肠溃疡；这类常见的胃-十二指肠疾病必被视为传染病并需适当治疗(Alper，1993)。因此，可以采用防止幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的预防性疗法(例如，免疫接种)以及消除已发生的幽门螺杆菌感染的疗法来治疗这类常见的胃-十二指肠疾病。
细菌从口摄入后，首先到达极酸的胃腔(pH1-2)中。并借助于腔(pH1-2)和上皮细胞表面(Ph6-7)之间的pH梯度进行自身定向。它们通常生活在窦区的深腺(deepcrypts)中，在此免受如酸、胃蛋白酶这样的外界影响，也免受如抗生素这样的药物对其进行的清除。部分菌群(约20％)与上皮细胞、特别是产粘液细胞密切相关。在胃化生的条件下即在十二指肠中由酸诱发的胃上皮形成的条件下，十二指肠中的化生区也被移生；这就产生了十二指肠溃疡发展的前提。随流出的粘液完全排出大概受到其粘附能力的阻碍，这样细菌就可以存活几年、几十年或者甚至一生(慢性感染)。
用解酸剂或H2-受体拮抗剂进行治疗的，虽然能抑制胃壁细胞分泌酸，通常能治愈溃疡，但却不能由此消除溃疡病。
更为常用的溃疡疗法是铋处理。各种铋盐(CBS、BSS)对幽门螺杆菌都有杀菌效果。但仅在8-32％的病例中达到完全清除细菌的效果。这种处理表面上造成细菌的暂时抑制，但停止处理后多数病例中感染会再次发作。用高剂量长期治疗会导致这些物质在肝、肾和神经系统中的积累，具有相当大的神经学副作用(Malfertheiner，1994)。
也有用抗生素消除病原体。然而，用各种抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin红霉素a.o)进行单独治疗已被证实并不令人满意，因为甚至在这种情况下仅有0-15％病例会根除细菌。目前，把酸阻断剂(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)结合使用达到最成功的治疗效果，这种疗法使清除率达80％(Malfertheiner，1994)。不过，用抗生素治疗消除幽门螺杆菌并不是有前途的长期治疗方案，因为细菌会迅速产生对抗生素的耐性。
受幽门螺杆菌感染会导致胃粘膜的慢性炎症反应(胃炎)。另外，诱发对幽门螺杆菌抗原的特异性全身免疫反应；不过，分泌性抗体(slgA)在胃中的形成尚未得到无可争议的阐述。发炎的结果是在胃粘膜和亚粘膜中存在多种免疫细胞，例如多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞(Blaser，1992)。此外，幽门螺杆菌在体外激活嗜中性白细胞、单核细胞和巨噬细胞(Mai等，1991)。用特异性抗体和补体进行的实验表明，在体外嗜中性白细胞使幽门螺杆菌迅速失活。
目前根除HP的主要手段是抗菌疗法，但有相当的局限性。免疫预防已成为防治HP感染最有效的方法之一。
在HP的免疫防治研究方面，目前已有以尿素酶B为主的多种HP抗原作为疫苗候选抗原，但效果均不理想。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术的不足之处，提供一种运用PCR技术克隆幽门螺杆菌热休克蛋白60基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，免疫原性高的基因重组幽门螺杆菌热休克蛋白60。
本发明的目的是这样实现的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列；和(a)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(b)细胞被载体所转化；及(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列。
除了序列号1所示核苷酸序列和遗传密码简并性范围内与该序列相应的核苷酸序列之外，本发明还包括在严格条件下与这些序列之一杂交的DNA序列。本发明包括在些洗涤条件下与序列号1所示核苷酸序列之一杂交或与在遗传密码简并性范围内的相应核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明的DNA分子最好编码能粘附到人细胞上，特别是人胃上皮细胞上的多肽。此外，本发明的DNA分子最好在核苷酸水平上与序列号1所示核苷酸序列有至少70％、特别优选至少90％的同源性。而且，该DNA分子的长度最好至少为45个核苷酸，优选至少50个核苷酸。
本发明的又一个目的是含本发明DNA分子的至少一个拷贝的载体。该载体可以是最好在表达信号(启动子、操纵基因、增强子等)控制下本发明DNA分子位于其上的任何原核或真核载体。原核体的例子有象噬菌体(例如λ噬菌体)这样的染色体载以及象质粒这样的染色体外载体，而环状质粒载体是特别优选的。
本发明的载体也可以是真核载体例如酵母载体或者是适于高等细胞的载体(例如，质粒载体、病毒载体、植物载体)。
本发明的又一目的是用本发明载体转化的细胞。在一优选实施方案中，该细胞是原核细胞、优选革兰氏阴性的原核细胞、特别优选大肠杆菌细胞。不过，另一方面，本发明的细胞也可以是真核细胞，例如真菌细胞(如酵母)、动物或植物细胞。
本发明还涉及由本发明DNA分子编码的多肽。该多肽最好能粘附人细胞，并且包括(a)序列号1所示氨基酸序列，或(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的氨基酸序列。
本发明的多肽最好与序列号1所示核苷酸序列有至少90％的同源性，最优选至少98％的同源性。
本发明的多肽最好通过下述方法生产用本发明的DNA分子或载体转化一种细胞，在多肽能得以表达的条件下培养转化的细胞，从细胞或/和培养物上清液中分离多肽。该方法中可获得融合多肽形式的本发明多肽。
本发明的多肽也可作免疫原来产生抗体。因此，本发明还涉及抗本发明多肽的抗体。
本发明另一方面涉及一种药用组合物，它包含作为活性物质的本发明的DNA分子、本发明的多肽或本发明的抗体，选择性地含有常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。
一方面，本发明的药用组合物可用于诊断幽门螺杆菌感染。
另一方面，该药用组合物也可用于防止或治疗幽门螺杆菌感染。对治疗应用而言，将多肽或其片断用于产生主动疫苗，或将抗体用于产生被动疫苗。
本发明具有运用PCR技术克隆幽门螺杆菌热休克蛋白60基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，免疫原性高及具有佐剂作用等优点。
在小鼠和人类的分枝杆菌感染模型中，Hsp60的免疫应答处于优先地位，特别表现在Hsp60成为抗体和T细胞应答的免疫优势靶抗原，HpHsp60是防治Hp的优秀商苗候选成分。国内尚未见有关HpHsp60的研究报道。本发明对Hsp60的目的基因进行了克隆和表达并研究了其免疫原性。
蛋白电泳分析结果发现，经诱导后表达相对分子量为60×103量大小一致，凝胶自动扫描分析，其Hsp60重组蛋白占菌体总蛋白的27.2％，其中可溶性表达占上清的14.7％，纯化后的Hsp60纯度约达80％。
动物实验显示了幽门螺杆菌Hsp60具有佐剂的作用。在目前以尿素酶B亚单位为主的多种候选抗原防治Hp感染效果的不确定性的情况下，将HpHsp60纳入Hp疫苗成分，既可作为多价疫苗，又解决了CT或LT作为佐剂价格昂贵和具有潜在毒性的缺点。
另外，动物实验也发现HpHsp60保护率可达90％，表明HpHsp60是制备Hp疫苗的种新抗原。
图1是本发明的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，图2是本发明的重阻质粒PET-22b(+)/Hsp60的双酶鉴定图谱，图3是本发明的Hsp60重组蛋白的SDS-PAGE分析图，图4是序列表。
具体实施例方式
下面将结合附图和实施例对本发明的作进一步的详述如图1～3所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列；在核酸水平上它与序列号1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的长度至少为45个核苷酸；(a)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(b)细胞被载体所转化；多肽，它由DNA分子所编码，它包括(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列，产生多肽的方法，载体转化一种细胞，在多肽得以表达的条件下培养转化的细胞，并从细胞或/和培养物上清液中分离出多肽。多肽作为免疫原产生抗体的应用和多肽的抗体。药用组合物，(a)它包含作为活性物质的DNA分子、多肽或者抗体，选择性地包含常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体，(b)药用组合物用来诊断幽门螺杆菌感染的应用，(c)药用组合物用于生产防止或治疗幽门螺杆菌感染用的药剂的应用，(d)药用组合物用于多价疫苗。
利用基因克隆技术对热休克蛋白60的基因进行了克隆和表达并研究了其免疫防治作用。
1材料与方法1.1质粒和菌株菌株BL21(DE3)、质粒pET-22b(+)和幽门螺杆菌SS1为第一军医大学南方医院消化研究所保存。
1.2工具酶及试剂限制性内切酶NotI、NcoI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶购自New EnglandBiolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准λDNA/EcoR I+Hind III购自华美生物工程公司，琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司，测序质粒纯化试剂盒购自美国Qiagen公司，其它试剂为国产分析纯。
1.3 Hp染色体DNA的提取从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，按基因组DNA小量制备法制备，详见参考文献[1]。
1.4质粒的提取及纯化质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法，详见参考文献[2]。
1.5目的基因的PCR扩增设计引物，在其5′端加上合适的限制性酶切位点，由博亚公司合成。序列如下热休克蛋白6015′-TG GCC ATG GAT GGG CCA AGA GGC AGG AAT-3′NcoI热休克蛋白6025′-AG TGC GGC CGCCAT CAT GCC GCC CAT G-3′NotI热启动法进行PCR，95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后再延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.6DNA片段的酶切、连接、转化和阳性克隆的鉴定质粒和目的基因DNA经NotI和NcoI双酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4连接酶作用下16℃连接12h，转化宿主菌BL21(DE3)，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。
1.7序列测定及分析碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆质粒，用自动测序仪进行序列分析。
1.8诱导表达和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳热休克蛋白60阳性克隆经IPTG诱导表达后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.9动物实验对已经感染幽门螺杆菌的小鼠通过黏膜途径给予热休克蛋白60，观察治疗作用。对未感染幽门螺杆菌的小鼠先通过黏膜途径给予热休克蛋白60，然后再用幽门螺杆菌进行攻击，观察保护作用。
2结果2.1热休克蛋白60基因的扩增PCR结果电泳分析发现在1500bp左右有一条带，大小与预计相符，结果见图1。
2.2重组质粒的构建及酶切鉴定将PCR产物经NotI和NcoI双酶切后，定向插入经同样双酶切的pET-22b(+)载体中，获得重组质粒命名为pET-22b(+)/热休克蛋白60。经NotI和NcoI双酶切后的重组质粒电泳，结果见图2。
2.3热休克蛋白60基因片段的序列分析直接以重组质粒pET-22b(+)/热休克蛋白60为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列，自动测序仪序列分析结果见后(图4)。
2.4热休克蛋白60基因在大肠杆菌中的表达热休克蛋白60阳性克隆株在LB培养液(含100ug/ml氨苄青霉素)中37℃过夜培养，然后按1％转接至含氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至D值为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达3h，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液、菌体超声后的上清以及沉淀进行10％SDS-PAGE电泳分析(图3)。结果发现，经诱导后表达相对分子量为60×103白60重组蛋白占菌体总蛋白的27.2％，其中可溶性表达占上清的14.7％，包涵体部分占沉淀的76.6％。
2.5动物实验热休克蛋白60的治疗和保护有效率均为100％。
参考文献[1]Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manua 1.2nded.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.35。
Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.颜子颖，王海林译。精编分子生物学指南。北京科学出版社，1998.39。
权利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1号所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它与序列号1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.如权利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的长度至少为45个核苷酸。
4.如权利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(b)细胞被载体所转化。
5.多肽，其特征在于它由权利要求1～4之一的DNA分子所编码。
6.如权利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列。
7.产生权利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用权利要求1～3之一的DNA分子或权利要求4的载体转化一种细胞，在多肽得以表达的条件下培养转化的细胞，并从细胞或/和培养物上清液中分离出多肽。
8.权利要求5～6之一的多肽作为免疫原产生抗体的应用和多肽的抗体。
9.药用组合物，其特征在于(a)它包含作为活性物质的权利要求1～3之一的DNA分子、权利要求5～6之一的多肽或者权利要求8或9的抗体，选择性地包含常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体，(b)药用组合物用来诊断幽门螺杆菌感染的应用，(c)药用组合物用于生产防止或治疗幽门螺杆菌感染用的药剂的应用，(d)药用组合物用于多价疫苗。
全文摘要
重组幽门螺杆菌热休克蛋白60，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列。本发明具有运用PCR技术克隆幽门螺杆菌热休克蛋白60基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，免疫原性高的优点。
文档编号G01N33/68GK1654474SQ0310989
公开日2005年8月17日 申请日期2003年4月17日 优先权日2003年4月17日
发明者张亚历, 王继德, 但汉雷, 白杨, 张振书, 周殿元 申请人:南方医院