使用热休克治疗眼睛疾病的制作方法

专利名称：使用热休克治疗眼睛疾病的制作方法
使用热休克治疗眼睛疾病 与相关申请的交叉参考本申请主张以下美国临时申请案；第60/703,068号，申请于2005 年7月27日，及第60/729， 182号申请于2005年10月21日的权益。 这些申请的完整内容于此并入本案作为参考。 联邦政府赞助研究下完成本发明的权利申明这个成果是由国家眼科研究所资金赞助，资金号EY016070-01。 政府可拥有本发明的权利。 发明背景在西方国家，与年龄相关的黄斑退行性改变(ARMD)是致盲的最 普遍原因。因此，ARMD是一种非常重要的公共健康问题。约有85%至 90%的病人患有非渗出性(干)形式ARMD。其由视网膜色素上皮萎縮、 去色素及视网膜色素上皮损失所组成。干性ARMD好发于老年人群，严 重影响其生活质量。而可选择的治疗有限。除了营养与维他命的补充 外，对此形式的疾病并无特效治疗。目前，对于ARMD的治疗手段是无 效的。所以，迫切需要改进的治疗方法。 发明概括如下文所述，本发明特别记载治疗眼睛疾病的方法，其通过引发 热休克反应，聚集干细胞至眼睛以修复损伤组织。在第一方面，本发明特别记载一种改善对象的眼睛疾病的方法。 该方法包括在眼睛组织的至少一个细胞内引发热休克；及聚集干细胞 至该眼睛组织，从而改善眼睛失调。在一个具体例中，在眼睛组织内 使用低于可见阈激光(sub-visible threshold, SVL)刺激来引发热 休克。在另一具体例中，热休克的引发是使用一种小分子化合物，其 选自由格尔德霉素、雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉 素、EC102、根赤壳菌素、二牛龙牛儿基丙酮(geranylgeranylacetone)、 芍药苷、PU-DZ8及H-71组成的群组。在又一具体例中，热休克的引发是使用热休克多肽，或是使用含有编码热休克多肽(如Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40)的多核苷酸的表达载体。在又一个具体例中， 热休克多肽是Hsp70或Hsp90。在又另一个具体例中，干细胞是骨髓衍 生细胞，如造血干细胞。在又另一个具体例中，该方法降低至少该眼 睛疾病或失调的一种症状。在更进一步的具体例中，该眼睛疾病或失 调是糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼视网膜色素病变、 与年龄相关的黄斑退行性改变、青光眼、角膜营养不良、视网膜先天 性裂(retinoschises)、斯特格病变(Stargardt's Disease)、常染色 体显形玻璃膜疣、及贝斯特黄斑营养不良(Best' s macular dystr叩hy)、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、光损伤、缺血性视网膜病 变、炎症引发的视网膜病变、X伴性青年性视网膜先天性裂、青光眼、 莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢状视网 膜萎縮的任何一种或更多种。在另一方面，本发明提供一种聚集干细胞至需要它们的对象眼睛 组织的方法。该方法包括以阈下激光刺激眼睛组织，其中刺激程度是 足够使至少一个干细胞聚集至该组织。在多个具体例中，激光治疗特 载的工作期(duty cycle)为10%或15%;阈下激光具有波长自至少约 100nm至2000nm (如100、 200、 250、 300、 500、 750、 1000、 1250、 1500、1750、2000)。在又一个具体例中，阈下激光能是自约5mW至200mW (如5、 10、 25、 50、 75、 100、 125、 50、 175、 200mW)并于具有持续 时间为自约0, OOlmsec至1. Omsec (如0.001、 0.005、 0.01、 0.025、 0.5、 0. 75或1.0msec)的微脉冲进行。在其他具体例中，激光能是自 约10mW至100mW (如5、 10、 25、 50、 75、 100、 125、 50、 175、 200mW) 且微脉冲持续时间为0. lmsec。在又一个具体例中，该刺激提高热休克 蛋白质的表达或生物活性，该热休克蛋白选自由Hspl00、Hsp90、Hsp70、 Hsp60及Hsp40组成的群组。在另一个具体例中，该提高为至少约为5、 10、 20、 25、 50、 75或100%或更多。在又一个具体例中，该刺激改变 一种蛋白质的表达或活性，该蛋白质选自由SDF-1 、 VEGF、 HIF-lci、 晶状球体蛋白、缺氧诱导因子I- a (HIF-la)及CXCR-4所组成的群组。 在另外其它的具体例中，该方法提高Hsp70或Hsp90多肽的表达为至 少10倍、20倍、40倍、50倍或更多。在又另一方面，本发明提供一种聚集干细胞至需要它们的对象眼 睛组织的方法。该方法包括向对象投用足够量的试剂以在眼睛组织内 引发热休克；及聚集干细胞至该眼睛组织。在又另一方面，本发明提供一种改善需要的对象的眼睛疾病或失 调的方法。该方法包括向对象投用足够量的试剂以在眼睛组织内引发 热休克；及聚集千细胞至该眼睛组织，从而改善该眼睛疾病或失调。在一个相关方面，本发明提供一种使需要的对象视网膜再生的方 法。该方法包括向对象投用足够量的试剂以在眼睛组织内弓i发热休克； 及聚集千细胞至该眼睛组织，从而使视网膜再生。在另一相关方面，本发明提供一种修复需要的对象视网膜色素上 皮损失的方法。该方法包括向对象投用足够量的试剂以在眼睛组织内 引发热休克；及聚集干细胞至该眼睛组织，从而修复视网膜色素上皮。在另一相关方面，本发明特载一种改善需要的对象眼睛疾病或失 调的方法。该方法包括向对象投用动员对象体内骨髓衍生干细胞的试 剂；在眼睛组织内引发热休克；及聚集干细胞至该眼睛组织，从而改 善该眼睛疾病或失调。在一个相关方面，本发明特载一种改善需要的对象黄斑退行性改 变的方法。该方法包括向对象投用GM-CSF及/或干细胞因子，其中该 投用动员对象体内骨髓衍生干细胞；通过投用阈下激光治疗或药学试 剂来引发热休克；及聚集该骨髓衍生干细胞至该眼睛组织，从而改善 黄斑退行性改变。在另一方面，本发明特载一种聚集干细胞的药学组合物，该组合 物含有为眼睛投药而配制在药学可接受的赋形剂内的有效量的小分子 化合物，其选自由格尔德霉素、雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧 基格尔德霉素、EC102、根赤壳菌素、二牛龙牛儿基丙酮、芍药苷、PU-DZ8 及H-71组成的群组。在另一方面，本发明特载一种于眼睛组织聚集干细胞的药学组合 物，该组合物含有为眼睛投药而配制在药学可接受的赋形剂内的含有 编码热休克多肽(如Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40)的多 核苷酸的表达载体。在另一方面，本发明特载一种于眼睛组织聚集干细胞的药学组合物，该组合物含有为眼睛投药而配制在药学可接受的赋形剂内的多肽(如Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40)。在又另一方面，套组包括能在眼睛组织引发热休克的有效量试剂 (如多肽、多核苷酸或小分子化合物)，及使用该套组提高干细胞聚集 的说明指导。在不同的具体例中，该多肽是Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40。在另外的具体例中，该多核苷酸编码Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40。在其它具体例中，该小分子化合物选自由格 尔德霉素、雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素、EC102、 根赤壳菌素、二牛龙牛儿基丙酮(geranylgeranylacetone)、芍药苷、 PU-DZ8及H-71组成的群组。在另一方面，本发明特载一种识别于眼睛组织内提高干细胞聚集 的试剂的方法，该方法包括将一眼睛细胞与一测试化合物接触；相对 于未处理眼睛细胞，识别热休克多肽的表达或活性的提高，由此识别 提高干细胞聚集的化合物。在又一方面，本发明特载一种识别于眼睛组织内提高干细胞聚集 的试剂的方法，该方法包括将眼睛细胞与测试化合物接触；及识别该 组织内干细胞数目的增加。在任何以上方面的不同具体例中，该对象患有的眼睛疾病或失调 为选自糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼视网膜色素病 变、与年龄相关的黄斑退行性改变、青光眼、角膜营养不良、视网膜 先天性裂(retinoschises)、斯特格病变(Stargardt， s Disease)、 常染色体显形玻璃膜疣及贝斯特黄斑营养不良(Best' s macular dystrophy)、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、光损伤、缺血性视网膜病 变、炎症引发的视网膜病变、X伴性青年性视网膜先天性裂、青光眼、 莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢状视网 膜萎縮。在任何以上方面的其它具体例中，该试剂提高一种热休克蛋 白质的表达或生物活性，该热休克蛋白选自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40组成的群组。在其它具体例中，该刺激改变任一种或 更多种下述蛋白质的表达或活性，这些蛋白质为SDF-1 、 VEGF 、 HIF-1 a 、晶状球体蛋白、缺氧诱导因子1-a (HIF-la)及CXCR-4。在以 上方面的其它具体例中，该方法提高Hsp70或Hsp90多肽的表达为至少10倍或为至少40倍。在任何以上方面的其它具体例中，在热休克反应引发之前，向对象投用提高造血干细胞动员作用(如GM-CSF及/ 或SCF)的试剂。在任何以上方面的其它具体例中，该方法更进一歩包 括投用抗炎剂或抗血管生成剂。在其它具体例中，该方法更进一步包 括投用一试剂，其支持造血干细胞的存活，增生，或转分化 (transdifferentiation)。在任何以上方面的其它具体例中，该方法更进一步包括投用全反式维甲酸以增加干细胞转分化为视网膜色素上 皮细胞。在任何以上方面的其它具体例中，干细胞动员剂是巨噬细胞 集落剌激因子或千细胞因子。在任何以上方面的其它具体例中，热休 克的引发是使用阈下激光处理或使用试剂，其为小分子化合物、多肽， 或置于适当位置以于细胞内表达的核苷酸分子。在任何以上方面的其 它具体例中，该多肽是热休克多肽。在另一具体例中，该核苷酸编码 热休克多肽(如Hsp70或Hsp90)或编码治疗性多肽(如，抗炎多肽或 抗血管生成调节剂)。在任何以上方面的其它具体例中，该药学试剂是 选自格尔德霉素、雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素、 EC102、根赤壳菌素、二牛龙牛儿基丙酮(geranylgeranylacetone)、 芍药苷、PU-DZ8及H-71。在任何以上方面的不同具体例中，该试剂通 过玻璃体腔(intravitreal)或眼球后注射而投用。在任何以上方面的 其它具体例中，该投用引发RPE层的细胞修复。在任何以上方面的另 外其它具体例中，该方法进一步包括投用编码治疗性多肽的载体。在 任何以上方面的另外其它具体例中，该方法进一步包括向对象投用实 质上纯化的干细胞(如骨髓衍生细胞或造血干细胞)。在任何以上方面 的另外其它具体例中，该干细胞是通过局部地玻璃体腔或眼球后感染 而投用或是全身性地投用。本发明提供治疗多种眼睛疾病的方法。通过详细说明书与权利要 求本发明的其它特点与优势将属明显。定义「试剂」是指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽，或相 似体片段。「改变」是指通过如上文描述的标准习知技术所侦测的基因或多 肽的表达水平的变化(升高或降低)。如这里所使用的，改变包括表达水平的10%的变化，优选为25%的变化，更优选为40%的变化，及最优 选为50%或更大的表达水平变化。「改善」是指降低、抑制、削弱、消除、阻止、或稳定疾病的发 展(development)或进行(progression)。「相似体(analog)」是指具有参考性多肽或核酸分子功能的结构 相关多肽或核酸分子。「热休克蛋白质的生物活性」是指伴侣活性或干细胞聚集活性。「化合物」是指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽，或 其片段。在本揭示内容中，「包括」、「含有」及「具有」及其相似者的意义 可具有美国专利法中归属于它们的意义，可意指「包含」及其相似者； 「本质上由…所组成」与「本质上组成」其含义同样具有美国专利法 中归属于它们的意义且该术语为开放式的，以允许多于所述内容的出 现，只要其基本或新颖特性并未由其存在而改变，但排除先前技术的 具体例。「可侦测的标签(label)」是指一组合物，其结合于感兴趣的分子 并赋予后者可侦测性，该可侦测性是通过光谱、光化学、生物化学、 免疫化学或化学手段侦测。例如，有用的标签包括放射性同位素、磁 珠、金属珠、胶粒、萤光染料、电子密度试剂、酶(例如，通常使用 于ELISA者)，生物素、地高辛(Digoxigenin)或半抗原。「标记的(labeled)核酸或多肽」是指一种要么就共价地通过连接 子或化学键，不然就是非共价地通过离子键、范德华力、静电吸引、 疏水作用或氢键而与探针结合者，以使得可通过侦测标签结合至核酸 或探针的出现而可侦测核酸或探针的出现。「表达载体」是指由重组或合成产生的核酸结构(construct),其 具有一系列特定核酸元素，可使宿主细胞内特定基因发生转录。通常， 基因表达受到特定调节元素所控制，该调节元素包含组成型或诱导型 启动子、组织优先调节元素及增强子。「片段」是指多肽或核酸分子的一部分。该部分含有，优选为参 考核酸分子或多肽的完整长度的至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 600/0、 70%、 80%或90%。片段可含有10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900或1000个核苷酸 或氨基酸。「热休克」是指对于热应力(heat stress)的任何细胞反应。通常， 细胞透过提高热休克多肽(如Hsp70或90)的转录或翻译对热休克作 出反应。「热休克多肽」是指细胞对热应力做出反应所表达的任何多肽。 示范性的热休克多肽包括但不局限于，HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60 及Hsp40。基因库存取号(GenBankAccession No.) AAA02807提供了示 范性Hsp70氨基酸序列。基因库存取号P08238 ， NP 005339, NP 001017963及P07900提供了例式性Hsp90氨基酸序列样例。「热休克反应激活物」是指化合物，其提高热休克途径成分的伴 侣活性或表达。热休克途径成分包含但不局限于Hspl00、Hsp90、Hsp70、 Hsp60、 Hsp40及小HSP家族成员。引发热休克的试剂或治疗通常提高 Hsp70或Hsp90的至少其中之一的表达或活性。「造血干细胞」是指能够成为造血系统(hematopoietic lineage) 中一种或更多种分化的细胞的骨髓衍生细胞。「造血干细胞动员」是指增加可用于聚集至需要的治疗器官或组 织的骨髓细胞数量。「眼睛疾病或失调」是指影响眼睛正常功能的病变。「可操纵地连接」是指第一个多核苷酸被放在与第二个多核苷酸 相邻的位置，而当恰当的分子(如转录激活蛋白质)结合至第二多核 苷酸时，其第二个多核苷酸指示第一个多核苷酸转录。「多肽」是指不管链长或翻译后修饰的任何氨基酸链。「为表达而定位」是指本发明的多核苷酸(如DNA分子)是位于 与一种DNA序列相邻的位置，其指示该序列转录及翻译(如促进，例 如本发明的重组多肽，或RNA分子的生成)。「启动子」是指足以指示转录的多核苷酸。示范性启动子包含为 翻译起始位点上游(如，紧接上游)的长度为100、 250、 300、 400、 500、 750、 900、 1000、 1250及1500个核苷酸的核酸序列。「聚集」是指吸引并入至组织。「降低」或「提高」是指负向或正向改变，各自为至少10%、 25。/。、50%、 75%或100%。「使视网膜再生」是指增加视网膜或视网膜色素上皮细胞的数目、 存活或增生。「修复视网膜色素上皮损伤(damage)」是指改善视网膜色素上皮 伤害(injury)、损伤或细胞死亡。「干细胞」是指能生成一种或更多种分化细胞类型的祖细胞。「对象」是指哺乳动物，包含但不局限于，人类或非人类哺乳动 物，如牛科动物、马科动物、犬科动物、绵羊或猫科动物。「阈下激光」是指一种激光治疗，其引发于治疗过程中或之后在 视网膜内的不可侦测或勉强可侦测的损害(lesion)。当少量或没有术 中可见组织反应出现，或当少量或是没有细胞由于机光治疗而死亡(如 于处理过的组织中少于10°/。、 5%、 2. 5%或1%的细胞死亡或凋亡)则损害 为不可侦测。如本文所使用的，术语「治疗」、「治疗法」及其相似者是指降低 或改善失调及/或与其相关征状。尽管并未排除，但是治疗失调或状况 (condition)并不要求该失调、状况或与其相关征状被完全地消除。如同本文所使用的，术语「预防」，「预防疾病治疗」及其相似者 是指降低在并未患有，但存在发展失调或状况的风险或易受影响而发 展失调或状况的对象发展失调或状况的可能性。 「参考」是指标准或控制状况。「转分化」是指改变细胞，以使其表达至少一种特性上由另一个 不同类型细胞所表达的多肽。 图示简要说明

图1显示一系列眼睛组织载片。图1中黑色区域表示GFP+细胞，其 已并入于RPE层内接收到激光的区域。通过对侧(未影响)的眼睛所决 定的值，移除背景萤光。图2显示定量并入于视网膜色素上皮(RPE)的造血干细胞(HSC) 的图表。图3显示得自接受眼球下GFP+HSC注射及使用格尔德霉素衍生物 D28或H71而药学上引发热休克的组合的老鼠的眼睛组织载片；接受 HSP70多肽注射的一系列面板图。发明详细说明本发明特载适用于治疗或预防眼睛疾病的组合物或方法。本发明 至少部分基于发现激光或药学上引发视网膜色素上皮层与脉络膜内的热休克所引起的造血千细胞聚集于RPE，其中该造血干细胞转分化为表 达视网膜色素上皮细胞特异标记的细胞。为了不被理论束缚，此归路 (homing)反应是至少部分归因于热休克反应的活化。如下文详细叙述，视网膜色素上皮及脉络膜的低于可见阈下激光 刺激是用来将HSC聚集至RPE层。GFP标记的HSC的过继转移及GFP 嵌合动物用于证实HSC细胞可迁移至RPE层。SVL引发热休克蛋白质的 表达，及后续HSC吸引因子(chemoattractants)基质细胞衍生因子 (SDF-1)及VEGF的表达。可通过于玻璃体内投用化学引发热休克反 应的化合物来再现激光引发效果。聚集的HSC获得成熟RPE细胞的形 态特征，并表达RPE特异性蛋白质。从而，本发明提供治疗患有眼睛 疾病的对象的方法，其中该眼睛疾病如糖尿病视网膜病变、脉络膜新 生血管化、青光眼视网膜色素病变、与年龄相关的黄斑退行性改变、 青光眼、角膜营养不良、视网膜先天性裂(retinoschises)、斯特格病 变(Stargardt' s Disease)、常染色体显形玻璃膜疣及贝斯特黄斑营 养不良(Best' s macular dystrophy)、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、 光损伤、缺血性视网膜病变、炎症引发的视网膜病变、X伴性青年性视 网膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(MalattiaLeventinese， ML)及多恩蜂巢状视网膜萎缩。 造血干细胞造血干细胞是骨髓衍生细胞，以其修复潜力及可塑性而扮演为人 所知的内生性来源。骨髓衍生造血干细胞(HSC)能修复受损组织，包 括心脏、肝脏、大脑、肌肉及肾脏。如同本文所述，造血干细胞亦可 用于修复视网膜。视网膜的阈下激光(STL)刺激会引发HSC聚集，其 后续会转分化为RPE样细胞。为了不被理论束缚，此过程至少部分通 过包括趋化因子的分子作用而受中介(mediated)，该趋化因子如基质 衍生生长因子-l (SDF-1)及趋化因子受体，如SDF-l受体(CXCR-4)， 其可通过阈下激光活化。干细胞聚集于受伤害区域而产生受伤害组织的修复。若想要的话， 出现在对象的循环中的造血干细胞数目可在热休克弓1发之前、期间或 之后增加。在一个具体例中，造血干细胞数目的增加是通过动员对象 骨髓内出现的造血千细胞实现，该动员是通过投用任一种或更多种的巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)、 IL-8、 SDF-1 (基 质衍生因子)、白介素-l(IL-1)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、 白介素-7 (IL-7)、白介素-8 (IL-8)、白介素-ll (IL-ll)、白介素-12 (IL-12)及NIP-la、干细胞因子(SCF)、样酪氨酸激酶3 (fit-3)、 转化生长因子e (TGF-e )、早期作用造血因子，描述于，如W091/05795， 及血小板生成素(Tpo)、 FLK-2配体、FLT-2配体、Epo、抑瘤素 (Oncostatin M)及MCSF。 SDF-1是一种有效引发干细胞聚集的细胞因 子。SDF-1是由处于压力的R PE细胞所表达。G-CSF及/或SDF-1的投用 将增加外周血液中HSC的数目，并可能增强后续HSC向视网膜及RPE层的 聚集。优选地，本发明的造血干细胞不能表达或降低水平地表达任一 种或更多种的下列标记Lin—、 CD2一、 CD3_、 CD7—、 CD8一、 CD10-、 CD14—、 CD15_、 CD16-、 CD19一、 CD20一、 CD33—、 CD38—、 CD71-、 HLA-DR—及糖蛋白 A_。眼科激光眼科激光是一种治疗多种视网膜失调的重要的工具，其通常用于 产生激光引发的光化学灼伤。相比下，据信，由于能量能为RPE所吸 收，二极体810纳米(nanometer)激光对于神经感觉视网膜造成较少的 损伤。本发明提供应用阈下激光以动员造血干细胞及将其聚集至视网 膜色素上皮层的方法。在本方法中，所使用的红外(810nm)激光为微 脉冲模式以治疗视网膜失调。通过在单一次的曝光中使用重复地且短 暂的激光脉冲，其限制了热传导量及随即的RPE损伤。在一种方法中， 对激光的投用作控制以降低或消除光热损伤，例如，对激光治疗作控 制以降低或消除术中可见的组织反应(如激光凝固坏死)及或晚期细 胞死亡(凋亡)。在其它例子中，对非致命热伤和的阈值作控制以降低 或消除术中可见的组织反应、降低或消除晚期细胞死亡及出现稳定的 正HSC的聚集。优选地，相对于接受常规激光治疗的病人，该光热损 伤降低至少10%、 25%或30%;更优选，光热损伤降低至少50%、 75%、85%、 95%100%。更优选，基本上保持了病人的视锐度(如保持于或接近病人目前视锐度的水平)。使用阈下激光引发热休克的方法包括，例如，投用40-50良好间 隔的810nm激光点的格网图案，其点直径为5um、 10um、 35um或50um。可变化其强度及供给形式以降低或消除光热损伤。例如，可使用连续 波(cw)供给模式；微脉冲(mP)供给模式(如使用20%、 15%、 10% 及5%工作期)；或长脉冲供给模式。在特定具体例中，本方法特载应用具有波长自至少约100nm至 2000nm的阈下激光，其中阈下激光能量是至少约10mW至100mW(如10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或100)。激光应用为期至少0. 001、 0.005、 0.1、 0. 2或l.Omsec。在其它具体例中，10mW用于0. lmsec 脉冲，或100mW用于0. lmsec脉冲。适于激光治疗的眼睛组织包括脉络膜、视网膜色素上皮或任何其 它欲以干细胞修复组织损伤的眼睛组织。当本文描述关于使用激光引 发热休克的特定例子时，熟习本领域技术者可理解本发明并非如此局 限的。实质上任何能在至少眼睛组织的一个细胞引发热休克反应的能 量供给方法可被使用。这类方法包括，可使用例如，使用辐射的刺激、 跨瞳热像法或具有足够刺激干细胞聚集的量的任何其它形式的能量， 如光能。在不同具体例中，足够聚集干细胞的激光刺激是指光束或具 有波长从约100nm至2000nm的光子。通常该波长是介于约500nm至约 900nm。热休克反应活化物热休克反应活化物包含在细胞内引发热休克反应的试剂(如小分 子化合物、多肽及核酸分子)。这类试剂提高，例如热休克蛋白质的表 达或生物活性，该蛋白质如HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60、 Hsp40及 小HSP家族成员。更优选，该试剂提高Hsp90或Hsp70的表达或生物 活性。热休克蛋白质90 (Hsp90)是一种涉及细胞传信、增生及存活的 伴侣分子，且其在许多蛋白质的结构稳定性及功能上是必要的。Hsp90 的调节物对于本发明为有用的，这类调节物提高Hsp90的表达或生物 活性。Hsp90的调节物包含苯醌安莎霉素抗生素，如格尔德霉素及17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)，其特异性地结合Hsp90，并改变其功能。其它HsP90的调节物包含但不局限于根赤壳菌素、新生霉素(novobiotin)及任何结合于Hsp90 ATP/ADP袋(pocket)的Hsp90 抑制剂。其它引发热休克的试剂包含但不局限于格尔德霉素(InvivoGen， San Diego， California; Chang et al. ， J Cell Biochem. 2006 Jan 1; 97(1): 156-65)、雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德 霉素(InvivoGen， San Diego, California)、 EC102、根赤壳菌素(Chang et al.， J Cell Biochem. 2006 Jan 1; 97(1): 156-65)、 二牛龙牛 儿基丙酉同(Eisai， Tokyo, Japan)、苟药昔(Axxora， San Diego， CA)、 PU-DZ8及H-71 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) 及任何这些化合物的相似物或类似物。雷公藤红素是一种苯醌甲基三 萜，其活化人类热休克反应。雷公藤红素与其它热休克反应活化物适 用于治疗眼睛疾病。热休克反应活化物包含但不局限于雷公藤红素、 雷公藤红素甲酯、二醋酸二氢雷公藤红素(dihydrocelastrol diacetate)、雷公藤红素丁酯、二氢雷公藤红素及它们的盐或相似物。眼睛疾病本发明可用于治疗眼睛疾病，其包含增生前期视网膜病变，糖尿 病视网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼、视网膜色素病变、与年 龄相关的黄斑退行性改变、角膜营养不良、视网膜先天性裂 (retinoschises)、其万特格病变(Stargardt， s Disease)、常染色体 显形玻璃膜疣及贝斯特黄斑营养不良(Best' s macular dystrophy)。特别地，本发明提供关于增生性糖尿病视网膜病变与脉络膜新生 血管化的新生血管化的治疗。第I型糖尿病伴随患增生性糖尿病视网 膜病变的高风险(Jacobsen， N. et al. ， 2003 Ugeskr Laeger 165: 2953-6)。长期处于糖尿病背景通常导致增生前期视网膜病变。增生前 期视网膜病变伴随病灶区域的缺血。被普遍接受的观点为新生血管化 伴随着连同降低的抗血管生成因子的表达，如内皮抑制素及色素上皮 衍生因子(PEDF) (F,tsu， H. ， et al. 2003 Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 1042-7; Noma, H. ， et al. 2002 Arch Ophthalmol 120: 1075-80; Dawson, D. W. et al. ， 1999 Science 285: 245-8; Spranger， J. ， et al" 2001 Diabetes 50: 2641-5; Holekamp， N. M. et al 2002 Am JOphthalmol 134: 220-7; Boehm， B. 0., et al. 2003 Horm Metab Res 35: 382-6)的促血管生成因子的表达的增加，如内皮生长因子(VEGF)。 促血管生成因子与抗血管生成因子间平衡的变化引起新生血管化 (neovascularization)并弓l发毛细血管渗漏(Funatsu， H. ， et. al. 2002 Am J Ophthalmol 133: 70—7; Caldwell, R. B. ， et al. 2003 Diabetes Metab Res Rev 19: 442_55; Antcliff， R.J. et al.， 1999 Semin Ophthalmol 14: 223-32)。数年后，患有增生前期视网膜病变 的病人遭受视网膜病变，其特征为视网膜毛细血管的大范围损失及棉 絮斑，并随后发展新血管，其从视网膜生长入正常无血管的玻璃体。 该脆弱的血管易渗漏，会造成黄斑水肿及视力模糊。这些非正常血管 的易断裂，破损可导致立即的视力损失。若允许生长，新生血管化可形成致盲维管膜并造成视网膜剥离。 目前可行的治疗方案中，对增生性糖尿病视网膜病变的治疗是在这个 病症的增生阶段通过放置栅激光灼烧视网膜。此破坏性的治疗引起大 量视力损失。在患有糖尿病20年后，33%年轻成人接受这类激光治疗， 且伴随视锐度及视角的降低(Kokkonen， J. et al. ， 1994 Acta Paediatr 83: 273_8; Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group 1991 Ophthalmology 98: 766-85; Davies， R 1999 Eye 13 ( Pt4) : 531-6; Dosso， A.A. et al. 2000 Diabetes Care 23: 1855)。可利用本发明的方法治疗的另一种状况是脉络膜新生血管化。例 如伴随与年龄相关的黄斑退行性改变的严重视力损失是归因于脉络膜 新生血管化。在非正常脉络膜新生血管化中，新血管从脉络膜生长入 视网膜下空间。存在脉络膜新生血管化高风险的视网膜通过出现多重 或大且软的玻璃疣、网状玻璃疣及/或色素变化的存在而被识别 (Macular Photocoagulation Study Group 1997， Arch Ophthalmol 115:741-7; Arnold, J.J. et al. 1995 Retina 15: 183—91)。 VEGF 是缺氧调节蛋白质，其伴随脉络膜新生血管化(Frank, R.N. et al.， 1996 Am J Ophthalmol 122: 393-403; Ishibashi， T. et al. ， 1997 Arch Clin Exp Ophthalmol 235: 159-67; Kwak， N. et al. 2000 Invest Ophthalmol Vis Sci 41: 3158—64)。视网膜变性是另一种可使用本发明的方法治疗改善的状况。视网 膜变性疾病包含为视网膜神经元伤害或视网膜神经元细胞死亡的疾 病。视网膜神经元包含但不局限于光受体及视网膜神经节细胞。视网 膜变性疾病包含遗传、后天及炎症引发的视网膜变性疾病。遗传的视 网膜变性疾病包含例如，所有形式的黄斑退行性改变(如，干性及渗 出性的与年龄相关的黄斑退行性改变)、斯特格病变、贝斯特病、青光 眼、视网膜色素病变及视神经变性。后天的视网膜变性疾病包含那些 伴随黄斑囊样水肿、视网膜剥离、光损伤、由静脉或动脉闭塞或其它 血管疾病引起的缺血性视网膜病变、由眼睛外伤，手术或穿透损害所 引起的视网膜病及外周玻璃体视网膜病变的疾病。炎症引发的视网膜 病变包含哪些伴随由病毒、细菌及毒性所引发的视网膜变性，及/或眼 色素层炎的疾病，及那些导致视祌经炎的疾病。其它使用本发明的方法治疗的疾病或失调包含X伴性青年性视网 膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(ML)、多恩蜂巢状视网膜萎縮(D服D)及角膜营养不良。本发明亦提供预防视网膜神经元的细胞损伤的方法，包含伴随术 后外伤及后续在保护形式下暴露于伤害性亮光的幷发症。筛选试验如同本文所讨论的，引发热休克或聚集干细胞至视网膜色素上皮 的化合物对于本发明的方法是有用的。可使用许多方法进行筛选试验以识别这类化合物。在一种方法中，对细胞内HSP多肽或核酸分子的表 达作监测(如，眼睛细胞，如活体内或活体外脉络膜或视网膜色素上 皮的细胞)；将该细胞与测试化合物相接触；及使用本领域已知或如同 本文所述的方法来试验化合物于HSP多肽或核酸分子表达的效果。 一种 化合物其提高所接触细胞相对于未与化合物接触的控制细胞的HSP多 肽或核酸分子的表达，则视为适用于本发明的方法。另外，进行化合 物筛选以识别出那些提高干细胞聚集至视网膜的化合物。在一个具体 例中，干细胞聚集是在被局部或全身注射表达GFP+的干细胞的嵌合老鼠 内进行试验。GFP+细胞的出现与否，例如，通过使用萤光显微镜检测视 网膜平面载片而试验。干细胞聚集至视网膜的化合物对本发明是有用 的。在其它具体例中，这些细胞的存活或分化是使用细胞特异性标记而试验。在相关方法中，筛选是在11-顺式-视黄醛、9-顺式-视黄醛或 其相似物或衍生物存在下进行。适用的化合物提高聚集至视网膜的干细胞数目为至少10%、 15%或20%或优选为25%、 50%或75%;或最优选 为至少100%。若需要的话，已识别化合物的功效会在患有眼睛疾病(如眼视网 膜色素病变的动物模型)或患有糖尿病的动物模型内试验。 测试化合物及萃取物通常，能在引发细胞的热休克反应或提高干细胞向眼睛组织聚集 的化合物是根据本领域己知方法从天然产物或合成(或半合成)萃取 物的大型文库或化学文库中被确认。熟习药物发现及发展领域技术者 将可理解测试萃取物或化合物的确切来源并非本发明的筛选步骤的关 键。因此，实质上任何化学萃取物或化合物可通过如同本文所述的方 法而筛选。这类萃取物或化合物的例子包含但不局限于植物性、真菌 性、原生性或动物性基础的萃取物、发酵液及合成化合物，也包含现 存化合物的修饰形式。多种方法亦可用于产生任何化学化合物的随机 性或针对性的合成(如，半合成或全部合成)，该化学化合物包含但不 局限于以糖、脂、肽及核酸为基础的化合物。合成化合物文库可购自 Brandon Associates (Merrimack, N. H.) 及 Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis)。另外，以细菌、真菌、植物及动物萃取物形式存 在的天然化合物文库可自数个来源购得，包含Biotics (Sussex, UK)、 Xenova (Slough， UK) 、 Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.)及PharmaMar， USA (Cambridge, Mass.)。另夕卜，若需 要的话，可依照本领域已知方法产生天然及合成产生的文库，如，通 过标准萃取及分级(fractionation)方法。更进一步，如果需要的话， 任何文库或化合物可使用标准化学、物理或生化方法而立即修饰。另外，可于每当需要时使用那些熟习药物发现及发展领域技术者 可立即理解去冗余方法(如分类学去冗余、生物去冗余及化学去冗余 或其任意组合)或对已知它们在聚集干细胞或引发热休克活性的物质 的复写或副本的消除法。若发现粗萃取物可聚集干细胞或引发热休克，更进一步正向萃取 的分级是有必要地，以分离引起观测到作用的化学成分。因此，萃取、分级及纯化过程的目的在于对粗萃取物中引发热休克或干细胞聚集的 化学实体仔细特性化及识别。这类异质萃取物的分级与纯化的方法为 本领域己知。若有需要的话，表明适用于任何需要修复或使眼睛组织 再生的眼睛病变的治疗的化合物可依照本领域已知方法而经化学修 饰。药学组合物本发明特载药学制备物，其包括可在眼睛组织与药学上可接受的载体一起引发或复制热休克(如，通过提高Hsp70或Hsp90表达或活 性)的试剂。这类制备物包含同时具有治疗与预防应用的多肽、多核 苷酸或小分子化合物。适用于如同本文所述的方法的试剂包含那些提 高Hsp90多肽或HSP70的表达或生物活性的试剂，或是那些另外在眼 睛组织引发热休克反应从而聚集干细胞至组织的试剂。若需要的话， 本发明的组合物是与增加存在于对象循环中造血干细胞数目的试剂共 同配方，例如，通过动员存在于对象骨髓内的造血干细胞。提高干细胞的动员作用或聚集的试剂包含但不局限于抑制生长药 物及G-CSF或GM-CSF、白介素-1 (IL-1)、白介素-3 (IL-3)、白介素 -6 (IL-6)、白介素-7 (IL-7)、白介素-8 (IL-8)、白介素-ll (IL-11)、 白介素-12 (IL-12)及NIP-la 、干细胞因子(SCF)、类鱼酪氨酸激酶 -3 (fit-3)、转化生长因子P (TGF-P)、早期作用造血因子，描述于 如W091/05795、及血小板生成素(Tpo)、 FLK-2配体、Epo、抑瘤素、 及MCSF。若想要的话，本发明的组合物可与增强干细胞转分化为视网膜色 素上皮细胞的化合物共同配方。这类化合物包含反式视黄酸、11-顺式 -视黄醛或9-顺式-视黄醛。本发明的化合物可作为药学组合物的一部分投用。该组合物应为 无菌且含有治疗有效量的本发明的试剂，该组合物为合适投药于对象 的重量或体积单元。本发明的多个组合物及组合可为药学包装的一部 分，其中每一化合物以单独剂量存在。本发明用于预防或治疗投用的药学组合物应为无菌的。无菌可轻 易地通过以无菌过滤膜(如，0.2um膜)过滤、通过Y放射或任何为 熟习本领域技术者所知的适当方法而实现。治疗性多肽组合物通常被放入含有无菌进出口的容器内，如，静脉溶液袋，或是具有可由皮下 注射针头刺穿的塞子的小瓶。这些组合物一般被储存于单剂或多重剂 量的容器内，如密封的针剂或小瓶，为水溶液或干冻配方的重建物。化合物可选择性地与药学上可接受的赋形剂组合。如同本文所使 用的的术语「药学上可接受的赋形剂」是指一种或更多种适合于投用 人体的可相容固体或液体填充物、稀释物或胶囊物质。赋形剂优选含 有少量添加剂，如增强等渗性及化学稳定性的物质。这类物质在使用 剂量与浓度上对于接受者是无毒且包含缓冲溶液如磷酸盐、柠檬酸盐、 琥珀酸盐、醋酸盐、乳酸盐、酒石酸盐及其它有机酸或它们的盐；三 羟甲基氨基甲烷(TRIS)、重碳酸盐、碳酸盐及其它有机酸或它们的盐； 抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(如少于约10残基)多肽，如、聚 精氨酸、聚赖氨酸聚谷氨酸盐及聚天冬氨酸；蛋白质，如血清白蛋白、 明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合体、如聚乙烯吡咯垸酮(PVP)、聚丙 二醇(PPG)、及聚乙二醇(PEG);氨基酸、如氨基乙酸、谷氨酸、天 冬氨酸、组氨酸、赖氨酸、或精氨酸；单糖、双糖、及其它碳水化合 物包含纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精或硫酸化碳 水化合物衍生物、如肝磷脂、硫酸软骨素或硫酸右旋糖苷；多价金属 离子、如二价金属，例子包含钙离子、镁离子及锰离子；螯合剂、如 乙二胺四乙酸(EDTA);糖醇、如甘露醇或山梨糖醇；反离子(Coimterions)，如钠或铵；及/或非离子表面活性剂、如聚山梨醇酯 或白洛沙姆(poloxamers)。其它添加剂亦可被包含，如稳定剂、抗菌 剂、惰性气体、液体或营养补充物(如、林格式右旋糖(Ringer's dextrose))、电解质补充物及其相似物，其皆以常规量存在。如上文所述的组合物，能以有效量投用。该有效量将取决于投用 模式、欲治疗的特定状况及所需结果。其亦可取决于对象的状况阶段、 对象的年龄及生理状况、共同治疗的性质(如果有的话)及其为医药人 员所知的相似因素。作为治疗应用，其是能够达到医药上所需结果的对于具有眼睛疾病或失调的对象，有效量是指足够在眼睛组织的 至少一个细胞内引发热休克、足够吸引至少一个干细胞至该组织或足 够以稳定、减缓或降低伴随着眼睛病症的征状。通常，本发明的化合物剂量是自约每天0. Olmg/kg至约每天1000mg/kg。预期剂量范围为自 约50至约2000mg/kg将合适。某些形式的投药，如静脉注射将导致较 低剂量。若初始应用剂量于对象的反应为不足够，可在病人容忍性允 许的范围内使用更高剂量(或通过不同或更局部给药路线的更高有效 剂量)。每天的多重剂量是预计达到本发明组合物的适当的全身水平。多种投药路径是可用的。通常来说，本发明的方法可使用任何医 药上可接受的投药模式进行实践，意指任何产生活性化合物的有效水 平而不引起临床上不可接受副作用的模式。在一个较佳具体例中，本 发明的组合物为眼内投药。其它投药模式包含口腔、直肠、局部、眼 内、口部(buccal)、阴道内、脑池内、侧脑室内、气管内、鼻内、透 皮、移植内/上、或肠胃外的路线。术语「肠胃外」包含皮下、脊管内、 静脉内，肌肉内、腹膜内、或灌输。包括本发明一种组合物的多种组 合物可被加入生理液内，如至玻璃体液中。因为病人的方便性及用药 计划，预防治疗优选使用口腔投药。本发明的药学组合物可选择性地更进一步含有一种或更多种想要 的额外的蛋白质。合适的蛋白质或生物物质可通过本领域已知且可用 的纯化技术而得自人类或哺乳动物血浆；得自含有己依照标准重组DNA 技术引入的表达人类或哺乳动物蛋白质的基因的重组组织培养、病毒、 酵母、细菌或其相似物的上清液、萃取物或溶解物；或得自人类生物 液(如，血液、？L、淋巴、尿液或其相似物)或得自含有已依照标准 转基因技术引入并表达人类蛋白质的基因的转基因动物。本发明的药学组合物可活一种或更多种pH缓冲化合物以保持配方 的pH在一个预定水平，该预定水平反应生理pH，如在约5. 0至约8. 0 的范围内。用于水性液体配方的该pH缓冲化合物可为氨基酸或氨基酸 混合物，如组氨酸或氨基酸混合物，如组氨酸或氨基乙酸。另外，该 pH缓冲化合物优选是保持该配方pH于一个预定水平的试剂，如在约 5.0至约8.0的范围内，且其并不螯合钙离子。这类pH缓冲化合物的 示范性例子包含但不局限于，咪唑及醋酸盐离子。该pH缓冲化合物可 以任何合适量存在以保持该配方pH于一个预定水平。本发明的药学组合物亦可包括一种或更多种调节渗透试剂，如， 调节配方渗透性质(如张力、渗透性及/或渗透压)至接受个体血液流及血液细胞可接受的一个水平的化合物。该渗透调节剂可为不螯合钙 离子的试剂。给渗透调节试剂可为任何熟习本领域技术者所知与可用 且调节配方的渗透性质的化合物。熟习本领域技术者可凭借经验决定 一种给定渗透调节剂是否用于本发明配方的适合度。合适的渗透调节 剂类型的示范性例子包含但不局限于盐，如氯化钠及醋酸钠；糖， 如蔗糖、右旋糖及甘露醇；氨基酸，如氨基乙酸；及一种或更多种这 些试剂及/或试剂类型的混合物。该渗透调节剂可以任何足够调节配方 渗透性质的浓度存在。包括本发明的一种化合物的组合物可含有多价金属离子，如钙离 子、镁离子及/或锰离子。可使用任何有助于稳定该组合物并不引起接 受个体副作用的多价金属。熟习本领域技术者基于这二种标准可凭借 经验决定合适的金属离子，且这类金属离子的来源为已知并包含有机 与无机盐。本发明的药学上组合物亦可为一非水性配方。可使用任何合适的 非水性液体，假如其提供内含活性剂的稳定性。优选地，非水性液体 是亲水性液体。合适的非水性液体的示范性例子包含甘油；二甲基 亚砜(DMS0);聚二甲基硅烷(PMS);乙二醇，如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(「PEG」)200、 PEG300及PEG400;及丙二醇，如 二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(「PEG」)425、 PPG725、PPG1000、PPG2000、 PPG3000及PPG4000.本发明的药学组合物亦可为混合的水性/非水性液体配方。任何合 适的非水性配方，例如如上所述者，可与任何上述水性液体配方，例 如如上所述者， 一起使用，假如混合的水性/非水性液体配方提供其内 所包含的化合物的稳定性。优选地，在这类配方中非水性液体是亲水 性液体。适当的非水性液示范性例子包含甘油；DMS0; PMS;乙二醇， 如PEG 200、PEG300及PEG400;及丙二醇，如PPG 425、PPG725、PPG1000、 PPG2000、 PPG3000及PPG4000.合适的稳定配方可允许活性剂以冰冻或未冰冻状态储存。稳定的 液体配方储存于至少为-7(TC的温度，但亦可储存于较高温度为至少 0°C，或介于约O. rc与约42'c，其取决于组合物的性质。熟习本领域 技术者一般皆知蛋白质与多肽对于PH、温度及可影响疗效的其它多种因素的变化敏感。其它给药系统可包含时间释放、延迟释放或缓释给药系统。这类 系统可避免本发明的组合物的重复投用，增加对象及医生的方便性。 多种类型的释药系统已为熟习本领域技术者所使用且知晓。它们包含 基于聚合体的系统，如聚乳酸(美国专利第3， 773， 919号；欧洲专利第58， 481号)聚(乳酸-乙交酯)、共聚草酸盐(c叩olyoxalates)、 聚己内酉旨(polycaprolactones) 、 F菱酉旨酉先月安(polyesteramides)、萝《原 酸酯(polyorthoesters)、聚羟基丁酸，如聚-D (-) -3-羟基丁酸(欧洲 专利第133， 988号)、L-谷氨酸酸与Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚体 (Sidman， K. R. et al. ， Biopolymers 22: 547—556)、聚(2-羟基乙 基丙烯酸甲酯)或乙烯醋酸乙烯酯(Langer， R. et al. ， J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277; Langer， R. Chem. Tech. 12: 98-105)及 聚酸酐。其它缓释组合物包含以物件形式成型的半渗透聚合体基材，如膜或微胶囊。给药系统亦包含非聚合体系统，它们为包含固醇的脂， 如胆固醇、胆固醇酯及脂肪酸或中性脂肪，如单、双及三甘油酯；水 凝胶释放系统如生物来源的生物可再吸收水凝胶(也就是，甲壳素水 凝胶或壳聚糖水凝胶)；硅橡胶(sylastic)系统；以肽为基础系统；腊 覆盖；使用常规黏截剂与赋形剂的压縮药片；部分熔合的植入；及其 相似物。特定例包含但不局限于(a)侵蚀系统，其中试剂以一种形式 包括于基材内，例如那些描述于美国专利第4.452. 775、 4， 667， 014、 4， 748， 034及5， 239， 660号者及(b)扩散系统，其中活性成分从聚 合体以经控制的速率渗透出，如描述于美国专利第3， 832， 253，及3， 854， 480号.另一类可与本发明的组合物及方法一起使用的给药系统是胶体分 散系统。胶体分散系统包含以脂质为基础的系统其包含水中油乳剂 (emulsion)、胶束(micelles)、混合胶束及脂质体。脂质体是人工膜 管，其用于作为活体外或活体内给药载体。单层大微脂粒(LUV)，其 大小范围从0.2-0.4um，可将大的高分子封于水性内部，并可以生物上 活性开》式而运送给细胞(Fraley， R.，及Papahadjopoulos， D. ， Trends Biochem. Sci. 6: 77—80)。脂质体可通过将其与特异性配体如单株抗体、糖、糖脂或蛋白质结合而定位至特定组织。脂质体可购自GibcoBRL，例如LIPOFECHNTM及 LIPOFECTACET"，其由阳离子脂质如N-[1- (2， 3 二油基氧基) -丙 基]-N，N，N-三甲基氯胺(DOTMA)及二甲基双十八烷基溴铵(DDAB)所 形成。制备脂质体的方法是本领域已知，并己描述于许多刊物如DE3， 218， 121; Epstein et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1985) ; Hwang eal.， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP88，046; EP143'949; EP 142,641; 日本专利申请第83-118008号；美国专利第4， 485， 045及4， 544， 545号;及EP102， 324。脂质体亦已由Gregoriadis， G. ， Trends Biotechnol.， 3: 235-241)回顾。另一种类型的载体是生物上可兼容的微颗粒或适合移植如哺乳动 物接受者的植入物。根据本方法的适用的示范性生物可侵蚀性植入物 已记述于PCT国际申请第PCT/US/03307号(公开号W095/24929,标题 为「Polymeric Gene Delivery System」)。PCT/US/0307描述了生物可 兼容的，优选为生物可降解的聚合基材，其用来容纳在合适的启动子 控制下的外生性基因。该聚合基材可用于达到在对象中缓释该外生性 基因或基因产物。聚合基材优选是以微颗粒形式存在，如微球(其中试剂分散通过 固体聚合基材)或微胶囊(其中试剂储存于聚合壳芯内)。上述含有药 物的聚合体的微胶囊已描述于，例如，美国专利第5， 075， 109号。其 它用来容纳试剂的聚合基材形式包含膜覆盖(coating)、凝胶、植入物 及支架(stwnt)。对聚合基材装置的大小与组成作选择以有利于在基材 引入处组织的释放动力学根据所使用的给药方式进一步对聚合基材的 大小作选择。优选地，当使用浮质路径(aerosol route),聚合基材与 组合物是包围于表面活性载体内。可选择聚合基材组合物使其兼具有 促进降解率及形成物质，其为生物可粘合的，以更进一步提高转移效 果。亦可选择基材组合物为不降解，而是在一段时间内通过扩散释放。 给药系统亦可为适于局部，位点特异给药的生物上可兼容的微球。这 类微球是揭露于Chickering， D. E. ， et al. ， Biotechnol. Bioeng. 52: 96-101; Mathiowitz， E. ， et al. ， Nature 386: 410-414。非生物可降解的及生物可降解的聚合基材皆可用于将本发明的组合物给药(deliver)至对象。这类聚合体可为天然或合成聚合体。聚合体的选择是基于一段时间，希望其经过这段时间才释放， 一般为几 小时至一年或更长而被。通常，最为理想的释放时间范围介于数小时 与三至十二个月间。该聚合体可选择地以水明胶形式存在，其可在水中吸收高达约其重量的90%的重量，及更进一步，可选择地，与多价离 子或其它聚合体交联。可用于形成生物上可降解给药系统的合成聚合体的示范性例子包 含聚酰胺、聚碳酸酯、聚伸乙基(polyalkylene)、聚乙二醇聚烯烃氧 化物、聚对苯二酸烯烃酯(polyalkylene ter印thalates)、聚乙烯醇、 聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯酮垸、聚乙交酯、 聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、垸基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素 醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸与甲基丙烯酸酯聚合体、甲基纤 维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基 纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲 酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、聚(甲 基丙烯酸甲酯)、聚(乙基丙烯酸甲酯)、聚(丁基丙烯酸甲酯)、聚(异 丁基丙烯酸甲酯)、聚(己基丙烯酸甲酯)、聚(异癸基丙烯酸甲酯)、 聚(月桂醇丙烯酸甲酯)、聚(苯基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、 聚(异丙基丙烯酸酯)、聚(异丁基丙烯酸酯)、聚(十八垸基丙烯酸 酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚对苯二甲酸 乙二酯、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯 吡咯酮垸、及乳酸及乙醇酸的聚合体、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁 酸)、聚(戊酸)、及聚(乳酸-共己内酯)、及天然聚合体如藻酸盐及 其它多糖，包含右旋糖酐及纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物(取代 物、化学基团加成、如垸基、烯烃、羟基化、氧化、及熟习本领域技 术者常规使用的其它修饰)、白蛋白及其它亲水性蛋白、玉米蛋白、及 其它醇溶谷蛋白及疏水性蛋白、共聚体及其混合物。 一般来说，这些 材质通过表面或分散侵蚀而在酶水解作用或是于活体内暴露于水而遭 降解。眼睛给药方法本发明的组合物通常于给药至眼睛以治疗眼睛疾病(如糖尿病视 网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼视网膜色素病变、与年龄相关 的黄斑退行性改变、青光眼、角膜营养不良、视网膜先天性裂(retinoschises)、斯特格病变(Stargardt， s Disease)、常染色体 显形玻璃膜疣及贝斯特黄斑营养不良(Best， s macular dystrophy)、 黄斑囊样水肿、视网膜脱离、光损伤、缺血性视网膜病变、炎症引发 的视网膜病变、X伴性青年性视网膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分 提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢状视网膜萎缩)。在一 个具体例中，本发明的组合物通过适于直接植入眼睛玻璃体的眼睛装 置而投用。本发明的组合物可提供为缓释(sustained release)组合物， 如描述于美国专利第5， 672， 659及5， 595， 760号的那些。这类装 置的发现是为了提供多种组合物的控制缓释以治疗眼睛，而没有局部 及全身伤害的风险。本发明眼睛给药方法的一个目的为最大化在眼内 装置含有药物量或植入物，并最小化其尺寸，由此延长植入的持续时 间。参阅，如美国专利第5， 378, 475、 6， 375， 972及6， 756， 058 号及美国公开本第20050096290及200501269448号。这类植入物可 为生物可降解的及/或生物可兼容的植入物，或可为非生物可降解的植 入物。生物可降解的眼睛植入物已描述于，例如，美国专利公开本第 20050048099号。植入物对活性试剂可为可渗透或不渗透，及可嵌入眼 睛腔室内，如前方或后方腔室或可植入于巩膜、跨脉络膜空间，或玻 璃体外无血管区域。另外，作为本发明组合物的储存库的隐形镜片， 亦可用于药物给药。在一个较优选具体例中，植入物可置于无血管区域上，如在巩膜 上，以使药物跨越巩膜扩散至治疗所需位置，如眼内空间及眼睛黄斑。 侵入式跨巩膜给药最低限度可用于给药有效剂量的活性化合物至视网 膜而可忽略的全身吸收。跨巩膜给药利用了巩膜大且可进入的表面积、 使其可传导水溶性物质的高度水和作用、伴随少量蛋白水解酶及蛋白 质结合位点的细胞增生低下(hypocellularity)、及不因年龄显著降低 的渗透性。填充有活性化合物的渗透泵可被植入于对象，以使活性化 合物跨巩膜地以缓释模式而给药至视网膜。(Ambati， etal.， Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. ， 41: 1186-91 (2000))。更进一步，跨巩膜扩散位点优选为临近黄斑。用于组合物给药的植入物示范例包含但不局限于，描述于美国专利第3，416，530、 3,828,777、 4,014,335、 4,300,557、4,327,725、 4,853,224、5， 147， 647 、 5,164,188 、5， 403， 901、 5,443,505、5,632,984、 5， 679'666 、5， 766， 242、 5,766,619、5， 824， 073、 5, 904， 144、 6， 126， 687 、5， 830， 173、 5， 916， 584、 6, 146, 366 、5， 178， 635 、 5， 466， 466、 5， 710， 165、 5， 770, 592 、 5， 836， 935、 6， 001, 386、4， 946， 450、 5， 300， 114 、 5， 476， 511、 5， 725， 493、4' 997, 652、 5， 322， 691 、 5， 516， 522、 5， 743， 274、5， 773， 019、 5,824,072、 5,869,079， 5,902,598、 6,074,661、 6,110,485、6， 251， 090号；及 6， 299， 895及在W001/30323与W001/28474内的那些装置，其所有皆并入本案作为参例子包含但不局限于以下缓释药物给药系统，其包括内部存储 容器，内部存储容器包括有效量的试剂，该试剂有效取得所需局部或 全身生理或药学效果；对试剂为不可渗透的内部试管，其具有第一端 及第二端，并覆盖该内部存储容器的至少一部分，内部试管依照尺寸 制作并由一种物质形成以使该内部试管可承受其自身重量；置放于内 部试管第一端的非渗透性成员，该非渗透性成员可防止该试剂经由内 部试管的第一端而流出存储容器外；及置放于内部试管的第二端的渗 透性成员，该渗透性成员允许该试剂经由内部试管的第二端流出存储 容器外； 一种将本发明化合物投药至眼睛部分的方法，该方法包括下 列步骤植入缓释装置以将本发明的化合物投于眼睛玻璃体，或以不 可植入的缓释装置将本发明的化合物投药于眼睛部分； 一种缓释药物 投药装置包括a)药核，其包括治疗有效量的至少一种第一试剂，该 第一试剂有效地获得诊断作用或有效地获得所需局部或全身的生理或 药学效果；b)至少一个单元杯，其实质上对于将其环绕的试剂为不可 渗透，并定义一个内部空间，以接受药核，该单元杯包括开放式顶部 端，其具有环绕该单元杯开放式顶部端的至少一些部分的至少一个凹 槽；c)渗透性塞，其对于试剂为可渗透的，该渗透性塞是置放于该单 元杯的该开放式顶部端，其中，该凹槽与将其保持再适当位置的该渗 透性塞反应，并关闭该开放式顶部端，该渗透性塞允许试剂流出药核，通过渗透性塞，并流出单元杯开放式顶部端；及d)至少一种第二试剂， 其有效地获得诊断效果或有效地获得所需局部或全身生理或药学作 用；或一种缓释药物给药装置，其包括包括有效量试剂的内核，该 试剂具有所需溶解度及聚合体覆盖层，该聚合体层对该试剂为可渗透， 其中该聚合体覆盖层完全地覆盖该内核。眼睛给药的其他方法包含使用脂质体标的将本发明化合物至眼， 并优选为至视网膜色素上皮细胞、脉络膜细胞，及/或布鲁赫氏(Bruch' s)膜。例如，可以上述方法将该化合物与脂质体复合，且将该化合物/脂质体复合物注入患有眼疾的病人，使用静脉注射以指引化 合物至需要的眼组织或细胞。直接将脂质体复合物注入视网膜色素上 皮细胞或布鲁赫氏膜的临近区域亦可提供用于复合物的标的。在一个特定具体例中，该化合物通过眼内缓释给药投用(如VITRASERT或 ENVISION)。在一个特定具体例中，该化合物通过后部结膜下注射而投 用。在另一个特定具体例中，含有本发明组合物的微乳剂颗粒被给药 至眼睛组织以吸收来自布鲁赫膜、视网膜色素上皮细胞或两者的脂质。 纳米颗粒是胶状载体系统，已显示其可通过延长血清半衰期而改 善封装药物的效力。聚氰基丙烯酸垸基酯(PACA)纳米颗粒是临床发' 展中的一种共聚体胶状药物给药系统，如描述于Stella et al. ， J. Pharm. Sci. ， 2000. 89: p. 1452-1464; Brigger et al. ， Int. J. Pharm. ， 2001. 214: p. 37-42; Calvo et al. , Pharm. Res., 2001. 18: p. 1157—1166;及Li et al. ， Biol. Pharm. Bull. ， 2001. 24: p. 662-665。生物可降解的聚(羟基酸)，如聚(乳酸)(PLA)及聚(乳 酸共交乙酯)(PLGA)的共聚物是广泛地使用于生物医药应用且通过某 些FDA临床应用认证。另外，PEG-PLGA纳米颗粒具有许多所欲载体特 色包含(I)被封装的试剂包含总载体系统的合理的重量分数(负载)； (II)用于封装过程第一步骤的试剂量以合理的高水平而并入于最终 载(捕获效率)；(in)该载体具有可被干冻并可于溶液中重组而不会 聚集(aggregation); (IV)该载体为生物可降解的；(V)该载体系统 为小尺寸的；及(VI)该载体提高颗粒持久性。纳米颗粒通过实质上任何本领域已知的可降解外壳而合成。在一 个具体例中，可使用的聚合体，如聚(乳酸)(PLA)或聚(乳酸共交乙酯)(PLGA)。这类聚合体是生物可兼容的且生物可降解的，且可通 过修饰，该修饰理想地增加光化学效率及纳米颗粒的循环寿命。在一 个具体例中，该聚合体经羧酸基团(C00H)修饰，其增加颗粒负电荷， 由此局限与带有负电荷的核酸适体的相互作用。纳米颗粒亦可经聚乙二醇(PEG)修饰，其亦可增加循环中颗粒的半衰期与稳定性。另外， C00H基团可转变为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯以共价地结合经氨基 修饰的适体。适用于本发明组合物及方法的生物可兼容聚合体包含但不局限于 聚酰胺、聚碳酸酯、聚伸乙基(polyalkylene)、聚乙二醇聚烯烃氧化 物、聚对苯二酸烯烃酯(polyalky;[ene ter印thalates)、聚乙烯醇、 聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯酮烷、聚乙交酯、 聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、垸基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素 醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸与甲基丙烯酸酯聚合体、甲基纤 维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基 纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲 酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、聚(甲 基丙烯酸甲酯)、聚(乙基丙烯酸甲酯)、聚(丁基丙烯酸甲酯)、聚(异 丁基丙烯酸甲酯)、聚(己基丙烯酸甲酯)、聚(异癸基丙烯酸甲酯)、 聚(月桂醇丙烯酸甲酯)、聚(苯基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、 聚(异丙基丙烯酸酯)、聚(异丁基丙烯酸酯)、聚(十八烷基丙烯酸 酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚对苯二甲酸 乙二酯、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯 吡咯酮烷、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白聚酸酐、聚丙烯酸、 海藻酸、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙基丙烯酸甲酯)、聚 (丁基丙烯酸甲酯)、聚(异丁基丙烯酸甲酯)、聚(己基丙烯酸甲酯)、 聚(异癸基丙烯酸甲酯)、聚(月桂醇丙烯酸甲酯)、聚(苯基丙烯酸 甲酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(异丙基丙烯酸酯)、聚(异丁基丙烯 酸酯)、聚(十八烷基丙烯酸酯)及任何这些的组合。在一具体例中， 本发明的纳米颗粒包含PEG-PLGA聚合物。本发明的组合物亦可局部给药。为局部给药，组合物是以任何药 学上可接受的赋形剂提供，该赋形剂已证用于眼睛给药。优选，该组合物以滴的形式由眼球表面给药。对于一些应用，组合物的给药依赖 化合物通过角膜至眼内部的扩散。那些熟习本领域技术者将知道使用本发明化合物治疗眼睛疾病的 最佳方案可直接决定。这并非实验问题，而是一种优化问题，其可在 医药技术上常规地进行。活体内裸鼠研究通常提供一个起始点，自其 可开始最优化剂量及给药方案。如同已在一些老鼠实验中所作的，初 始注射频率将为一周一次。然而，这频率可视需要地调整，自每天至 每两周至每月，这是取决于初始临床试验所得到的结果及特定病人的 需要。一开始人类剂量值可由老鼠用化合物量推算而得到，因为熟习本 领域技术者可知这在技术中比较动物模型来修饰人类使用的剂量为常 规程序。在某些具体例中，构想剂量变化可介于约每公斤体重lmg化合物至约每公斤体重5000mg化合物；或自约每公斤体重5fflg化合物至 约每公斤体重4000mg化合物或自约每公斤体重10mg化合物至约每公 斤体重3000mg化合物或自约每公斤体重50mg化合物至约每公斤体重 2000mg化合物体重；或自约每公斤体重lOOmg化合物至约每公斤体重 1000mg化合物;或自约每公斤体重150mg化合物至约每公斤体重500mg 化合物。在其它具体例中，该剂量可为约l、 5、 10、 25、 50、 75、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、 750、 800、 850、 900、 950、 1000、 1050、 1100、 1150、 1200、 1250、 1300、 1350、 1400、 1450、 1500、 1600、 1700、 1800、 1900、 2000、 2500、 3000、 3500、 4000、 4500、 5000 mg/Kg体重。在其它具体例中，设想可使用更高剂量，这类剂量 可在约每公斤体重5mg化合物至约每公斤体重20mg化合物的范围内。 在其它具体例中，该剂量可为约8、 10、 12、 14、 16或18mg/kg体重。 当然，该剂量可如同这类治疗规则常规所作般地往上或往下调整，其 取决于初始临床试验的结果及特定病人的需要。 组合治疗本发明的组合物与方法可与任何已知技术中标准疗法组合投用。 若想要的话，在眼睛组织引发热休克的试剂或阈下激光方案(如同本 文所述)可与促进干细胞(如造血干细胞)聚集、存活、增生或转分化的试剂共同投用。这类试剂包含胶原质、纤连蛋白、层黏蛋白、整合素、新生血管因子、抗炎因子、糖胺聚糖、生长因子(vitrogen)、抗体及其片段，这些试剂的等功效物，及其组合。在其它具体例中，本发明的在眼睛组织引发热休克的试剂或阈下 激光方案(如同本文所使用的所述)是与一抗炎化合物组合投用，该 化合物是常规投用以治疗眼睛疾病。这类抗炎化合物包含但不局限于，任何一种或更多种的固醇及非固醇化合物，其例包含阿氯芬酸(Alclofenac)、阿氯米松二丙酸酉旨(Alclometasone Dipropionate)、 醋苯阿尔孕酮(Algestone Acetonide) 、 ot淀粉酶、安西法尔 (Amcinafal)、安西非特(Amcinaf ide)、氨芬酸钠(Amfenac Sodium)、 盐酸氨普立糖(Amiprilose Hydrochloride)、阿纟内白滞素(Anakinra)、 阿尼罗酸(Anirolac)、阿尼扎芬(Anitrazafen)、阿扎丙宗(Apazone)、 巴柳氮二钠(Balsalazide Disodium)、 节达酸(Bendazac)、苯恶洛芬 (Benoxaprofen)、盐酸节达明(Benzydamine Hydrochloride)、 菠萝蛋 白酶(Bromelains)、溴哌莫、布地奈德(Budesonide)、卡洛芬 (Carprofen)、环洛芬(Cicloprofen)、辛喷他宗(Cintazone)、克利洛 芬(Cliprofen)、丙酸氯倍他索(Clobetasol Propionate) 、 丁酸氯倍 他松(Clobetasone Butyrate)、氯砒酸(Clopirac)、丙酸氯硫卡松 (Cloticasone Propionate、酉昔酉爱克敏阿松(Cormethasone Acetate)、 可托多松(Cortodoxone)、地夫可特(Def lazacort)、地索奈德 (Desonide)、 去羟米松(Desoximetasone) 、 二丙酸地塞米松 (Dexamethasone Dipropionate)、 双氯芬酸钾 (Diclofenac Potassium)、双氯芬酸钠(Diclofenac Sodium)、醋酸双氟拉私、 (Dif lorasone Diacetate) 、 二氣米酉同纳(Diflumidone Sodium) 、 二氣 尼柳(Diflunisal) 、 二氟孕甾丁酯(Dif luprednate)、地氟它酮 (Diftalone) 、 二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide)、羟西奈德 (Drocinonide)、恩甲羟松(Endrysone)、 恩莫单抗(Enlimomab)、 依 诺利康钠(Enolicam Sodium)、依匹唑(Epirizole)、依托度酸 (Etodolac)、依托芬那酯(Etofenamate)、 联苯乙酸(Felbinac)、非 那莫(Fenamole)、苯布芬(Fenbuf en)、芬氯酸(Fenclof enac)、苯克洛 酸(Fenclorac)、芬度柳(Fendosal)、芬吡哌隆(Fenpipalone)、芬替酸(Fentiazac)、夫拉扎酮(Flazalone)、氟扎可特(Fluazacort)、氟 芬那酸(Flufenamic Acid)、氟米唑(Flumizole)、醋酸氟尼縮松 (Flunisolide Acetate)、氟尼辛(Flunixin)、 氟尼辛葡甲月安(Flimixin Meglumine)、氟可丁 丁基(Fluocortin Butyl)、氟米龙醋酸酯 (Fluorometholone Acetate)、 氟喹宗(Fluquazone)、 氟比洛芬 (Flurbiprofen)、氟瑞托芬(Fluretofen)、丙酸氟替卡松(Fluticasone Propionate)、呋喃洛芬(Furaprof en)、呋罗布芬(Furobuf en)、氯氟 轻松(Halcinonide)、卣倍他索丙酸酉旨(Halobetasol Propionate)、醋 酸卤泼尼松(Halopredone Acetate)、异丁芬酸、布洛芬、布洛芬铵、 布洛芬砒甲酯(IbuprofenPiconol)、伊洛达普(ilonidap)、吲哚美辛、 吲哚美辛钠、吲哚洛芬、吲哚克索、吲四唑(Intrazole)、醋酸异氟泼 尼松(Isofl叩redone Acetate)、伊索克酸(Isox印ac)、伊索昔康 (Isoxicam)、酉同、7各芬、盐酸 各一^咏挫(Lofemizole Hydrochloride)、 氯诺昔康、氯替泼诺、甲氯胺苯酸钠、甲氯芬那酸、甲氯松二丁酯 (Meclorisone Dibutyrate)、 甲芬夷随、氨基水杨酸(Mesalamine)、 美西拉宗、磺庚甲泼尼龙(Methylprednisolone Sul印tanate)、吗尼 氟酯、萘丁美酮、萘普生、萘普生钠、萘普索、尼马宗(Nimazone)、 奥沙拉嗪钠(01salazine Sodium)、奥古蛋白(0rgotein)、奥帕诺辛、 恶丙嗪(0xaprozin)、羟基保泰松(Oxyphenbutazone)、盐酸瑞尼托林 (Paxanyline Hydrochloride)、 木聚硫钠(Pentosan Polysulfate Sodium)、 保泰松甘油酸钠(Phenbutazone Sodium Glycerate)、哌非 尼酮(Pirfenidone)、砒罗昔康、砒罗昔康硅酸酯、砒罗昔康奧拉敏、 砒丙芬(Pirprof en)、泼那唑琳(Prednazate)、普利非酮(Prif elone)、 普罗度酸(Prodolic Acid)、普罗奎松(Proquazone)、普罗沙唑 (Proxazole)、柠檬酸普罗沙唑、利美索龙(Rimexolone)、氯马扎利 (Romazarit)、柳胆来司(Salcolex)、沙那西定(Salnacedin)、双水杨 酸酯(Salsalate)、血根氯胺(Sanguinarium Chloride)、司克拉宗 (Seclazone)、丝美辛(Sermetacin)、舒多昔康(Sudoxicam)、舒林酸 (Sulindac)、舒洛芬、他美辛(Talmetacin)、他尼氟酯(Talnif lumate)、 他洛沙酯(Talosalate)、特丁非隆(Tebuf elone)、替尼达普(Tenidap)、 替尼达普钠、替诺昔康(Tenoxicam)、替昔康(Tesicam)、替昔麦(Tesimide)、 特准达明(Tetrydamine)、硫平酸(Tiopinac)、锍氢考 的松(Tixocortol Pivalate)、托尔米汀(Tolmetin)、托尔米汀钠、三 氯奈德(Triclonide)、三氟米酯(Triflumidate)、齐多美辛 (Zidometacin)或佐美酸纳(Zomepirac Sodium).在其它具体例中，本发明在眼睛组织引发热休克的试剂或阈下激 光方案(如同本文所述)是与一种在眼睛组织提高或降低血管新生的 试剂组合投用，这类试剂能调节血管新生因子的表达或活性，如血小 板来源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生 长因子(bFGF)、 bFGF-2、痩素、纤溶酶原激活剂(tPA， uPA)、血管生成素、脂蛋白a、转化生长因子-e、缓激肽、血管新生寡糖(如透明质酸、硫酸乙酰肝素)、凝血栓蛋白、肝细胞生长因子(亦名分散因 子)及CXC吸引因子受体家族。在其它具体例中，试剂与方法是与化学治疗试剂共同投用，该化 学治疗试剂增强骨髓衍生干细胞动员，包含环磷酰胺(Cytoxan) 、 VP-16 及细胞因子如GM-CSF， G-CSF或其组合。本发明的组合可彼此同时，或于几小时内，或几周内投用。在一 方法中，本发明在眼组织引发热休克的试剂或阈下激光方案(如同本 文所述)是在如同本文所描述的投用常规治疗剂之前、同时或之后投 用。在一些具体例中，于热休克引发前动员骨髓衍生干细胞是理想的， 其中这类动员提高聚集至眼睛组织干细胞的数目。在其它具体例中， 优选为在引发热休克之后(如在1、 2、 3、 5或10小时内)或同时投 用动员骨髓细胞试剂。 提高干细胞聚集至眼睛组织的方法如同本文所述，在眼睛组织引发热休克有效地聚集干细胞(如造 血干细胞)至该组织，其中干细胞改善眼睛疾病或失调。若想要的话， 实质纯化的干细胞(或其前体或是其它祖细胞)可与试剂或治疗方案 (如阈下激光治疗)结合而投用病人，该试剂或该治疗方案在眼睛组 织引发热休克以促进眼睛组织的修复。这类方法可通过聚集干细胞至 该组织而用于增强眼睛组织的修复。单离造血干细胞的方法已为本领域所知晓。在一个具体例中，使 用去除法将造血干细胞从血液中单离。当总白细胞的计数为约500-2000细胞/ul及血小板的计数为约50， 000/ul时，开始总白细胞 去除法。可监视日常白细胞分离样品的CD34+及/或Thy-r细胞出现与否 来确定干细胞动员峰值以及，由从这时起的最佳采集外周血干细胞时 间。若想要的话，通过初始移除专用细胞(「谱系定性」细胞)可使用 多种技术来分离细胞，。单克隆抗体对于识别与特定细胞谱系及/或分 化状态相关的标记是特别有用的。抗体可附着于固体支持物以进行粗 分离。使用的分离技术应使收集的分级的存活率最大化。使用的分离技术包含基于不同的物理性质(如密度梯度离心及逆 流淘析离心)、细胞表面性质(血凝素(lectin)及抗体亲和性)及活体 染色性质(线粒体结合染料若丹明123及DNA结合染料Hoechst33342)。 其它可使用的分离步骤包含磁分离'使用涂附有抗体的磁珠、亲和层 析连接单克隆抗体或用于结合单克隆抗体的细胞毒素试剂，包含补体 及细胞毒素，及附着于固体基材的抗体的「淘洗」或其它便捷方法。 提供精确分离的方法包含流式细胞仪(如使用多个色彩通道、小角及 钝角光分散侦测通道，阻抗通道的流式细胞仪)。可通过相对粗分离从样品中移除大部分分化的细胞，其中造血系 统的主要细胞群系，如淋巴细胞及单核细胞，，以及淋巴群，如巨核细 胞、肥大细胞、嗜酸性红细胞及嗜碱细胞可被移除。通常，至少约百 分之70至90的造血干细胞可被移除。伴随提供正选择的粗分离，例如使用CD34标记，或是接在正选择 的粗分离后，可实施负选择，其中可使用针对存在于专用细胞上的族 系特异性标记的抗体。作为最大部分，这些标记包含CD2—、 CD3—、 CD7—、 CD8—、 CD10-、 CD14—、 CD15—、 CD16_、 CD19-、 CD20-、 CD33—、 CD38-、 CD71—、 HLA-DR—及血型糖蛋白A;优选包含至少CD2—、 CD14_、 CD15—、 CD16—、 CD19_ 及血型糖蛋白A;及通常包含至少CD14—及CD15—。如同本文所用的Lin—是 指缺乏至少一种族系特异性标记的细胞群。纯化的千细胞通过FACS试验具有低侧分散及低至中前分散图谱。 细胞离心涂片机(cytospin)制备物显示了经浓縮的干细胞具有介于成 熟淋巴细胞及成熟粒细胞之间的大小。细胞可通过基于光分散性质及 其多种细胞表面抗原的表达而被选择。优选地，细胞最初通过粗分离而分离，随后以与干细胞相关标记的正选择及与族系定型细胞相关标记的负选择进行细部分离。可通过 此方法实现高度浓缩干细胞的组合物。接着将纯化的或部分纯化的干细胞投用病人。投药可为局部(如 通过直接投于玻璃体液或供给感兴趣眼睛组织的血管)或全身。 多核苷酸治疗以引发热休克特载编码HSP蛋白质、变异体或其片段，或是可激活热休克的蛋 白质的多核苷酸的多核苷酸治疗是另一种治疗眼睛疾病的治疗手段。 另外，该多核苷酸编码治疗多肽，其增强干细胞聚集、存活、增生或 分化或另外改善与眼睛疾病相关的症状(如，降低炎症、新生血管或 细胞死亡)。若想要的话，本发明的干细胞的基因经过修饰以表达生物 活性分子或外源性蛋白质，或是过度表达内生性蛋白质。该细胞可携 带细胞、组织或是器官的长期存活所需，或是侦测或是监控细胞所需 的基因信息。在一个例子中，该细胞的基因经过修饰以表达促进血管 新生的生物活性分子。在另一个例子中，该细胞的基因经过修饰以表 达萤光蛋白标记。标记示范例包含GFP、 EGFP、 BFP、 CFP、 YFP及 RFP。这类多核苷酸可被投送至患有眼睛疾病的对象细胞，其中该重组 蛋白质的表达将具有疗效。例如，编码治疗性多肽的核酸分子被投送 至干细胞，如骨髓衍生干细胞、造血干细胞、其前体或祖细胞。在其 它方法中，核酸分子被投至眼睛组织的细胞中，如视网膜、视网膜色 上皮或脉络膜。核酸分子必须以其可被吸收的一种形式投送至对象细 胞内以产生治疗性多肽(如HSP蛋白质，如HSP70、 HSP90)或其片段 的有效水平。现存多种制造本发明的多肽的表达系统。产生这类多肽的有用的 表达载体包含，但不局限于，染色体型、附加型及病毒衍生性的载体， 例如由细菌质粒、由噬菌体、由转位子、由酵母附加体、由插入元素 (element)、由酵母染色体元素、由病毒，如杆状病毒、乳头状多瘤空 泡病毒，如SV40、牛痘病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒及逆 转录酶病毒所衍生的载体，及由上述组合所衍生的载体。一种产生多肽的特定细菌表达系统是大肠杆菌PET表达系统(如， pET-28) (Novagen， Inc. ， Madison， Wis)。依照这个表达系统，编码 多肽的DNA以设计来允许其表达的方向插入pET载体中。由于编码该多肽的基因是在T7调节信号的控制下，多肽的表达是通过在宿主细胞内引发T7 RNA聚合酶表达而实现。其通常使用表达对IPTG诱导有反 应的T7 RM的宿主株实现。 一旦产生，随后重组多肽依照本领域已知 方法，例如，本文所使用的的那些方法而单离。另一种制造多肽的细菌表达系统是PGEX表达系统(Pharmacia)。 该系统使用GST基因融合系统，该系统是为了作为融合蛋白的的基因 或其片段的高效表达且快速纯化及复原功能性基因产物而设计。感兴 趣的蛋白质是融合于来自Sc力^^w細J邵朋icwz;的谷胱甘肽S-转移 酶蛋白质的羧基末端，且可通过谷胱甘肽琼脂糖4B亲和层析而很容易 地从细菌溶菌液中纯化感兴趣的蛋白质。融合蛋白质可在温和条件下 通过谷胱甘肽洗脱而恢复。谷胱甘肽S-转移酶区域上游能为位点特异 性蛋白酶所识别的辨识位点的存在可加速从融合细胞上将谷胱甘肽S-转移酶区域裂解。例如，在pGEX-2T质粒中表达的蛋白质可由凝血酶 裂解；在pGEX-3X中表达的蛋白质可由Xa因子裂解。另外，本发明的 重组多肽是表达于甲醇酵母(？J'c力j'a，Worj's人其为甲醇营养型酵母。 可代谢甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步骤为通过醇氧 化酶使甲醇转化为甲醛的氧化。该酶的表达是由甲醇所诱导，该酶由 A0X1基因编码。A0X1启动子可用于可诱导多肽表达或用于感兴趣基因 组成型表达的GAP启动子。一旦表达本发明的重组多肽，则使用例如，亲和层析将重组多肽 单离。在一个例子中，可将抗本发明多肽的抗体(如如同本文所述般 产生)附着至管柱，并用于单离重组多肽。可通过标准方法进行(参 阅，如Ausubel etal. ， supra)于亲和层析前对寄宿着多肽的细胞进 行溶解及分级。另外，可使用序列标签，如结合于镍柱的六组氨酸标 签来单离该多肽。一旦单离，若想要的话，该重组蛋白质可更进一步纯化，如，通 过高效^夜相层析(参阅，如Fisher， Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, eds.， Work and Burdon， Elsevier, 1980)。本发明的多肽，尤其短肽片段也可通过化学合成产 生(如，描述于Solid Phase P印tide Synthesis, 2nd ed. ， 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, III的方法)。这些多肽表达及纯化的一般方法也可用于产生及单离有用的肽片段或相似体(如同本文所 描述般)。若想要的话，可投用表达干细胞聚集因子的载体至眼睛组织，如视网膜色素上皮层。SDF-1 (亦称为PBSF) (Campbell et al. (1998) Science 279 (5349) : 381-4)、 6-C-kine (亦称为Exodus-2)及MIP-3 P (亦称为ELC或Exodus-3)诱导大多数循环淋巴细胞的黏附，包含大 多数CD4+T细胞；且MIP-3a (亦称为LARC或Exodus-1)触发记忆T细胞 而非原态、CD4+ T细胞的粘附。Tangemann et al. (1998) J. I讀,l. 161: 6330-7揭露次级淋巴组织吸引因子因子(SLV)的作用，其为高 内皮微静脉(HEV)相关吸引因子，引导淋巴细胞至次级淋巴器官。 Campbell et al. (1998) J. Cell Biol 141(4): 1053-9描述SLC受 体如CCR7，及其配体，SLC可于生理剪力滚动下触发淋巴细胞的快速整 合素依赖性阻滞。在其它方法中，投用表达抗血管生成多肽的载体以降低眼睛组织 内新生血管化。这类抗血管生成多肽包含，但不局限于，白介素a， 白介素P 。在又另一些方法中，编码特征性表达于眼睛细胞的多肽的载体被 引入本发明的干细胞。在视网膜上皮细胞表达的多肽包含视网膜色素 上皮标记，RPE65，及内皮组织标记，如RPCA-1。若想要的话干细胞组 成型地表达CNS内皮特异性标记(如P-糖蛋白、GLUT-1及转铁蛋白)。 转染这些载体的干细胞优选展示视网膜色素上皮细胞形态特性及抗原 表达特性(如，平铺形态及RET-PE2及细胞角蛋白的表达)。视网膜包 含已知的SAGE标记的多个特异性蛋白质的例子显示于表1。表1视网膜特异性/浓缩(enriched) SAGE标签 SAGE标签 基因 视网膜疾病 TGTGCTGAAC转铁蛋白 -GTAGGAGCTGHRG4 -TACGTGAATT y传导素 -AGAAGGCCTGROM 1 ADRP GCCCTGTGCT恢复蛋白(recoverin) -CTGGGTAGCA GAAAAATAAATAACACATTCCGGGGTAGCA GATTTGGATG AGAGCGCAGC GACAATAAAT CTCACCACCA CAGATGGTTT CACCCTCAGCAGAAAATAAATTGCTTTTATATCTTTTTAAGTACATTAGT GGCCCCAGTT CTAACTGCGA CTTTCTCCTT ATGGGTCTGG AGAGCACAGC GACCACAAAAY磷酸二酯酶1. ABCR2. 丙酮酸脱氢酶激酶，同工酶1. 假想蛋白质(hypothetical -protein)2. Hs. 1517103. 钠钙交换蛋白Y磷酸二酯酶 -Hs.35493 -晶体蛋白，a A MT-原钙粘蛋白视紫红质 Hs. 21299 阻抑素(arrestin)斯特格、CRD、 ARRP白内障ADRP、 ARRP、 cSNB小口氏病(Oguchi) ARRP1. 分泌载体膜蛋白12. 光导蛋白3. Hs. 580331. 绒毛膜生长激素2 (chorionic somatomammotropin hormone 2)2. Hs. 2566351. MAGUK p55亚族成员42. 细胞色素b-5 簇样蛋白1 (视网膜) 视紫红质Hs. 13768fH专导素 Hs. 145068 晶体蛋白，a A CACNA1FADRP、 ARRP、 cSNB白内障 CSNBACGTGCGCCAGTCAGGAATT TATACCATTT GATGGAGGACACTAGCACGC GGAGCCCTCT TAACAAAACCACAATGTTGT AAGTCTGTTG AGGTCTGCCT TACATCATAT TGATCACGCC TTAACTGTAC ACCCAAGCATTAGTAGGCAC CTGTTACCAG TTTCAAAGGG TACAGTAGTC GTACTTTTAA GAAAATGAGATGGTTGCTGG AGGCCGCTAG TAAAATGCAGCAAGGGGTTC1. a传导素 CSNB2. 溶质运载蛋白家族210磷酸二酯酶 CSNB免疫球蛋白超级家族，成员4 -1. RNA结合蛋白质S1 -2. 0通道 ADRP NRL ADRP NR2E3 ESCS1. 钙结合蛋白质5/3 -2. Hs. 578983. Hs. 5801细胞内视黄酸结合蛋白1 _Hs. 300880 _红/绿视蛋白 色盲a通道 ARRP烯醇酶2 -Hs. 66803 -蛋白磷脂酶，EF手形钙结合区域-2 (rdgC同族体)謹4 _巻曲相关蛋白质 _Hs. 98927 -Hs. 239444 -Hs. 261526 _ 丝氨酸蛋白酶抑制剂分支B，成员-6Hs. 33792 -X-阻抑素 -1. 神经分化因子D -2. Hs. 271341a通道 ARRPTATATACACA TTTTTGTGTT GGCTGCAATC1. IRBP2. 纺锤体蛋白1. Hs. 1270192. Hs. 503401. 磷酸甘油酸变位酶2. 尿嘧啶二磷酸半乳糖PN-乙酰葡萄糖胺beta 1， 3-半乳糖TATGTATCCT TGCCTGCTAA CTTGTTTTGTTCTACCTATGAGCCGGAGGT ATTTTCAGTT TTGGGCAGGC AACTTCAAGG TGGTAAATGT GGGGACCCTT CTCTTCTGGA GGAAGGAAAATCCAAACTAA GGGTGGGGGATGCTTCTTCT(UDP-GEil:betaGlcNAc beta 1， 3- galactosyltransferaseSH3区域结合富含谷氨酸类蛋白2Hs. 988811. 视网膜同源盒蛋白质2. Hs. 127991. 谷胱甘肽过氧化酶32. 钙蛋白酶9 双特异性磷酸酶6 Hs. 250591Hs. 213731 Hs. 154131鸟苷酸环化酶激活因子1C HT017鸟苷酸环化酵激活因子IA1. 三磷酸腺苷酶，H+传送，溶酶 体，成员D2. Hs. 43112 YPDE1. 囊泡相关膜蛋白22. Hs. 2206563. Hs. 340046 NDRG家族，成员4TGTCAGTCTT AAGTTTGGCC TCCCTGGTGCTTTTATTGCA ATACTCATTG AGAGACCCTCHs. 310689 转铁蛋白1. 突角虫回蛋白 l(sy卿togyrin 1)2. Hs. 279307 蛋白激酶锚定蛋白 Hs. 122245Hs. 113689转导病毒(如逆转录酶病毒、腺病毒及腺相关病毒)载体可用于 体细胞基因疗法，尤其是因为其高效的感染性及稳定的整合性及表达(参阅，如Cayouette et al. ， Human Gene Therapy 8:423-430， 1997; Kido et al. ， Current Eye Research 15:833-844， 1996; Bloomer et al.， 了o訓al of Virology 71 :6641-6649， 1997; Naldini et al.， Science 272:263-267， 1996; and Miyoshi et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319， 1997)。例如，可将编码HSP蛋白质、变异体 或其片段的多核苷酸克隆至逆转录酶病毒载活体内，而表达可由其内 生性启动子、由逆转录病毒长末端重复或由组织或感兴趣细胞的特异 性启动子(如眼睛组织，如脉络膜或视网膜色素上皮层)所驱动。其 它可用的病毒载体包含，例如，牛痘病毒、牛刺瘤病毒或孢疹病毒， 如Epstein-Barr病毒(亦参阅，如Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244: 1275—1281， 1989; Eglitis et al.， BioTechniques 6: 608-614， 1988; Tolstoshev et al. ， Current Opinion in Biotechnology 1: 55—61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277—1278， 1991; Cornetta et al. ， Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36: 311-322， 1987; Anderson, Science 226: 401-409， 1984; Moen， Blood Cells 17: 407-416， 1991; Miller et al.， Biotechnology 7: 980-990， 1989; Le Gal La Salle et al.， Science 259:988-990， 1993;及Johnson, Chest 107: 77S-83S, 1995 的那些病毒)。逆转录病毒的发展特别完善并已用于临床设置(Rosenberg et al. ， N. Engl. J". Med 323: 370， 1990; Anderson etal.，美国专利号5， 399， 346)。最优选，病毒载体用于将HSP多核苷 酸投用至眼。也可使用非病毒方法以将有疗效的多核苷酸引入病人细胞内(如 眼睛细胞或组织)。例如，核酸分子可通过脂质转染法(Feigner et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413， 1987; Ono et al.， Neuroscience Letters 17: 259， 1990; Brigham et al. ， Am. J". Med. Sci. 298: 278， 1989; Staubinger et al. ， Methods in Enzymology 101: 512， 1983 )、通过脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸共轭 (asialoorosomucoid-polylysine conjugation) (Wu et al. ， Journal of Biological Chemistry 263: 14621， 1988; Wu et al. ， Journal of Biological Chemistry 364: 16985， 1989)或是通过外科微注射(Wolff et al.， Science 247: 1465， 1990)而引入细胞。优选地，核酸是与 脂质体及精蛋白组合投用。基因转移也可通过非病毒手段，包含活体外转染而实现。这类方 法包含使用磷酸钙、DEAE右旋糖、电穿孔及原生质体融合。脂质体对 投送DNA进入细胞具有潜在好处。将正常基因移植入病人受侵袭组织 也可通过转移正常核酸至活体外可培养细胞类型(如自体或外源初级 细胞或其子代)，随后将该细胞(或其子代)注射于目标组织而实现。用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可由任何合适的启动子(如人 类巨细胞病毒(CMV)猴病毒40 (SV40)或金属硫蛋白启动子)所指示， 且可被任何恰当的哺乳动物调节元素调节。组成型启动子的示范例包 含下列基因的启动子，该基因编码组成型或「持家」功能的基因次 黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、 二氢叶酸还原酶(DHFR) (Scharfmann et al.， Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 4626-4630 (1991))、腺苷 脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、肌 动蛋白启动子(Lai et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989))， 及熟习本领域技术者所知的其它组成型启动 子。另外，许多病毒启动子组成性地作用于真核细胞内。这些中尤其 包含SV40的早期与晚期启动子、莫罗尼白血病病毒及其它逆转录酶 病毒的长末端重复(LTR)及单纯孢疹病毒的胸苷激酶启动子。据此， 上述任何组成型启动子可用于控制外源性插入基因的转录。在可诱导启动子控制下的基因，其在引发剂存在下仅或达很大程 度地表达(如在某些金属离子的存在下金属硫蛋白启动子控制下的转 录显著提高)。可诱导启动子包含应答元素(RE)，当它与它的诱导因 子结合后刺激转录。例如，存在血清因子、甾类激素、视黄酸及环AMP的应答元素。为了获得可诱导反应，可选择含有特定RE的启动子，在 一些情况中，RE本身可附于不同启动子，以提供重组基因诱导性。因 此，通过选择合适的启动子(组成型相对可诱导的；强相对弱)可控制基因经过修饰的干细胞及/或视网膜细胞内治疗剂的存在及表达量。据认为，为了投送有效量的特定治疗剂对这些因子做选择及最佳化，是落在熟系本领域技术人员于考量上述揭露的因子及病人临床试验下不需过度实验即可实施的范畴内。在至少一个启动子及一个编码治疗剂外源性核酸之外，表达载体优选包含选择基因，例如，抗新霉素基因，以加速选择已转染或转诱 导表达载体的干细胞。若想要的话，已知在特定细胞类型优先指示基因表达的增强子可 被用于指示核酸表达。所使用的增强子包含，但不局限于，特征为组 织或细胞特异性的那些增强子。另外，若使用基因组克隆作为治疗构 造，介导调节可通过同源调节序列，或若想要的话，衍生自外源性来 源的调节序列，包含任何上述启动子或调节元素。包含于本发明的其它治疗方法包括投用重组治疗剂，如重组HSP蛋白，变异体，或其片段，要么直接投用至潜在或确实感染疾病的组 织位点，要么投用至全身(例如，通过任何常规重组蛋白质投用技术)。 投用蛋白质的剂量取决于一些因素，包含个体病人的体型大小及健康 状况。于任何特定对象，特殊计量方案应依照个体需要及作出投用或 指示投用组合物的人的专业判断于一段时间后调整。眼睛途径是引发干细胞及/或载体定位至眼睛组织的较佳药物接 种途径。然而，其作为较佳投用途径并非意图排除任何其它投用途径。 较佳的载体投用途径是通过玻璃体内或视网膜下途径。眼睛途径包含 但不局限于，结膜下注射、表面滴液缓释装置如胶原保护层、水凝胶隐形眼镜或ALZA 「毛果芸香碱控释膜(Ocusert)」。结膜下接种的实现 是在注射0.2-0.5ml载体前使用丙美卡因麻醉，注射剂量为10-1000ug/接种，以胰岛素注射器及小规(small gauge)针给药。注射 于下部闭塞以确保疫苗物质维持在下结膜内并不外漏。表面滴液接种包括放置结合或不结合辅佐剂及/或干细胞运输药 物的载体于结膜闭塞处，随后闭眼轻揉30秒。该过程可每天重复二到 三次，共五天以延长暴露，其皆包含单一接种。为了更佳的保持，泪 排泄管可暂时使用胶原质或其它装置阻塞。另外，载体及/或裸露DNA 可封装于微胶囊中并移植入眼以易于其持续释放。套组本发明提供用于治疗或预防眼睛疾病、失调或其症状的套组。在 一个具体例中，该套组包含药学包，其包含有效量HSP90伴侣调节物 (如格尔德霉素)或热休克反应激活物(如雷公藤红素)。优选地，组 合物以单元剂型存在。在一些具体例中，该套组包含无菌容器，该无 菌容器含有治疗性或预防性组合物；这类容器可为盒、针剂、瓶、封 闭小瓶、试管、袋、小袋、泡沬包装，或其它本技艺领域中已知的合 适容器形式。这类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其它合适 保存药物的物质制成。若想要的话，指导说明可与本发明的多个组合物或其组合共同提 供，该指导说明为投用组合物或其组合至患有或存在发展眼睛疾病或 失调，如糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼视网膜色素 病变、与年龄相关的黄斑退行性改变、青光眼、角膜营养不良、视网 膜先天性裂、斯特格病变、常染色体显形玻璃膜疣及贝斯特氏黄斑营 养不良。指导说明一般包含关于治疗或预防眼睛疾病或是失调化合物 使用的资讯。在其它具体例中，指导说明包含至少以下一项化合物 或其组合的描述；治疗眼睛疾病或其症状的剂量计划及投用方法；注 意事项；警告；适应症；反向指示语；用药过量资讯；副作用；动物 药理；临床研究；及/或参考。该指导说明可直接印刷于容器上(若有 容器的话)，或作为容器的标签，或为单独的纸、小册子、卡片或文件 夹，于容器内或与其一同提供。 实施例l:通过激光聚集干细胞以GFP+干细胞构建嵌合小鼠，该小鼠接受接近致命辐射并移植入该 GFP+干细胞。以来自GFP纯合基因转植供给体的表达GFP造血干细胞制造嵌合小鼠。此些细胞被移植入接受接近致命辐射的受体内。所有后续的激光都是使用这些gfp嵌合小鼠(C57B16.gfp)。使用具有点半径为 75um的810nm两极管激光，多种能量程度被投于视网膜，包含在视网膜 不产生可见激光组织反应(激光发光1130W/cra")的5mJ (50mW， 0. lmsec) 的能量。这被视为低于可见阈下。激光后三周，无痛致死动物并收集 其眼球。准备眼杯并移除感觉祌经视网膜。接受阈下激光能的眼球证实其有力的聚集造血干细胞(HSC)至视 网膜色素上皮层而呈扩散模式。此变化发生于两周内。如图1与2所 示，阈下激光引发成熟干细胞迁移并修复视网膜色素上皮。图1显示 了在RPE量上显著的依靠工作期的gfp+细胞定位。图1中黑色区域表明 并入接受过激光的RPE区域的GFP+细胞。将以对侧(未受袭)眼确定的 背景萤光从此图像中移除。图2为定量人干细胞(HSC)合并入RPE的 量的图表。实施例2:聚集至视网膜的HSC表达视网膜特异性标记共聚焦免疫萤光显微镜法显示GFP+细胞与RPE特异性蛋白质RPE65 共位，这表明聚集的造血干细胞具有后天RPE特性。也证实这些眼球同 时扩及内皮细胞聚集。接受高能激光(150mW， 0.1 sec)的眼球(具有 视网膜浑浊)表明GFP+的HSC与内皮细胞一起病灶聚集至疤痕区域。阈下 激光引发HSC迁移至并并入RPE。合并的程度与激光工作期相关联。15% 工作期可导致最大程度的HSC合并。实施例3:阈下激光增加hsp70， hsp90，及引发热休克反应导致SDF-1 与VEGF的释放眼睛激光是治疗多种视网膜失调的重要工具。在大多数情况中， 作用归因于视网膜可见变化(也就是，激光引发光化学灼烧)。据信810 纳米两极体激光对于感觉神经视网膜造成较小伤害，这是因为激光能 为RPE所吸收。图2证实在RPE量上显著的依靠工作期的GFP+细胞定位。 在10%工作期时有最大反应。其通过使用与细胞疗法非常相似的过继转 移方法另外确认。过继转移包括全身投用HSC并导致这些细胞快速归路 (homing)至产生化学趋化物的区域。微脉冲激光临床发展已减小视网膜的光裂解伤害。用于微脉冲模 式的红外(810nm)激光是一种潜在治疗视网膜失调来说相对新的模式。在单一次暴露下重复地使用简短的激光脉冲将限制热传导量及之后的 RPE伤害。在临床上，最近因为这点而被采纳。据认为，热休克反应是 细胞保护反应，这是基于热休克蛋白质整体限制蛋白质错折迭的能力。 为了确定使用微脉冲激光(其通过热力效果作用而引发热休克反 应及/或引发细胞因子及生长因子)是否吸引HSC至眼，使用具有可变 工作期的红外激光来检测感觉神经视网膜以及含有RPE与脉络膜复合物的后杯内hsp70， hsp90的mRNA表达时间过程。Hsp70峰值提高可 于激光后两小时在神经视网膜观测到，于激光后四小时在后眼杯内观 测到。Hsp90的mRNA于两小时时峰值明显地都出现于神经视网膜及后 眼杯。亦在后眼杯观测到激光所引发的SDF-1及其受体CXCR-4的表达。 激光后两小时的检测表明简短的激光影响RPE细胞转录机制并重编 RPE细胞以产生一系列能够聚集HSC至视网膜的因子。激光后四小时， 可观测到SDF-1及CXCR-4的表达提高。由于已知SDF-1及CXCR-4对 缺氧有反应，检测激光视网膜于HIF-lamRNA量的作用。在后眼杯内 HIF-1 a的mRNA量于两小时时降低并于四小时时增加。这些研究支持由SDF-1及CXCR-4调节的RPE自分泌及旁分泌。在 不希望受到任何理论束缚的情况下，可能阈下激光促发(prime)RPE-光 受体层的细胞外环境，且创造用以接受聚集HSC的环境。生长证据表 明细胞外hsp70是神经保护剂。在不希望受到任何理论束缚的情况下， hsp70可能在视网膜内通过促进聚集HSC至视网膜而作为神经保护因 子，以提供RPE修复。热休克蛋白有可能作用于聚集HSC至视网膜。 其可通过活体内局部产生化学吸引蛋白质后的HSC的聚集而实现。 实施例4:初级RPE培养物于热休克后Hsp70 mRNA量的增加为了确定RPE是否可作为所观测到的活体内细胞因子反应的来源， 将人类初级RPE与ARPE19 (永生化RPE细胞)培养物热休克。在热休 克后二小时，可观测到热休克蛋白质HIF-1 a及SDF-1与VEGF的mRNA 的抑制作用。在RPE培养物中，可观测到hsp90的mRNA量显著提高40 倍。该活体外hsp90实验结果与其活体内结果相似。显著地，在初级 RPE培养物内可观测到hsp70的mRNA量提高50倍，其表明固有RPE 细胞释放这个假定的神经保护剂。基于这些活体内数据，在不希望受 到任何理论束缚的情况下RPE可能为促使HSC聚集至视网膜的吸引因子的来源。这并不排除其它细胞类型参与聚集反应的可能性。总言之，这些结果首次表明可通过激光或药学引发HSC局部聚集至视网膜，包含RPE层。这是由热休克反应的SVL引发所实现。激光 引发热休克反应是暂时与HIF-1 a释放相关，并随后与HSC化学吸引物 SDF-1及VEGF相关。本案结果并未产生临床上可见激光灼伤或疤痕。 本方法以它没有损伤而与其它引起可见视网膜损伤的激光方法相区 分。实施例5:化学引发的热休克会聚集HSC至RPE这些观测结果可延伸至初级人类RPE细胞内化学引发的热休克反 应。暴露于激光后四小时，h印70量大幅提升，并在hsp90， h印32及 晶体蛋白的mRNA量有适当提升。亦可观测到SDF-1的表达。该表达的 时间过程反映了传统热休克引发的过程。此外，图3显示化学引发的热休克聚集HSC至RPE。以小分子引发 物的药学引发热休克反应是通过玻璃体内格尔德霉素注射或通过分开 暴露RPE细胞以使SDF-1及VEGF同等引发。此些实验提供不论是通过 激光或药学引发所引发的热休克直接导致HIF-la及关键HSC吸引因 子SDF-1及VEGF的产生的决定性证据。更进一步，其表明药学处理有 效的聚集HSC至RPE层并分化。临床研究表明年长病人其体内循环中的HSC量降低。这些细胞可 从骨髓中动员并进入体循环以聚集至视网膜。目前，常见干态ARMD没 有有效治疗方法。本发明提供治疗ARMD的激光及药学方法。本方法更 进一步提供针对ARMD的造血干细胞疗法。本研究表明老化修复缺陷可 能与引起发展成ARMD的有关，并更进一步表明通过使用激光及药学方 法的组合以提高修复功能可治疗ARMD。尤其地，本发明提供多个方法， 其为通过提供动员HSC的试剂，如GM-CSF，来促动A脂D病人，接着通 过阈下激光或玻璃体内注射可引发热休克反应的化合物而引起RPE层 的细胞修复。上述所得结果是使用以下方法及材料。 欲 敏房学做"通过周期性(如每月)ERG (用于确定光受体功能的非侵入式方法) 评测治疗及未治疗眼睛视网膜功能以确定激光或药剂疗法的效果。视网膜电图学是一种非侵入式技术，其在麻醉动物中测定对光的角膜电反应。小鼠以80-100mg/kg可他命及5-10mg/kg甲苯噻嗪的混合物经 腹腔注射麻醉(Phoenix Pharmaceuticals, St. Jos印h， M0)。小鼠 角膜以一滴0. 5%盐酸丙美卡因(Akorn， Buffalo Grove， IL)麻醉， 并以一滴2.5%盐酸去氧肾上腺素(Akorn)扩大。末端缠有金线圈的测 量电极被放置于二角膜上，并以一滴2.5%羟丙甲纤维素(Akorn)保持 电极接触与角膜水合。于小鼠下头皮中心皮下放置一个参考电极，接 地电极被放置于后腿皮下。小鼠静置于自制滑动平台以保持其在37。 C 恒温下。小鼠适当放置以使其整个头部位于UTAS-E2000可见电诊断系 统(XKC Technologies, Inc. ， Gaithersburg， MD) 的Ganzfeld (全 域)照明圆顶内。全域暗视ERG由一分钟时间段内强度为0.9及1.91og cd m-2的10微秒闪光测定。反应是以4000的增进扩大，在0. 3至500 Hz间过滤，在二通道 内以2000Hz的速率数字化。在每一强度将五个反应平均。使用 UTAS-E2000软体包(LKC Technologies, Inc.)分析波形。A-波在负 角膜向自基线至波峰测定；b-波自负角膜峰至主要正角膜峰测定。动物在其眼中接受三次抗生素软膏(Vetropolycin)以维持后续 步骤眼内湿度，在这些动物重返动物园前，其于37° C暖盘上复苏。 接受可他命/甲苯噻嗪麻醉的动物亦可接受0. 01-0. 02ml/g体重的暖的 LRS SQ。 総錄澄產治疗及未治疗眼的视网膜检测是通过眼底镜检查评测。眼底镜检 查是非侵入式技术，其中麻醉动物的视网膜照片被拍下。小鼠被麻醉， 其眼角膜如上文ERG试验中描述被麻醉并扩大。眼底照相以专门相机 及透镜实施，以Kowa Genesis手持基底相机(Kowa Company, Ltd., Tokyo, Japan)通过Volk Super 66 Stereo Fundus Lens (Keeler， Berkshire, England)聚焦完成。通常每只眼拍摄两张照片以确保图 像恰当聚焦。动物在其眼中接受三次抗生素软膏(Vetropolycin)以 维持后续歩骤眼内湿度，在这些动物重返动物园前，其于37° C暖盘 上复苏。接受可他命/甲苯噻嗪麻醉的动物亦接受0. 01-0. 02ml/g体重 的暖的LRS SQ。激光治疗动物术前准备包括确定牠们身体是活跃的并可接受麻醉。小鼠需 为无任何眼分泌或白内障迹象以使它们易于观察视网膜并进行激光灼烧治疗。在激光治疗前，小鼠以80-100mg/kg可他命及5-10mg/kg甲 苯噻嗪混合经腹月空注身寸麻醉(Phoenix Pharmaceuticals, St. Joseph, M0)。没有任何的角膜水肿或白内障的形成是与使用这些麻醉剂有关。 麻醉程度通过足垫收縮及呼吸率测定。无足垫收缩反应表明该动物被 恰当地麻醉。在激光治疗前或期间不使用眼睛软膏，这是因为它将阻 止有效的激光治疗。施用一些抗生素软膏来保护未治疗眼。若证实足 垫收縮后无反应则可进行激光治疗。在激光治疗所需时间内动物的运动表明疼痛，紧张或不适。若在 激光手术前或期间该动物显示增多的活动，则需将其暴露于异氟烷下 10秒以补充麻醉。大约lml异氟烷吸收于放置于50ml塑料离心试管底 部的褶皱Kimwipe上，盖上该试管。若想要的话，试管开端可于动物 鼻部附近短暂停留。该过程进行于通风罩内。此后维持测定该动物的 呼吸率，其疼痛反应通过足垫收缩测定。如足垫收缩后无运动，则可 进行激光手术。激光治疗于每只小鼠约费时30秒。腹腔注射育亨宾 (2mg/kg体重)是用于消除可他命/甲苯噻嗪的作用。这可縮短眼睛由 于麻醉下损失的瞬目反射的风险时间。术后无反常行为。激光治疗后可发生疼痛，紧张或不适。文献表明藉助过程最后于 角膜应用酮洛酸使人类从激光治疗恢复(Kosrirukvongs et al， Topical ketorolac trometh咖ine in the reduction of adverse effects of laser in situ keratomileusist, J". Med Assoc Thai, 2001; 84: 804-810及Price, et al， Pain reduction after laser in situ keratomileusis with ketorolac tromethamine ophthalmic solution 0.5%: a randomized, doubled-masked, placebo—controlled trail, J. Refeact Surg， 2002; 18: 140-144)。因此，在激光治疗后酮洛酸 溶液(0. 5%0P)滴液被用于小鼠眼48小时，或更长时间(若有需要的 话)。此溶液的商业名为Acular PF溶液。以Acular PF治疗过程于小 鼠并无副作用，而通过试验注射赋形剂的动物证明该过程对新生血管 化并无作用。动物可豢养于笼中并维持于室温下(18-26°C)，或37。C暖盘上，持续目测直至其显示由麻醉中恢复的迹象。从麻醉中完全恢 复仅表现于该动物完全警觉并于笼中走动。 雌纖供体小鼠在收集骨髓前以人道方式无痛致死，此过程并非存活手术。通过注射过量克他命(甲苯噻嗪60 mg/Kg，克他命30 mg/Kg)投 用IP无痛致死动物。在丧失深度疼痛后(以失去足尖/足垫收缩反应确 定)，对其进行颈部去臼以确定死亡。为了收集小鼠骨髓衍生干细胞，无菌条件下割下4至8周大表达 增强萤光蛋白(GFP)的基因转殖小鼠的大腿骨并。切除大腿骨两端， 使用2. 5ml注射器及21-量规注射针，以5ml DMEM培养液(匿EM; Nissui Co. ， Tokyo, Japan)挤出骨髓，该DMEM培养液含有10%胎牛血清，2 mM L-谷氨酸，100单元/mL青霉素G，及10%肝磷脂。进行FACS试验以 确定恰当的BMSC表现型。 麟離浙腹腔内注射步骤如下尽可能靠近耳朵的后颈处将样本拿起。以同 一只手的小指拿住小鼠尾巴。使用26量规无菌皮下注射针刺穿皮肤及 腹部肌肉并小心地将注射针内内含物注入腹腔内，小心避开横膈膜及 其它内部器官。如上文所述麻醉小鼠。使用盐酸丙美卡因0.5% (Alcon Laboratories, Inc. ， Fort Worth, TX)进行额夕卜局部麻醉。注射前 将盐酸苯肾上腺素及/或硫酸阿托品用于眼球表面以达到扩瞳而将过 程中的伤害减至最小，注射后使用三次抗生素眼药膏以防止感染。使 用30量规注射针在颞缘后0.5mm刺一孔，微注射针由此切口插入，大 约1.5mm深，朝向感光神经角度至针尖于玻璃体中心可见。所有注射 藉助解剖显微镜而看见，该解剖显微镜为Nikon SM2800 (Nikon， Melville, NY)，其由光纤灯源提供照明。该光纤灯源来自Southern Micro Instruments 150瓦特光纤灯源并具有Schott Fostec光纤臂 (Southern Micron Instruments, Marietta, GA)。接着缓慢弓l入至2 微升药物悬浊液至玻璃体，小心地取回注射针。这个过程后，小鼠可在干净笼内的暖盘上恢复。观测动物直至其完全从过程中恢复，之后将这些动物归回动物园。 凝歉微对于局部投送干细胞，眼球后注射是替代后部筋脉内注射以移植 干细胞的良好方法。如上文所述以克他命/甲苯噻嗪，或通过精密喷雾 器投用异氟烷麻醉小鼠。眼睛上方毛被温和縮回，类似于出血过程。使用lcc注射器及27或30g注射针进行注射，向外斜并以45°角插入眼球后部窦中心区域。小心地向前以针尖刺穿眼球后窦，确定注射针约至窦中部。缓慢注入至200ul细胞悬浊液。该细胞悬浊液在注射前过滤使其不含块。注射后，小心移除注射针，保持斜角向外以使小鼠 眼球不被刮伤。对多重注射来说，至少注射与注射间需间隔2天。后续注射使用 交替眼球，每只小鼠每眼最多接受2次注射。于注射前一分钟投用丙 美卡因局部麻醉。眼球后注射创伤显著小于同一位置眼睛出血。术后检查或观测该 位置以确保眼睛无创伤。每一注射后，且一旦出血完全止住即将抗生 素眼药膏均匀涂抹于眼睛以防止感染。该过程后，在随后24-48小时 内检测动物疼痛迹象(面部痉挛，斜视)并视需要给予止痛剂。于麻醉后，观测动物直至其有意识并可走动，之后将这些动物归 回动物园。 其它具体例由上文描述，很明显可对如同本文所述的本发明作变化及修正以 使其合适于不同使用及状况。这类具体例亦包含于以下权利要求的范 畴内。以在任何定义中的变量描述的元素列表包含作为任何单一元素或 列表中元素的组合来对变量作定义。对如同本文所使用的具体例的描 述包含该具体例作为任何单一具体例或其任何其它具体例或部分的组 合。如果独立的专利及刊物特别且单独地被指明要并入本案参考的 话，所有本说明书提及的专利及刊物于此以相同程度并入本案参考。
权利要求
1.一种改善对象眼睛疾病的方法，其包括(a)在眼睛组织的至少一个细胞内引发热休克；及(b)聚集干细胞至该眼睛组织，由此改善该眼睛疾病。
2. 如权利要求l所述的方法，其中在该眼睛组织引发该热休克是使用阈下激光(SVL)刺激。
3. 如权利要求l项所述的方法，其中引发该热休克是使用小分子化合 物，该小分子化合物选自由格尔德霉素、雷公藤红素、17-丙烯胺 基-17-去甲氧基格尔德霉素、EC102、根赤壳菌素、二牛龙牛儿基 丙酮(geranylgeranylacetone)、芍药苷、PU-DZ8及H-71所组成的 群组。
4. 如权利要求l所述的方法，其中引发该热休克是使用多肽，该多肽 选自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所组成的群组。
5. 如权利要求l所述的方法，其中引发该热休克是使用包括编码热休 克多肽的多核苷酸的表达载体。
6. 如权利要求1至4任一项所述的方法，其中该方法提高热休克蛋白 质的表达或活性，该热休克蛋白质选自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所组成的群组。
7. 如权利要求4或5所述的方法，其中该热休克多肽是Hsp70或 Hsp90。
8. 如权利要求l所述的方法，其中干细胞是造血干细胞。
9. 如权利要求l所述的方法，其中该方法降低至少一种眼睛疾病或失调的症状。
10.如权利要求1所述的方法，其中该眼睛疾病或失调选自由糖尿病视 网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼视网膜色素病变、与年龄相 关的黄斑退行性改变、青光眼、角膜营养不良、视网膜先天性裂(retinoschises)、其Jf特格病变(Stargardt， s Disease)、常染色 体显形玻璃膜疣及贝斯特黄斑营养不良(Best， s macular dystrophy)、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、光损伤、缺血性视网膜 病变、炎症引发的视网膜病变、X伴性青年性视网膜先天性裂、青 光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂 巢状视网膜萎縮所组成的群组。
11. —种聚集干细胞至需要的对象的眼睛组织的方法，其组成包括以阈 下激光剌激眼睛组织，其中剌激的程度是足以使至少一个干细胞聚 集至该组织。
12. 如权利要求11所述的方法，其中使用的工作期为10%或15%。
13. 如权利要求11所述的方法，其中该阈下激光具有自至少约100nm 至2000nm的波长。
14. 如权利要求11所述的方法，其中该阈下激光能自约5mW至200mW。
15. 如权利要求11所述的方法，其中该阈下激光能自约10mW至100mW。
16. 如权利要求11所述的方法，其中该激光以微脉冲投用。
17. 如权利要求11所述的方法，其中微脉冲的持续时间自约0.001毫 秒至1.0毫秒。
18. 如权利要求11所述的方法，其中微脉冲的持续时间为0. 1毫秒。
19. 如权利要求10所述的方法，其中该阈下激光能是在10mW与100mW之间且以0. 1毫秒的脉冲投用。
20. 如权利要求10所述的方法，其中该刺激提高热休克蛋白质的表达或活性，该热休克蛋白质选自由HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及 Hsp40所组成的群组。
21. 如权利要求10所述的方法，其中该剌激改变蛋白质的表达或活性， 该蛋白质选自由SDF-1 、 VEGF 、 HIF-la 、晶状球体蛋白、缺氧 诱导因子l-a (HIF-la)及CXCR-4组成的组。
22. 如权利要求10所述的方法，其中该方法提高至少10倍的Hsp70或 Hsp90多肽的表达。
23. 如权利要求10所述的方法，其中该方法提高至少40倍的Hsp70或 Hsp90多肽的表达。
24. —种聚集干细胞至需要的对象眼睛组织的方法，其包括(a) 向对象投用足够在眼睛组织内引发热休克的量的试剂；及(b) 聚集干细胞至该眼睛组织。
25. —种改善需要的对象眼睛疾病或失调的方法，其包括(a) 向对象投用足够在眼睛组织内引发热休克的量的试剂；及(b) 聚集干细胞至该眼睛组织，从而改善该眼睛疾病或失调。
26. 如权利要求25所述的方法，其中该眼睛疾病或失调是选自由糖尿 病视网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼视网膜色素病变、与年 龄相关的黄斑退行性改变、青光眼、角膜营养不良、视网膜先天性 裂(retinoschises)、斯特格病变(Stargardt， s Disease)、常染 色体显形玻璃膜疣及贝斯特黄斑营养不良(Best， s macular dystrophy)、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、光损伤、缺血性视网膜 病变、炎症引发的视网膜病变、X伴性青年性视网膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂 巢状视网膜萎縮所组成的群组。
27. —种使需要的对象视网膜再生的方法，其包括(a) 向对象投用足够在眼睛组织内引发热休克的量的试剂；及(b) 聚集干细胞至该眼睛组织，从而使视网膜再生。
28. —种修复需要的对象的视网膜色素上皮损伤的方法，其包括a) 向对象投用足够在眼睛组织内引发热休克的量的试剂；及b) 聚集干细胞至该眼睛组织，从而修复该视网膜色素上皮。
29. 如权利要求22-28的任一项所述的方法，其中引发该热休克是使用 小分子化合物。
30. 如权利要求29的方法，其中该小分子化合物选自由格尔德霉素、 雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素、EC102、根赤 壳菌素、二牛;fe牛JL基丙酉同(geranylgeranylacetone)、苟药昔、 PU-DZ8及H-71所组成的群组。
31. 如权利要求22-28的任一项所述的方法，其中引发该热休克是使用 多肽。
32. 如权利要求22-28的任一项所述的方法，其中引发该热休克是使用 包括编码热休克多肽的多核苷酸的表达载体。
33. 如权利要求30或31的方法，其中该热休克多肽选自由Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所组成的群组。
34. 如权利要求22-28的任一项所述的方法，其中该试剂提高热休克蛋 白质的表达或生物活性，该热休克蛋白质选自由HsplOO、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所组成的群组。
35. 如权利要求22-28的任一项所述的方法，其中该试剂改变蛋白质的 表达或活性，该蛋白质选自由SDF-1 、 VEGF 、 HIF-la 、晶状球 体蛋白、缺氧诱导因子卜a (HIF-la)及CXCR-4所组成的群组。
36. 如权利要求22-28的任一项所述的方法，其中该方法提高至少10 倍Hsp70或Hsp90多肽的表达。
37. 如权利要求22-28的任一项所述的方法，其中该方法提高至少40 倍Hsp70或Hsp90多肽的表达或活性。
38. 如权利要求1-28的任一项所述的方法，其中提高造血干细胞动员 作用的试剂是在热休克反应引发前投用于对象。
39. 如权利要求1-28的任一项所述的方法，其中该方法更进一步包括 投用抗炎剂或抗血管生成剂。
40. 如权利要求1-28的任一项所述的方法，其中该方法更进一歩包括 投用支持造血千细胞的存活、增生或转分化的试剂。
41. 如权利要求1-28的任一项所述的方法，其中该对象患有眼睛疾病 或失调，该眼睛疾病或失调选自由糖尿病视网膜病变、脉络膜新生 血管化、青光眼视网膜色素病变、与年龄相关的黄斑退行性改变、 青光眼、角膜营养不良、视网膜先天性裂(retinoschises)、斯特 格病变(Stargardt， s Disease)、常染色体显形玻璃膜疣及贝斯 牛寺黄珍王营养不良(Best， s macular dystrophy)、黄斑囊样水月中、 视网膜脱离、光损伤、缺血性视网膜病变、炎症引发的视网膜病变、 X伴性青年性视网膜先天性裂、青光眼、莫拉蒂致拉分提那斯 (Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂巢状视网膜萎縮所组成的群 组。
42. 如权利要求1-28的任一项所述的方法，其中该方法更进一歩包括投用全反式视黄醛，以增强干细胞成为视网膜色素上皮细胞的转分 化。
43. —种改善需要的对象眼睛疾病或失调的方法，其包括(a) 向该对象投用动员对象的骨髓衍生干细胞的试剂；(b) 在眼睛组织内引发热休克；及(C)聚集该干细胞至眼睛组织，从而改善该眼睛疾病或失调。
44. 如权利要求43所述的方法，其中该试剂是巨噬细胞集落刺激因子或干细胞因子。
45. 如权利要求43所述的方法，其中引发该热休克是使用阈下激光治 疗。
46. 如权利要求43所述的方法，其中引发该热休克是使用为小分子化 合物、多肽或核酸分子的试剂。
47. 如权利要求45所述的方法，其中该小分子化合物选自由格尔德霉 素、雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素、EC102、 根赤壳菌素、二牛龙牛儿基丙酉同(geranylgeranylacetcme)、苟药 苷、PU-DZ8及H-71所组成的群组。
48. 如权利要求43所述的方法，其中该眼睛疾病或失调选自由糖尿病 视网膜病变、脉络膜新生血管化、青光眼视网膜色素病变、与年龄 相关的黄斑退行性改变、青光眼、角膜营养不良、视网膜先天性裂 (retinoschises)、其Jf特格病变(Stargardt， s Disease)、常染色 体显形玻璃膜疣及贝斯特黄斑营养不良(Best ， s macular dystrophy)、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、光损伤、缺血性视网膜 病变、炎症引发的视网膜病变、X伴性青年性视网膜先天性裂、青 光眼、莫拉蒂致拉分提那斯(Malattia Leventinese， ML)及多恩蜂 巢状视网膜萎缩所组成的群组。
49. 一种改善需要的对象黄斑退行性改变的方法，其包括(a) 向该对象投用GM-CSF及/或干细胞因子，其中该投用动员该对 象的骨髓衍生干细胞。(b) 通过投用阈下激光治疗或试剂在眼睛组织中弓I发热休克；及(c) 聚集骨髓衍生干细胞至眼睛组织，从而改善该黄斑退行性改变。
50. 如权利要求49所述的方法，其中该试剂选自由格尔德霉素、雷公 藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素、EC102、根赤壳菌 素、二牛;fe牛JL基丙酉同(geranylgeranylacetone)、苟药一昔、PU—DZ8 及H-71所组成的群组。
51. 如权利要求1-49任一项所述的方法，其中该试剂是通过玻璃体内 或球后注射而投用。
52. 如权利要求49所述的方法，其中该投用引发RPE层的细胞修复。
53. 如权利要求1-49任一项所述的方法，其中该方法更进一步包括投 用编码治疗性多肽的载体。
54. 如权利要求1-49任一项所述的方法，其中该方法更进一步包括向 该对象投用实质上纯化的干细胞。
55. 如权利要求1-49任一项所述的方法，其中该干细胞通过玻璃体内 或球后注射而局部投用。
56. —种聚集干细胞的药学组合物，其包括在药学可接受的赋形剂内的 有效量的小分子化合物，该小分子化合物选自由格尔德霉素、雷公 藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素、EC102、根赤壳菌 素、二牛龙牛儿基丙酉同(geranylgeranylacetone)、苟药昔、PU—DZ8 及H-71所组成的群组，该组合物为眼睛给药而配方。
57. —种在眼睛组织聚集干细胞的药学组合物，该组合物包括在药学可 接受的赋形剂内的表达载体，该表达载体包括编码热休克多肽的多 核苷酸，该组合物为眼睛给药而配方。
58. 如权利要求54所述的药学组合物，其中该热休克多肽选自由 Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 Hsp60及Hsp40所组成的群组。
59. —种在眼睛组织聚集干细胞的药学组合物，该组合物包括在药学可 接受的赋形剂内的多肽，该多肽选自由Hspl00、Hsp90、Hsp70、Hsp60 及Hsp40所组成的群组。
60. —种套组，其包括在眼晴组织引发热休克的有效量的试剂，及使用 该套组提高干细胞聚集的说明指导。
61. 如权利要求60所述的套组，其中该试剂是多肽、多核苷酸或小分 子化合物。
62. 如权利要求60所述的套组，其中该多肽是Hsp100、 Hsp90、 Hsp70、 H印60及Hsp40。
63. 如权利要求第60所述的套组，其中该多核苷酸编码Hspl00、Hsp90、 H印70、 Hsp60及Hsp40。
64. 如权利要求60所述的套组，其中该小分子化合物选自由格尔德霉 素、雷公藤红素、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素、EC102、 根赤壳菌素、二牛龙牛儿基丙酉同(geranylgeranylacetone)、苟药 苷、PU-DZ8及H-71所组成的群组。
65. —种识别提高眼睛组织的千细胞聚集的试剂的方法，其包括(a) 将眼睛细胞与测试化合物接触；(b) 相对于未处理眼睛细胞，识别热休克多肽的表达或活性的提高，从而识别提高干细胞聚集的化合物。
66. —种识别提高眼睛组织的干细胞聚集的试剂的方法，其包括:(a) 将眼睛细胞与测试化合物接触；(b) 识别该组织内干细胞数目的增加。
全文摘要
本发明大体来说是提供聚集(recruiting)干细胞至眼睛组织的方法，该方法包括在眼睛组织使用阈下激光及/或试剂引发热休克。在一些具体例中，在投用动员(mobilize)HSC的试剂后引发热休克。
文档编号A61F2/00GK101267779SQ200680034325
公开日2008年9月17日 申请日期2006年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者M·G·格兰特, S·考沙尔 申请人:福罗里达大学研究基金会有限公司