调节颗粒细胞的凋亡的制作方法

专利名称：调节颗粒细胞的凋亡的制作方法
本申请要求2005年5月18日提交的澳大利亚临时专利申请号2005903782的优先权，其内容通过引用纳入本文。
发明领域 本发明涉及调节颗粒细胞凋亡的方法和组合物。
本发明还涉及调节卵母细胞成熟，调节卵泡闭锁、发育和成熟，调节排卵率以及调节雌性生育力的方法和组合物。

背景技术：
哺乳动物未成熟的卵(卵母细胞)在卵巢的卵泡内生长和发育。未成熟的卵母细胞在代谢上结合于在排卵前围绕卵母细胞并为卵母细胞发育提供营养的体颗粒细胞。卵母细胞对其伴随体颗粒细胞的依赖不仅是为了支持它的生长和发育，而且是为了调节减数分裂的进程。
卵泡发育受增殖、分化和闭锁之间复杂相互作用的驱动。卵巢卵泡闭锁是一种重要的过程，它会造成超过99％的卵母细胞流失。体内和体外研究都已经证实卵泡闭锁贯穿于被称为凋亡的程序性细胞死亡的活性过程。在细胞水平上，凋亡以胞质和细胞核碎裂、染色质凝聚、DNA片段化和胞吞为特征。
可在卵泡发育的至少四种不同细胞区室内抑制凋亡(膜细胞、颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞自身)。在窦状卵泡早期闭锁期间，卵丘细胞和卵母细胞显然仍旧未受闭锁变化影响，此时的闭锁变化主要表现为壁颗粒细胞(mural granulosa cell)的凋亡，而在晚期阶段则为膜细胞凋亡。卵母细胞和颗粒/卵丘细胞相互作用避免凋亡的基质还不清楚。
通常认为卵母细胞在卵泡发育中的作用是被动的，且卵泡发育以及卵子发生是受外部激素驱动的。然而，现在发现似乎卵母细胞也分泌某些促进卵泡发育的因子。卵母细胞对卵泡发生(folliculogenesis)的这种控制似乎是非常重要的，卵母细胞旁分泌因子的表达改变可深刻影响卵母细胞成熟、卵泡发育和生育力这一事实就证明了这一点。
照此，现在的证据暗示卵母细胞通过分泌调节卵泡颗粒细胞功能基础控制元件的旁分泌因子而似乎在调节卵泡生长、以及随后调节卵泡发育和生育力中具有活性作用。
尽管这种卵母细胞-分泌的因子在调节颗粒细胞发育中非常重要，但目前几乎没有关于这种由卵母细胞分泌的参与颗粒细胞发育的因子的特性，以及如何将这种因子的表达用于控制卵泡发生、卵母细胞成熟和生育力的信息。
此外，出于许多原因，目前用于在体外和体内控制卵泡发生、卵母细胞成熟和生育力方法是不够的。因此，需要有新的控制颗粒细胞发育，从而控制卵泡发育、卵母细胞成熟和生育力的方法。
本发明源于发现可通过BMP-15(也称为骨形态发生蛋白-15；GDF-9B)和/或BMP-6(骨形态发生蛋白-6)来调节颗粒细胞的凋亡。因此，本发明涉及一种调节颗粒细胞凋亡的方法和组合物，并涉及调节卵母细胞成熟、卵泡发育和雌性生育力的方法和组合物。
这里作为现有技术提及的专利文献或其他资料不能理解为是承认在本权利要求的优先权日这些文献或资料是已知的，或者其中所含的其他信息是作为公知常识的一部分。
发明概述 本发明提供了一种调节颗粒细胞的凋亡的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
本发明还提供了一种预防和/或治疗雌性对象与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种调节卵母细胞成熟的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种调节卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种调节卵泡成熟的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种调节卵泡闭锁的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种调节卵泡发育的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种调节雌性对象排卵率的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种调节雌性对象生育力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种减轻冻融造成的颗粒细胞凋亡的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
本发明还提供了一种减轻冻融对卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢的损伤的方法，该方法包括使卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢接触以下物质中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的调节卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的调节卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种用于调节颗粒细胞凋亡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种用于培养卵丘卵母细胞复合体和/或卵泡的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种含有以下组分的组合产品 卵母细胞和/或胚胎培养基； BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；和/或 调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和/或 调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂； 其中，所述组分以可加入培养基的形式提供。
本发明还提供了一种用于调节卵母细胞成熟的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种卵母细胞体外成熟培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种用于调节卵母细胞发育能力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种用于改善卵母细胞发育能力的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种预防和/或治疗雌性对象与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种用于培养卵泡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节卵泡颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种卵泡培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高卵泡颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵泡颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种用于调节卵泡闭锁的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节卵泡颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明提供了一种用于调节卵泡发育组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节卵泡颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种用于调节雌性对象排卵率的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种用于调节雌性对象每次卵巢或月经周期中成熟的卵泡数目的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种用于调节雌性对象生育力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种卵母细胞体外成熟培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂； 本发明提供了一种用于培养卵丘卵母细胞复合体和/或卵泡的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂； 其中，所述培养基基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子。
本发明还提供了卵母细胞体外成熟培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂； 其中，所述培养基基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子。
本发明还提供了一种卵泡培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种卵泡颗粒细胞凋亡的试剂； 其中，所述组合物基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子。
本发明还提供了一种组合物或培养基，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂； 该组合物还包含40-400mM NaCl、0.1-20mM KCl和0.1-40mM葡萄糖。
本发明还提供了一种用于减轻冻融造成的颗粒细胞凋亡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)活性BMP-15和/或活性BMP-6； (ii)提高颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)提高颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明提供了一种用于减轻冻融对卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢的损伤的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)有效量的活性BMP-15和/或活性BMP-6； (ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种涉及卵母细胞所生成胚胎的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞和/或胚胎的步骤包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种对卵母细胞体外授精的方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明还提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度；和 (ii)由与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度来评价卵母细胞的发育能力； 其中，凋亡水平降低表明卵母细胞的发育能力增强，而凋亡水平升高表明卵母细胞的发育能力减弱。
本发明还提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定下述一项或多项测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性水平；以及测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性水平；和 (ii)由上述测定的结果来评价卵母细胞的发育能力； 其中，BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性升高和/或依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性升高表明卵母细胞的发育能力增强，而BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性降低和/或依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
本发明还提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定卵母细胞内BMP-15和/或BMP-6的表达水平和/或测定卵母细胞分泌的BMP-15和/或BMP-6的浓度；和 (ii)评价卵母细胞的发育能力； 其中，BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度升高表明卵母细胞的发育能力增强，而BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
本发明起源于对卵母细胞分泌的因子对卵丘细胞凋亡的功效的研究。具体地说，已经发现卵丘-卵母细胞复合体(COC)中存在的卵母细胞能降低卵丘细胞的凋亡水平，而除去卵丘-卵母细胞复合体(卵母细胞切除复合体(oocytectomized complex)；OOX)中的卵母细胞导致凋亡显著增加。此外，卵母细胞-分泌的因子BMP-15和BMP-6可抑制卵母细胞切除复合体内的卵丘细胞凋亡。
这些发现证明BMP-15和/或BMP-6在调节卵丘细胞凋亡中发挥关键作用，且这些因子或者在这些因子控制下的信号传导途径可用来在体外或体内控制颗粒细胞的凋亡，从而控制卵母细胞成熟、卵泡发育、排卵率、每次卵巢或月经周期期间成熟的卵泡数目以及生育力。
将用于整篇说明书的多个术语具有熟练技术人员熟知的含义。然而，为简便起见，现在将定义其中的一些术语。
术语“核酸”用在整篇说明书中应理解为是指用在整篇说明书中应理解为是指任何寡核苷酸或多核苷酸。所述核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。所述核酸可以是任何类型的核酸，包括基因组来源、cDNA来源(即衍生自mRNA)、衍生自病毒、或合成来源的核酸。
术语“多肽”用在整篇说明书中应理解为是指通过肽键结合在一起的两个或多个氨基酸。类似地，术语“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽、或蛋白质序列，以及其片段或部分，还指天然产生的、重组的、突变的或合成的多肽。
术语“调节”用在整篇说明书中应理解为是指进程的抑制或强化，或者特定活性、功能或特征的抑制或增强。
就这点而言，本发明各种形式中所述的对颗粒细胞凋亡的调节是以任何形式控制或改变细胞内凋亡的发生或进展。例如，对凋亡的调节可包括(i)减弱或增强细胞进入凋亡的能力；(ii)减弱或促进凋亡开始后细胞凋亡的进展；和/或(iii)减小或增大特定细胞开始或继续凋亡的可能性。
术语“卵泡发育”及其变化形式用在整篇说明书中应理解为是指卵巢卵泡经原生卵泡到排卵期前卵泡的阶段直至黄体阶段。就这点而言，应理解的是，卵泡可存在于雌性个体对象中，或者可存在于体外，例如分离自雌性对象的卵泡。
术语“卵母细胞成熟”及其变化形式用在整篇说明书中应理解为是指卵母细胞从无法被授精的减数分裂未成熟状态发展到可被授精并能够产生可存活胚胎的减数分裂成熟卵母细胞的过程。应理解，该术语还包括卵母细胞细胞质的成熟，从而卵母细胞能够支持受精后的胚胎发育。就这点而言，应理解，卵母细胞可存在于雌性个体对象中，或者可存在于体外，如分离自雌性对象的卵母细胞。
术语“与...相关联”及其变化形式当用在整篇说明书中涉及一种类型的细胞与另一种类型的细胞相关联时，应理解为是指某细胞与另一种细胞类型直接接触，或者某细胞与另一种类型的细胞共存，从而使得该细胞受到其他细胞类型分泌的因子的作用。例如，就与颗粒细胞相关联的卵母细胞而言，应理解为包括例如，作为卵丘卵母细胞复合体一部分的卵母细胞，或与颗粒细胞、卵丘卵母细胞复合体或卵母细胞切除复合体存在于相同培养基内的裸(denuded)卵母细胞。
术语“变体”当用在整篇说明书中涉及多肽或蛋白质时应理解为是指一个或多个氨基酸被改变的氨基酸序列。变体可具有“保守性”改变，其中被取代的氨基酸与替代氨基酸具有类似的结构或化学特性(例如用异亮氨酸代替亮氨酸)。变体也可以具有“非保守性”改变(例如，用色氨酸代替甘氨酸)或者删除和/或插入了一个或多个氨基酸。
变体还可以是完整大小蛋白质的生物活性片段，即与完整大小的多肽或蛋白质具有类似的结构、调节或生化功能的多肽或蛋白质。例如，生物活性片段可以是氨基或羧基末端被删除的蛋白质、内部被删除的蛋白质、或是这些删除的任意组合。生物活性片段还包括在上述删除后再与一个或多个其他氨基酸融合。
术语“抗体”用在整篇说明书中应理解为是指单克隆或多克隆抗体，以及能够结合表位决定簇的抗体分支片段，如Fab、F(ab’)2和Fv片段。
术语“分离的”当用在整篇说明书中涉及特定细胞时应理解为是指该细胞已被鉴定并从其天然环境的一种或多种组分中分离和/或回收。例如，分离的卵母细胞可与一种或多种卵丘细胞相关联，作为卵丘-卵母细胞复合体的一部分或者以裸露卵母细胞的形式存在。
术语“雌性对象”用在整篇说明书中应理解为是指女性人类、雌性哺乳动物或其他雌性动物，其中颗粒细胞的凋亡在BMP-15和/或BMP-6控制之下发生，所述哺乳动物包括灵长类、家畜(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)、陪伴动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)。
术语“辅助生殖”用在整篇说明书中应理解为是指用于人类和动物的涉及分离的卵母细胞和/或分离的精子的任何授精技术，包括采用体外培养卵母细胞或胚胎的技术(例如卵母细胞体外成熟)、体外授精(IVF；抽取卵母细胞，在实验室授精并将胚胎移植到受者)、配子输卵管内移植(GIFT；将卵母细胞和精子放置到输卵管内)、合子输卵管内移植(ZIFT；将受精卵母细胞放置到输卵管内)、输卵管胚胎移植(TET；将分裂中的胚胎放置到输卵管内)、配子腹腔内移植(POST；将卵母细胞和精子放置到骨盆腔内)、精子卵浆内注射技术(ICSI)、睾丸精子提取(TESE)和显微外科附睾支精子抽取术(MESA)。
附图简述

图1显示了通过TUNEL(绿色标记)检测到的卵丘细胞内DNA片段化的共焦激光扫描显微术的典型图像。所有细胞核还用碘化丙锭染色(红)。阳性对照DNA酶1-处理的OOX显示出非常强烈的凋亡染色(99％)(A)，阴性对照不显示任何表现为特定标记的凋亡信号(0％)(B)，COC显示出低凋亡标记(9％)(C)，而OOX显示出较高凋亡标记(35％)(D)。
图2显示了在存在(A)或不存在(B)FSH时卵母细胞-分泌的因子对卵丘细胞凋亡的剂量效应。将卵母细胞切除复合体(OOX)与数目递增的裸卵母细胞(DO)一起培养，在最大剂量时有效地将凋亡降低到了对照COC的水平。各点代表了凋亡卵丘细胞的平均百分数(平均值±SEM)。用不同标号a、b、c表示的各点的值差异显著(p＜0.001)。
图3显示了与OSF靠近程度相关的卵丘复合体内的凋亡模式。COC和OOX的直径采用共焦显微术测量并分为3层内层、中层和外层，各层占半径的33％(A)。最靠近卵母细胞的凋亡发生率最低([C]，COC内层；与之相对的是[D]，OOX外层)，随着远离卵母细胞发生率逐渐升高(B)。*处理X层(双向ANOVA；P＝0.026)。
图4显示了推定卵母细胞-分泌的因子GDF-9、BMP-6、BMP-15对卵丘细胞凋亡的剂量效应。在不存在(A、C、E)或存在(B、D、F)FSH的条件下，将OOX与递增浓度的GDF-9(0-175ng/ml)、BMP-6(0-100ng/ml)和BMP-15(0-20％v/v)一起培育。GDF-9对于卵丘细胞凋亡没有影响，BMP-6以剂量依赖模式减弱凋亡，但BMP-15的作用更加显著。各点代表凋亡卵丘细胞的平均百分数(平均值±SEM)。用不同标号a、b、c表示的各点的值差异显著(A-B；p＜0.001)。星号表示就该因子而言相比对照(OOX)显著不同(p＜0.001)(C-F)。
图5显示了通过Western印迹分析检测到的DO、GDF-9和BMP-15对于OOX表达Bcl-2和Bax蛋白的影响。对每组35个OOX进行以下处理然后加载到各泳道中泳道1，10％v/v 293H(对照条件培养基)；泳道2，对照(仅OOX)；泳道3，132ng/mlGDF-9；泳道4，10％v/v BMP-15；泳道5，0.7DO/μl。条带强度通过密度测定法量化并表示成经三份复制实验得到的相比293H对照的相对值(平均值±SEM)。每组中用不同上标表示的柱(a-bBcl-2，y-zBax)是显著不同的(P＜0.001)。
图6显示DO、BMP-6和BMP-15对卵丘细胞避免星形孢菌素-诱导的凋亡的保护。使单独的OOX或与35DO、10ng/ml BMP-6、或10％v/v BMP-15共培养的OOX在培育的最后6个小时接触0.1μM或1.0μM星形孢菌素(STS)。卵母细胞、BMP-6和BMP-15都能防止星形孢菌素-诱导的卵丘细胞凋亡。星号表示OOX的平均值明显不同于OOX对照(p＜0.001)。
图7显示了BMP拮抗剂对卵丘细胞凋亡的影响。在存在递增剂量的促滤泡素抑制素(0-100μg/ml)时将OOX与10％v/v BMP-15一起培育(A)，并在不存在或存在高中和剂量(20μg/ml)的BMP-6中和抗体(NAb)时将OOX与10ng/ml BMP-6一起培育(B)。促滤泡素抑制素可拮抗BMP-15对卵丘细胞凋亡的抑制。NAb能有效拮抗BMP-6的抗凋亡作用。各点和柱表示凋亡卵丘细胞的平均百分比(平均值±SEM)。用不同标号a、b、c表示的各点的值明显不同(p＜0.001)。
图8显示了BMP-15和BMP-6在卵母细胞对卵丘细胞抗凋亡作用中的功效。用50μg/ml促滤泡素抑制素、20μg/ml BMP-6Nab或这两者的组合处理与裸卵母细胞(25DO)共培养的OOX(A)。促滤泡素抑制素和BMP-6Nab都有效地部分拮抗卵母细胞的抗凋亡作用，但无论是单用或是联用都不能使凋亡完全恢复至OOX水平。将OOX与DO共培养或单独用BMP-15或BMP-6处理能降低卵丘细胞凋亡(B)。用BMP-6和BMP-15的组合处理OOX不会比单独用BMP-15更进一步降低凋亡水平，这说明这两种BMP没有累加效应。各柱表示凋亡卵丘细胞的平均百分比(平均值±SEM)。用不同标号a、b、c表示的各柱的值明显不同(p＜0.001)。
图9显示了BMP-7及其拮抗剂grem蛋白(gremlin)对卵丘细胞凋亡的效应。在存在递增剂量的grem蛋白(0-40μg/ml)时将OOX与10％BMP-15一起培养(A)。还在存在或不存在2μg/ml grem蛋白时将OOX与100ng/ml BMP-7和/或10％BMP-15共培养(B)。Grem蛋白不拮抗BMP-15对卵丘细胞凋亡的抑制效应，但拮抗BMP-7对卵丘细胞凋亡的抑制效应。各点和柱表示凋亡卵丘细胞的平均百分比(平均值±SEM)。用不同标号a、b、c表示的各柱的值明显不同(p＜0.001)。
图10显示了IVM期间在存在或不存在裸卵母细胞时共培养卵丘-卵母细胞复合体的结果。在IVM之后将复合体和卵母细胞分成6个处理组。裸卵母细胞(A)；卵丘-卵母细胞复合体(B)；在0小时与裸卵母细胞共培养的卵丘-卵母细胞复合体(C)；在0小时与卵丘-卵母细胞复合体共培养的裸卵母细胞(D)；培养卵丘-卵母细胞复合体9小时，然后与裸卵母细胞共培养IVM最后的15小时(E)；培养卵丘-卵母细胞复合体9小时，之后裸化，然后与卵丘-卵母细胞复合体共培养IVM最后的15小时(F)。
图11显示了IVM期间将完全卵丘卵母细胞-复合体与或不与裸卵母细胞共培养对随后卵母细胞发育时卵裂率的影响。在IVM期间将卵丘-卵母细胞复合体随机分成4个处理组。IVM之后，将所有的复合体和卵母细胞授精并在第2天评价卵裂率。各柱表示凋亡卵丘细胞的平均百分比。各柱表示卵裂率的平均百分比(平均值±SEM)。用不同标号a、b、c表示的各柱的值明显不同(p＜0.001)。
图12显示了在IVM期间将完全COC与DO共培养对随后胚胎发育能力的影响。在体外成熟(IVM)期间将卵丘-卵母细胞复合体随机分成4个处理组。IVM之后，将所有复合体和卵母细胞授精并在第8天评价所形成胚泡的质量。各柱表示卵裂率的平均百分比(平均值±SEM)。用不同标号a-e表示的各柱的值明显不同(p＜0.001)。
图13显示了ALK4/5/7抑制剂对GDF-9和卵母细胞诱导的卵丘扩展的影响。
图14显示了ALK4/5/7抑制剂对GDF-9、TGF-β1或卵母细胞诱导的DNA合成的影响(图A)，以及不同浓度的抑制剂对GDF-9和卵母细胞诱导的DNA合成的影响(图B)。
图15显示了不同浓度的ALK4/5/7抑制剂对TGF-β1刺激的CAGA萤光素酶活性的影响。
图16显示了来自不同大小卵泡的卵母细胞的GDF9mRNA表达。手工摘取卵泡并分成3种大小的类别外周窦、小窦和大窦。采集各种大小的卵丘-卵母细胞复合体(COC)并剥去它们的卵丘细胞(CC)。用Qiagen Micro Rneasy试剂盒提取卵母细胞的RNA。采用随机六聚物逆转录RNA并通过PCR扩增。-ve RT无逆转录酶；-ve PCR无DNA聚合酶，+ve阳性组织样品(卵巢)。
图17显示了来自不同大小卵泡的颗粒细胞(GC)的受体/信号mRNA表达。采集各卵泡大小的1×105GC并提取总RNA。采用随机六聚物逆转录GC RNA并通过PCR扩增。-ve RT无逆转录酶；-ve PCR无DNA聚合酶，+ve阳性组织样品(卵巢)。
图18显示了GDF9和卵母细胞对TGF-β信号传导途径的活化。用Smad 3-反应性CAGA-萤光素酶受体构建物(A)或Smad 1-反应性BRE-萤光素酶受体构建物(B)瞬时转染来自大卵泡的MGC。细胞随后不处理，用0.5ng/ml TGFβ1、88-265ng/ml GDF9、50ng/ml BMP7处理，或与60个小鼠卵母细胞共培养。将细胞培养48小时(h)，之后测量细胞提取物的萤光素酶活性。各柱表示3份复制实验的平均值+/-SEM，表达为相比对照变化的倍数。
图19显示了用ALK4/5/7激酶抑制剂SB431542对GDF9-刺激的壁颗粒细胞DNA合成的抑制。将来自大窦状卵泡的壁GC培养24小时，并用175ng/ml GDF9刺激胸苷掺入。ALK4/5/7激酶抑制剂SB-431542剂量依赖性地抑制GDF9刺激的胸苷掺入。各柱/点表示3份复制实验的平均值+/-SEM，表达为相比对照变化的倍数。
图20显示了GDF9和卵泡大小对壁颗粒细胞DNA合成的影响。将来自外围窦状卵泡、小窦状卵泡和大窦状卵泡的壁GC在175ng/ml GDF9存在下培养24小时。培养期结束时评价3H-胸苷掺入。各柱表示8份复制实验的平均cpm/12,500细胞+/-SEM。我们在该研究中不是只采用了7个动物吗？？ 图21显示了GDF9和卵泡大小对壁颗粒细胞DNA合成的影响。将来自小窦状卵泡和大窦状卵泡的壁GC用递增剂量的GDF9(0-350ng/ml)处理24小时。培养期结束时测量3H-胸苷掺入。各点表示7份复制实验的平均cpm/12,500细胞+/-SEM。
图22显示了与FSH和/或IGF-1组合的GDF9对壁颗粒细胞DNA合成的影响。将来自小(A)或大(B)窦状卵泡的壁GC与GDF9(175ng/ml)、rhFSH(50mlU/ml)和IGF-1(25ng/ml)的组合一起培养24小时。各柱表示7份复制实验的平均cpm/12,500细胞+/-SEM。
图23显示了GDF9+/-BMP 15对壁颗粒细胞DNA合成的影响。将来自来自小(A)或大(B)窦状卵泡的壁GC与单独的GDF9(175ng/ml)或单独的BMP15(10％)或这两者的组合一起培养。各柱表示3份复制实验的平均值+/-SE。
图24显示了在IVM期间使COC接触卵母细胞-分泌的因子(OSF)的实验设计的示意图。在IVM期间将COC单独培养或与浓度为0.5DO/μl的裸卵母细胞共培养(COC+DO)。随后对卵母细胞授精并用胚胎发育来评价卵母细胞的发育能力。
图25显示了在IVM期间在存在或不存在GDF9拮抗剂SB-431542的条件下用GDF9处理完全COC对随后的卵裂(A)和发育能力(B)的影响。IVM之后，对所有复合体授精，在第2天评价卵裂率并在第8天评价胚泡形成。293H是来自未转染293H细胞的对照-条件培养基。各柱表示百分比(平均值±SEM)，图中用不同标号a-d表示的柱和柱组显著不同(p＜0.05)。SB-431542对卵裂率没有影响，但293H有影响。
图26显示了在IVM期间在存在或不存在促滤泡素抑制素的条件下用BMP 15处理完全COC对随后的卵裂(A)和发育能力(B)的影响。IVM之后，对所有复合体授精，在第2天评价卵裂率并在第8天评价胚泡形成。293H是来自未转染293H细胞的对照-条件培养基。各柱表示百分比(平均值±SEM)，图中用不同标号a-d表示的柱和柱组显著不同(p＜0.05)。促滤泡素抑制素对卵裂率没有影响，但293H有影响。
图27显示本项研究得出的假设模型的示意图。使COC在卵母细胞成熟阶段接触卵母细胞-分泌的因子(OSF)能大大提高随后卵母细胞的发育能力(从约40％到约60％)，所述卵母细胞-分泌的因子可以是天然形式的，即未明确鉴定的卵母细胞所分泌生长因子的混合物，或是外源重组的BMP 15或GDF9。已知OSF能调节多种卵丘细胞功能，该模型提示，其中可能包括回到卵母细胞(粗箭头)并改善随后的发育的正调节因子。
发明详述 如上所述，在一种形式中，本发明提供了一种调节颗粒细胞的凋亡的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
在本发明该形式中，可通过(i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；和/或(ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和/或(iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制或促进颗粒细胞的凋亡。
例如，本发明该形式的方法可用于通过使颗粒细胞接触升高了浓度的BMP-15和/或BMP-6来抑制颗粒细胞的凋亡。或者，可通过降低颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度来促进颗粒细胞的凋亡。
就这点而言，BMP-15和BMP-6都是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员，该超家族包括生长因子和分化因子大家族。这些蛋白质合成之初为前肽，经切割，然后加工而成为二聚蛋白。BMP-15结合ALK-6和BMPR-II受体，而BMP-6结合ActRII和BMPR-II受体。
就BMP-15而言，这种蛋白质即可形成同型二聚体，也可与GDF-9形成杂二聚体。
本发明还提供了一种按照该方法制造的具有改变的凋亡或凋亡潜能的颗粒细胞。所述颗粒细胞可以是，例如，分离的颗粒细胞，存在于体内的颗粒细胞，存在于体内或体外卵泡内的颗粒细胞，作为体外或体内卵丘卵母细胞复合体一部分的颗粒细胞，或是作为卵母细胞切除复合体一部分的颗粒细胞。
本发明还适用于通过调节颗粒细胞的凋亡水平来预防和/或治疗雌性雌性对象的与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种预防和/或治疗雌性对象与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
例如，本发明可用于预防和/或治疗雌性对象的颗粒细胞肿瘤或多囊性卵巢综合征。
本发明还适用于通过调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡水平来调节卵母细胞成熟。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种调节卵母细胞成熟的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了按照该方法制造的成熟度改变的卵母细胞。所述卵母细胞可以是，例如，分离的卵母细胞，存在于体内的卵母细胞，作为体外或体内卵丘卵母细胞复合体一部分的卵母细胞，或是作为体外或体内卵泡一部分的卵母细胞。本发明还涉及由该卵母细胞产生的胚胎和非人动物。
这种情况中，应理解，该方法尤其适合在体外调节卵母细胞的成熟度。
本发明还适用于通过调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡水平来调节卵母细胞的发育能力。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种调节卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了按照该方法制造的发育能力改变的卵母细胞。所述卵母细胞可以是，例如，作为体外或体内卵丘卵母细胞复合体一部分的卵母细胞，或是存在于卵泡内的卵母细胞。本发明还涉及由该卵母细胞产生的胚胎和非人动物。
这种情况中，应理解，该方法尤其适合在体外调节卵母细胞的发育能力。
本发明还适用于通过调节卵泡颗粒细胞的凋亡水平来调节卵泡的成熟。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种调节卵泡成熟的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种按照该方法制造的成熟度改变的卵泡。所述卵泡可以是，例如，分离的卵泡或是存在于体内的卵泡。本发明还涉及分离自该卵泡的卵母细胞以及由该卵母细胞产生的胚胎和非人动物。
这种情况中，应理解，该方法尤其适合在体外调节卵泡的成熟度。
本发明还适用于通过调节颗粒细胞的凋亡水平来调节卵泡闭锁。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种调节卵泡闭锁的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种按照该方法制造的闭锁程度改变的卵泡。所述卵泡可以是分离的卵泡或是存在于体内的卵泡。本发明还涉及分离自该卵泡的卵母细胞以及由该卵母细胞产生的胚胎和非人动物。
在优选的形式中，本发明提供了对雌性对象卵泡闭锁的调节方法。
本发明还适用于通过调节卵泡颗粒细胞的凋亡水平来调节卵泡发育。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种调节卵泡发育的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
本发明还提供了一种按照该方法制造的发育或发育潜能改变的卵泡。所述卵泡可以是分离的卵泡或是存在于体内的卵泡。本发明还涉及分离自该卵泡的卵母细胞以及由该卵母细胞产生的胚胎和非人动物。
本发明还适用于通过调节对象颗粒细胞的凋亡水平来调节雌性对象的排卵率。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种调节雌性对象排卵率的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
本领域已知测定雌性对象排卵率的方法。
本发明还适用于通过调节对象颗粒细胞的凋亡水平来调节雌性对象的生育力。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种调节雌性对象生育力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
应理解，本发明可用于提高生育力，或者可用作避孕方法。
本发明各种形式中的颗粒细胞可以是存在于体外或体内的任何颗粒细胞。例如，所述颗粒细胞可以是细胞培养物中的分离的颗粒细胞，在细胞培养物中与一种或多种其他细胞类型相关联的颗粒细胞，作为卵丘-卵母细胞复合体一部分的颗粒细胞，作为卵母细胞切除复合体一部分的颗粒细胞，存在于卵泡内的体外颗粒细胞，或是存在于体内的形成雌性哺乳动物卵泡一部分的颗粒细胞。
就体外颗粒细胞而言，优选该颗粒细胞与卵母细胞相关联。更优选地，该颗粒细胞是卵丘细胞。最优选地，该颗粒细胞是存在于卵丘-卵母细胞复合体内的卵丘细胞。
本发明各种形式中的颗粒细胞也可以是前-颗粒细胞、前窦状颗粒细胞、壁颗粒细胞、卵丘颗粒细胞、颗粒-黄体细胞、或是压缩或扩展的卵丘颗粒细胞。
就体内的颗粒细胞而言，所述颗粒细胞可以(例如)形成雌性对象卵泡的一部分。
应理解，本发明各种形式中所述的对凋亡的调节可在体外或体内对与颗粒细胞相关联的卵母细胞授精之前、之间或之后的任何时刻发生。
优选地，对凋亡的调节在授精前发生。
优选地，所述颗粒细胞是雌性哺乳动物的颗粒细胞，或是存在于雌性哺乳动物内的形成卵泡一部分的颗粒细胞，包括人颗粒细胞、非人灵长类颗粒细胞、绵羊(ovine)颗粒细胞、牛颗粒细胞、猪颗粒细胞、马颗粒细胞、山羊颗粒细胞、猫颗粒细胞、啮齿类颗粒细胞、犬颗粒细胞或鼠科颗粒细胞。优选地，所述颗粒细胞是人颗粒细胞、牛颗粒细胞、绵羊颗粒细胞马颗粒细胞。
就存在于体外的颗粒细胞而言，所述颗粒细胞可通过本领域已知的合适方法从处于卵泡发生任何阶段的合适供体或从处于超数排卵阶段的合适供体获得。获得供体外使用的颗粒细胞的合适方法描述于Gilchrist RB等，(2001)Developmental Biology240289-298(用于小鼠细胞)，和Gilchrist RB等，(2003)Molecular，CellularEndocrinology 20187-95(用于反刍动物细胞)。例如，颗粒细胞可从经激素刺激或未刺激的、未成熟或成熟的卵巢获得，并可通过刺穿或抽吸窦状卵泡或用酶消化卵巢来采集颗粒细胞，然后通过除去碎片和离心来纯化/富集颗粒细胞。
本发明各种形式中颗粒细胞的凋亡程度可通过本领域已知的合适方法来确定，这些方法包括(i)DNA片段化试验，例如末端脱氧核苷酸转移酶-介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)，这是一种检测在凋亡过程中发生的核小体间(internucleosomal)切割期间暴露的DNA 3’-OH末端的原位方法，并且可基本按照以下文献描述来进行Hensey C.和Gautier J.(1998).Dev.Biol.203.36-48；Veenstra，GJ，Peterson-Maduro J，Mathu MT，van der Vliet PC，Destree OHJ.(1998).CellDeath Differ 5774-84.；(ii)检测与凋亡有关的形态变化，基本上如Compton MM(1992)Cancer Metast Rev 11105-119，1992；Wyllie AH(1992)Cancer Metast Rev 1195-103；Oltvai ZN，KorsmeyerSJ(1994)Cell 79189-192，1994所述；或(iii)采用流式细胞计数分析来检测凋亡，基本上如Ormerod MG，Collins MKL，Rodriguez-Tarduchy G，Robertson D(1992)JImmunol Meth 15357-66；Jacobs DP，Pipho C(1983)J Immunol Meth 62101-110所述。
对于存在于体内的颗粒细胞，颗粒细胞的凋亡程度可通过本领域已知的合适方法来检测。例如，可通过Western分析来检测促凋亡蛋白(如Bax)或抗凋亡蛋白(如Bcl-2)的表达。
如上所述，本发明也适用于预防和/或治疗雌性对象与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况。例如，本发明可用于通过提高致肿瘤细胞的凋亡水平来预防和/或治疗颗粒细胞肿瘤。或者，本发明可用于预防和/或治疗多囊性卵巢综合征。
应理解，可在所述疾病或状况发生之前、期间或之后给予对象BMP-15和/或BMP-6，和/或调节颗粒细胞内依赖于BMP-15或BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
此外，一些治疗，如化疗，导致卵泡闭锁水平升高。因此，本发明可用于通过降低接受治疗者颗粒细胞的凋亡水平来改善这种症状。这种情况中，可在减少闭锁的治疗之前、之间和/或之后来降低对象颗粒细胞的凋亡水平。
可通过多种不同方法实现调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性。例如，就升高这些蛋白质之一或两者的浓度而言，可使颗粒细胞暴露于、或接触这些蛋白质。
就这点而言，应理解，提及BMP-15时包括来自合适物种用以调节靶颗粒细胞凋亡的蛋白质(包括与要调节凋亡的颗粒细胞来自相同物种的蛋白质)，该蛋白质的变体(如与野生型相比有一个或多个氨基酸取代的蛋白质形式)，或者该蛋白质的生物活性片段。该蛋白质可以是分离的蛋白质、重组蛋白、纯化或半纯化的、或是蛋白质复杂混合物(例如来自卵母细胞的条件培养基中的那样)的一部分。
类似地，当提及BMP-6时包括来自要合适物种用以调节靶颗粒细胞凋亡的蛋白质(包括使用与要调节凋亡的颗粒细胞相同物种的蛋白质)，该蛋白质的变体(如与野生型相比有一个或多个氨基酸取代的蛋白质形式)，或者该蛋白质的生物活性片段。该蛋白质可以是分离的蛋白质、重组蛋白、纯化或半纯化的、或是蛋白质复杂混合物(例如来自卵母细胞的条件培养基中的那样)的一部分。
如上所述，被递送的蛋白质可以是纯化、半纯化的蛋白质或是卵母细胞-条件培养基和/或卵母细胞-分泌因子的形式。制造蛋白质的方法是本领域已知的。例如，被递送的蛋白质的形式可以是含有一种或多种其他组分的提取物，如使颗粒细胞接触含有卵母细胞分泌的BMP-15和/或BMP-6的条件培养基。
就降低BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性而言，例如可通过使颗粒细胞接触含有降低了浓度的蛋白质的培养基，或通过使用这些蛋白质的中和抗体来实现活性的降低。降低蛋白质浓度或活性的其他方法包括使用ALK6和/或BPMPRII受体的外功能区。促滤泡素抑制素可与BMP-15形成无活性的复合体从而降低BMP-15的浓度。
也可用反义核酸和siRNA技术调节卵母细胞中BMP-15和BMP-6的表达从而调节卵母细胞分泌的这些蛋白质的水平。因此，本发明在一种形式中包括在卵母细胞中加入反义核酸或siRNA以降低卵泡内BMP-15和/或BMP-6的表达，从而提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度。设计和施用反义核酸和siRNA的方法是本领域已知的。
应理解，促进或干扰参与卵丘卵母细胞复合体内凋亡的卵母细胞分泌因子的梯度(gradient)的试剂也可用于调节颗粒细胞的凋亡水平。
还应理解，还可用其他因子进一步调节颗粒细胞的凋亡水平。例如，使细胞接触FSH可用于降低凋亡的发生率。
优选地，调节依赖于BMP-15或BMP-6的信号传导途径的活性就是调节ALK6和/或BMPRII受体信号传导途径。
就这点而言，对ALK6和/或BMPRII途径的调节导致对细胞SMAD 1/5/8途径的调节。
调节GDF-9/BMP-15杂二聚体的活性和/或浓度也可用于调节颗粒细胞凋亡。因此，本发明的各种形式还包括调节颗粒细胞所接触的GDF-9/BMP-15杂二聚体的浓度，和/或调节颗粒细胞内依赖于GDF-9/BMP-15杂二聚体的信号传导途径的活性。
例如，在一种形式中，本发明提供了一种调节颗粒细胞的凋亡的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节颗粒细胞所接触的GDF-9/BMP-15杂二聚体的浓度；和 (ii)调节颗粒细胞内依赖于GDF-9/BMP-15杂二聚体的信号传导途径的活性。
还应了解，本发明适用于降低冻融损伤诱导的凋亡。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种减轻冻融造成的颗粒细胞凋亡的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
可在冷冻之前和/或之后调节活性BMP-16和/或活性BMP-6的浓度或调节依赖于BMP-15或BMP-6的信号传导途径的活性。
卵丘卵母细胞复合体、完整卵泡、卵巢组织或完整卵巢当冷冻时常会由于冻/融而死亡。因此，本发明还适用于减轻冻融对这些细胞/组织造成的损伤。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种减轻冻融对卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢的损伤的方法，该方法包括使卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢接触以下物质中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的调节卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的调节卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
可在冷冻之前和/或解冻之后来调节活性BMP-16和/或活性BMP-6的浓度或调节依赖于BMP-15或BMP-6的信号传导途径的活性。
优选地，本发明各种形式中的调节依赖于BMP-15或BMP-6的信号传导途径的调节活性的试剂能提高这些途径的活性，从而降低颗粒细胞的凋亡水平。
在本发明各种形式中，可通过合适的方法来调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性。例如，可使颗粒细胞接触BMP-7、BMP-4和BMP-2中的一种或多种来调节BMPRII受体的活性。
可通过合适的方法实现调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
优选地，可通过使颗粒细胞接触含有有效量的BMP-15和/或BMP-6的组合物，或通过使细胞接触含有能抑制或促进细胞内BMP-15和/或BMP-6信号传导途径的试剂的组合物来调节凋亡。
因此，在优选的形式中，本发明还提供了一种用于调节颗粒细胞凋亡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
所述颗粒细胞可存在于体外或体内。例如，所述颗粒细胞可作为体外卵丘卵母细胞复合体的一部分存在，或者所述颗粒细胞可作为雌性对象卵泡的一部分。
在特别优选的形式中，所述组合物是用于在体外降低卵丘卵母细胞复合体中和/或卵泡中颗粒细胞凋亡的培养基。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于培养卵丘卵母细胞复合体和/或卵泡的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
所述有效量是降低颗粒细胞凋亡的量。
应理解，BMP-15和/或BMP-6，和/或调节依赖于BMP-15的信号传导途径的调节活性的试剂，和/或调节依赖于BMP-6的信号传导途径的调节活性的试剂，也可用作是胚胎和/或卵母细胞的培养基添加物。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种包含以下组分的组合产品 卵母细胞和/或胚胎培养基； BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；和/或 调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和/或 调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂； 其中，所述组分以培养基添加组分的形式加入培养基。
所述组合产品可用于这里所述的任何应用。
所述培养基以及本发明各种组合产品中的其他各种组分可单独包装在合适的容器(优选灭菌容器)内，所述容器如安瓿、瓶子或小瓶，其形式可以是多剂次或单位剂量形式。在填装后可将容器气密密封。蛋白质组分可以分离的形式或以纯化或半纯化形式存在，并且可含有其他有助于蛋白质的稳定性和/或使用的添加物。包装不同组分的方法是本领域已知的。
该组合物也可用于通过调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡水平来调节卵母细胞成熟。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于调节卵母细胞成熟的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂。
如上所述，所述组合物尤其适合配制使卵母细胞体外成熟的培养基。
因此，在另一种形式中，本发明提供了卵母细胞体外成熟培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
所述有效量是降低颗粒细胞凋亡的量。
所述组合物也可用于通过调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡水平来调节卵母细胞的发育能力。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于调节卵母细胞发育能力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂。
所述组合物尤其适合配制用于改善卵母细胞体外发育能力的培养基。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于改善卵母细胞发育能力的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
所述有效量是降低颗粒细胞凋亡的量。
或者，可将该组合物给予雌性对象以预防和/或治疗雌性对象的与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况。这种疾病或状况的例子包括颗粒细胞肿瘤和多囊性卵巢综合征。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于预防和/或治疗雌性对象的与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
也可将该组合物给予对象以预防和/或治疗诸如化疗等治疗对对象造成的损伤。
该组合物也可用于培养卵泡。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于培养卵泡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节卵泡颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂。
所述组合物尤其适合配制用于体外培养卵泡的培养基。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种卵泡培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高卵泡颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵泡颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
所述有效量是降低颗粒细胞凋亡的量。
该组合物也可用于通过调节卵泡内颗粒细胞的凋亡水平来调节卵泡闭锁。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于调节卵泡闭锁的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节卵泡颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂。
该组合物可用于体外或体内的卵泡。对于体外的卵泡，该组合物的形式可以是用于调节闭锁的培养基。
该组合物也可用于通过调节卵泡颗粒细胞的凋亡水平来调节卵泡发育。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于调节卵泡发育的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节卵泡颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞凋亡的试剂。
该组合物可用于体外或体内的卵泡。对于体外的卵泡，该组合物的形式可以是用于调节卵泡发育的培养基。
该组合物也可用于通过调节雌性对象颗粒细胞的凋亡水平来调节雌性对象的排卵率。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于调节雌性对象排卵率的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
该组合物也可用于通过调节对象颗粒细胞的凋亡水平来调节雌性对象每次卵巢或月经周期中成熟的卵泡数目。
因此，在另一种形式中，本发明还提供了一种用于调节雌性对象每次卵巢或月经周期中成熟的卵泡数目的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
该组合物也可用于通过调节雌性对象颗粒细胞的凋亡水平来调节雌性对象的生育力。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于调节雌性对象生育力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
本发明的组合物可用于提高生育力，或者可用作避孕药。
例如，当试剂能降低凋亡时，给予所述组合物能提高雌性对象的生育力。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于提高雌性对象生育力的组合物，该组合物包含有效量的通过提高对象颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来降低雌性对象颗粒细胞凋亡的试剂，和/或有效量的通过提高颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来降低雌性对象颗粒细胞凋亡的试剂。
例如，所述可以是BMP-15或BMP-6。
当所述试剂能促进凋亡时，当将该组合物给予雌性对象时可作为避孕组合物使用。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种避孕组合物，该组合物包含有效量的通过降低对象颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来提高雌性对象颗粒细胞凋亡的试剂，和/或有效量的通过降低颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来提高雌性对象颗粒细胞凋亡的试剂。
例如，所述试剂可以是BMP-15或BMP-6的合适的拮抗剂抗体，或可溶形式的BMPRII受体。
当本发明各种形式中的试剂抑制BMPR-II和/或ALK6受体的活性时，该试剂可通过降低与该受体结合的一种或多种卵母细胞-分泌因子的浓度来干扰受体的活性，该试剂可通过结合该受体从而作为拮抗剂来干扰受体的活性，该试剂可通过使该受体的结构发生构象变化来干扰受体的活性，该试剂可干扰BMPR-II受体和ALK6受体之间形成杂二聚体，该试剂可干扰受体信号转导过程中一种或多种胞内蛋白质的磷酸化作用，或者该试剂可调节细胞内一种或多种因子的浓度(包括受体的表达)，从而干扰该受体的信号传导活性。
当试剂抑制受体的活性时，较好的是，试剂通过降低与受体结合的一种或多种卵母细胞分泌因子的浓度，或者通过降低颗粒细胞内Smad1和/或Smad5和/或Smad8的磷酸化作用来抑制所述活性。
当试剂提高受体的活性时，试剂可有效激活或促进与受体结合的一种或多种卵母细胞-分泌因子的结合，试剂可其受体激动剂的作用，试剂可通过使受体结构发生构象变化来提高受体的活性，试剂可促进BMPR-II受体和ALK6受体之间形成杂二聚体，试剂可促进受体信号转导过程中一种或多种胞内蛋白质的磷酸化作用，或者，试剂可调节一种或多种细胞因子的浓度(包括该受体的表达)，从而促进受体的信号传导活性。
可调节BMPRII和/或ALK6受体活性的试剂类型例如蛋白质、抗体、适体、反义核酸、反义寡核苷酸、siRNA、多肽、肽、小分子、药物、多糖、糖蛋白和脂质。
例如，当试剂抑制BMPR-II的活性时，本发明各种形式中的试剂可以是(i)可溶形式的BMPR-II受体，它能够竞争性结合一种或多种与膜结合受体相结合的卵母细胞-分泌因子，从而降低能够结合该受体的一种或多种卵母细胞-分泌因子的浓度；(ii)反义寡核苷酸，它能降低颗粒细胞表面表达的BMPR-II的浓度；(iii)在颗粒细胞内由BMPR-II/-I型杂二聚体干扰Smad1和/或Smad5和/或Smad8的磷酸化作用的试剂；或(v)用BMPR-II胞外结构域培养所得或以其为靶标的抗体，它能够竞争性结合该受体从而降低一种或多种卵母细胞-分泌的生长因子与之结合。
当试剂抑制BMPR-II和ALK6受体之一或两者的活性时，较好的是，试剂通过抑制依赖于BMP-15的刺激作用(包括GDF-9/BMP-15杂二聚体的刺激作用)或抑制依赖于BMP-6的刺激作用来抑制这种活性。
可用本领域已知的合适方法来确定某试剂能调节颗粒细胞内BMP-15和/或BMP-6信号传导。
优选地，所述试剂通过调节颗粒细胞内Smad1和/或Smad5和/或Smad8的磷酸化作用来调节依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性。
可通过本领域已知的合适方法来确定某试剂调节Smad1和/或Smad5和/或Smad8磷酸化作用的能力。
当BMPR-II或ALK6活性抑制试剂是BMPR-II的反义核酸时，该试剂可以是与受体的全部或部分核苷酸序列互补的核酸。
反义核酸可包括DNA或RNA，或者它的任何修饰物或衍生物。反义核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。在本发明优选的形式中，所述试剂是DNA反义寡核苷酸。
当反义核酸是反义寡核苷酸时，可在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链上对该寡核苷酸进行修饰，并可包括其他附加基团以提升该反义核酸的功能。
可用本领域公知的成分在该寡核苷酸结构的任何位置上对其进行修饰。例如，所述反义寡核苷酸可包括至少一个选自下组的修饰的碱基部分5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-乳糖Q核苷(β-D-galactosylqueosine)，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖Q核苷(βD-mannosylqueosine)，5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-羟乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，Q核苷(queosine)，2-巯基胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶5-羟乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羟乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。
寡核苷酸可包括至少一个选自下组的修饰的糖部分，其中包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖和己糖。此外，寡核苷酸可包括至少一个修饰的磷酸酯主链，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯、以及其甲酰化物(formacetal)或它们的各种类似物。
本发明各种形式中所述的反义寡核苷酸可通过本领域已知的标准方法合成。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可按照Stein等，(1988)Nucl Acids Res.163209描述的方法合成。
或者，本发明各种形式所述的反义核酸可通过胞内转录外源序列获得。例如，可在颗粒细胞内引入载体，然后通过转录制造反义RNA核酸。应理解，这种情况下的载体含有编码该反义核酸的序列以及本领域已知的用于驱动该反义核酸在颗粒细胞内表达的合适的组成型或诱导型启动子。
这种载体可保持游离或与染色体整合，只要它能被转录产生所需反义RNA即可。载体可通过本领域的标准重组DNA技术来构建，例如描述于Sambrook，J，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)，(1989)。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的用于在真核细胞内复制和表达的其他载体。
当本发明各种形式中的试剂是抗体时，所述抗体可以用本领域已知的方法产生。这些抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和通过Fab表达文库制造的片段。
为制造抗体，可给各种宿主，包括山羊、兔子、大鼠、小鼠、人等，注射具有免疫原性的多肽或其片段或其寡肽来进行免疫。根据宿主的种类，可采用不同佐剂来增强免疫应答。这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂，矿物质胶如氢氧化铝，以及表面活性剂如溶血卵磷脂、普流罗尼类醇、聚阴离子、肽、油性乳剂、匙孔

血蓝蛋白和二硝基酚。
单克隆抗体可采用各种能由连续培养细胞系来产生抗体分子的技术来制备。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术以及EBV-杂交瘤技术，如Kohler，G.等，(1975)Nature 256495-497；Kozbor，D.等，(1985)J.Immunol Methods8131-42；Cote，R.J.等，(1983)；Proc.NatlAcad.Sci.802026-2030；或Cole，S.P.等，(1984)Mol Cell Biol 62109-120中所述。
例如，为产生调节II型骨形态发生受体的蛋白质的单克隆抗体，可合成该蛋白质的肽序列并将其偶联到纯化的结核菌素蛋白质衍生物，如Groome和Lawrence M(1991)Hybridoma 10309-316所述。然后可对远交泰勒原本小鼠(OutbredTyler’sOriginal(T/O)mice)(英国艾塞克斯郡南部(Southend on Sea，Essex，UK))进行为期4个月的免疫。然后杀死动物，取出脾脏与Sp2/0鼠骨髓瘤细胞融合，如Goding(1986)《单克隆抗体的原则与实践》(Monoclonal AntibodiesPrinciple and Practice)，纽约，学术出版社(Academic Press)所述。
杂交瘤上清液可通过ELISA用涂布于Nunc免疫平板的肽进行初筛，如GroomeN.P.等，(1990)Hybridoma 931-42所述。然后扩增反应性克隆并通过有限稀释进行再克隆。然后用靶蛋白进行再次筛选，选出反应最好的克隆，然后扩增并同种型化。IgG抗体可能留在采用高盐方法的A蛋白柱上，如Harlow，E.和Lane D.(1988)《抗体实验室手册》(AntibodiesA Laboratory Manual)，纽约普莱维冷泉港出版社(ColdSpring Habor Press.，Plainview，NY)。
此外，已经有了制造“嵌合抗体”的技术，将小鼠抗体基因拼接到人抗体基因内，获得具有适当抗原特异性和所需生物活性的有用分子，如Morrison，S.L.等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855；Neuberger，M.S.等，(1984)Nature 312604-608；或Takeda，S.等，(1985)Nature 314452-454所述。
还可产生含有特异性结合位点的抗体片段。例如，此类片段包括F(ab’)2片段(可用胃蛋白酶消化抗体分子得到)和Fab片段(可将F(ab’)2片段的二硫键桥还原而产生)。或者，可构建Fab表达文库以快速且简便地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段，如Huse，W.D.等，(1989)Science 2541275-1281所述。
可采用各种免疫测定法来筛选鉴定具有所需特异性的抗体。许多采用具有已知特异性的多克隆或单克隆抗体的竞争性结合试验或免疫放射试验的方案是本领域已知的。
对于颗粒细胞所接触试剂的有效量没有特殊限制，只要其用量和形式能够调节颗粒细胞的凋亡即可。
就这点而言，试剂的有效量可根据要调节达到的颗粒细胞凋亡程度适当选择，而如果该试剂是体内给予的，还要考虑对象的年龄和体重、给药频率以及是否存在其他需要考虑的活性剂。
当在体外将试剂施用于颗粒细胞时，可使颗粒细胞直接接触该试剂来进行施用。
如上所述，在这种情况下，本发明尤其适合配制卵母细胞体外成熟培养基。
因此，本发明提供了卵母细胞体外成熟培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂； 优选地，有效抑制颗粒细胞凋亡的BMP-15的浓度为1-1500ng/ml。
优选地，有效抑制颗粒细胞凋亡的BMP-6的浓度为1-200ng/ml。
就这点而言，还进一步确定，添加通过调节依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂可用于配制不含通常用于降低颗粒细胞凋亡的添加物的组合物或培养基。此类添加物包括血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子如IGF(例如IGF-1)和EGF(包括双调素和表调节素(epiregulin))。
因此，在其各种相关形式中，本发明提供了基本上不含上述添加物并包含能通过调节依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂的组合物和培养基。
例如，该培养基可以是用于培养卵丘卵母细胞复合体和/或卵泡的培养基。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于培养卵丘卵母细胞复合体和/或卵泡的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂； 其中，所述培养基基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子。
例如，该培养基可用于使卵丘卵母细胞复合体中的卵母细胞在体外成熟。
因此，在另一种形式中，本发明提供了卵母细胞体外成熟培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂； 其中，所述培养基基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子。
本发明还适用于配制用于培养卵泡、尤其是促进卵泡发育或降低卵巢闭锁的培养基。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种卵泡培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种卵泡颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种卵泡颗粒细胞凋亡的试剂； 其中，所述组合物基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子。
本发明在其各种形式中还提供了一种组合物或培养基，其中含有能抑制颗粒细胞凋亡的试剂以及用于配制培养卵母细胞和/或卵泡的培养基的其他添加物。
优选地，该组合物或培养基含有NaCl。更优选地，该组合物或培养基含有40-400mM NaCl。
优选地，该组合物或培养基含有KCl。更优选地，该组合物或培养基含有0.1-20mM KCl。
优选地，该组合物或培养基含有葡萄糖。更优选地，该组合物或培养基含有0.1-40mM葡萄糖。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种组合物或培养基，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂； 该组合物还包含40-400mM NaCl、0.1-20mM KCl和0.1-40mM葡萄糖。
该组合物或培养基可用于使卵母细胞在体外成熟，或用于培养卵泡。出于这些目的而使用这种组合物或培养基的方法是本领域已知的。
优选地，抑制颗粒细胞凋亡的BMP-15的有效浓度是1-1500ng/ml。
优选地，抑制颗粒细胞凋亡的BMP-6的有效浓度是1-200ng/ml。
优选地，组合物中NaCl的浓度为100-180mM。最优选地，NaCl的浓度为140mM。
优选地，组合物中KCl的浓度为1-8mM。最优选地，KCl的浓度为4mM。
优选地，组合物中葡萄糖的浓度为1-25mM。最优选地，葡萄糖的浓度为5.6mM。
该组合物通常还将包含合适的无机缓冲剂，如两性离子或磷酸系缓冲剂，或浓度范围为10-60mM的碳酸氢钠缓冲剂。优选地，碳酸氢钠的浓度为20-40mM。最优选地，碳酸氢钠的浓度为25mM。
例如，采用BMP-15的合适培养基如下(g/l) BMP-15 0.0005 CaCl2.2H2O 0.265 MgSO4.6H2O- 0.09767 KCl 0.4 NaCl 6.8 NaH2PO4 0.122 L-精氨酸.HCl 0.126 L-半胱氨酸.HCL.一水合物 0.0313 L-谷氨酰胺 0.292 L-组氨酸.HCL.一水合物0.042 L-异亮氨酸 0.052 L-亮氨酸 0.052 L-赖氨酸.HCl 0.0725 L-甲硫氨酸 0.015 L-苯丙氨酸 0.032 L-苏氨酸 0.048 L-色氨酸 0.01 L-酪氨酸.2Na.二水合物0.0519 L-缬氨酸 0.046 氯化胆碱 0.001 叶酸 0.001 肌醇 0.002 烟酰胺 0.001 D-泛酸.1/2Ca 0.001 吡哆醛.HCl 0.001 核黄素 0.0001 硫胺素.HCl 0.001 葡萄糖 1 酚红.Na 0.011 NaHCO3 2.2 采用BMP-6的合适培养基如下(g/l) BMP-60.0001 CaCl2.2H2O 0.265 MgSO4.6H2O 0.09767 KCl 0.4 NaCl6.8 NaH2PO4 0.122 L-精氨酸.HCl0.126 L-半胱氨酸.HCL.一水合物 0.0313 L-谷氨酰胺 0.292 L-组氨酸.HCL.一水合物 0.042 L-异亮氨酸 0.052 L-亮氨酸0.052 L-赖氨酸.HCl0.0725 L-甲硫氨酸 0.015 L-苯丙氨酸 0.032 L-苏氨酸0.048 L-色氨酸0.01 L-酪氨酸.2Na.二水合物 0.0519 L-缬氨酸0.046 氯化胆碱0.001 叶酸0.001 肌醇0.002 烟酰胺 0.001 D-泛酸.1/2Ca0.001 吡哆醛.HCl 0.001 核黄素 0.0001 硫胺素.HCl 0.001 葡萄糖 1 酚红.Na 0.011 NaHCO3 2.2 如上所述，还应了解，本发明还适用于降低冻融损伤诱导的凋亡。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于减轻冻融造成的颗粒细胞凋亡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)活性BMP-15和/或活性BMP-6； (ii)提高颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)提高颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
该组合物可在冷冻前和/或解冻后使用。
例如，单个卵丘卵母细胞复合体、完整卵泡、卵巢组织或完整卵巢当冷冻时常会由于冻/融而死亡，而该组合物可用于提高冻融后细胞和组织的生存力。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于减轻冻融对卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢的损伤的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)有效量的活性BMP-15和/或活性BMP-6； (ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
在优选形式中，所述组合物是培养基。
本发明的组合物和/或培养基尤其适合培养用于辅助生殖技术的卵母细胞。进行辅助生殖的方法是本领域已知的。
就这点而言，术语“辅助生殖”用在整篇说明书中应理解为是指用于人类和动物的涉及分离的卵母细胞和/或分离的精子的任何授精技术，包括采用体外培养卵母细胞或胚胎的技术(例如卵母细胞体外成熟)、体外授精(IVF；抽取卵母细胞，在实验室授精并将胚胎移植到受者)、配子输卵管内移植(GIFT；将卵母细胞和精子放置到输卵管内)、合子输卵管内移植(ZIFT；将受精卵母细胞放置到输卵管内)、输卵管胚胎移植(TET；将分裂中的胚胎放置到输卵管内)、配子腹腔内移植(POST；将卵母细胞和精子放置到骨盆腔内)、精子卵浆内注射技术(ICSI)、睾丸精子提取(TESE)和显微外科附睾支精子抽取术(MESA)。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂。
例如，本发明可用于体外授精技术。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种卵母细胞的体外授精方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂。
本发明还提供了一种用于涉及卵母细胞的辅助生殖的组合物。
本发明适用于通过调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡来调节胚胎的发育能力，所述卵母细胞受精后形成胚胎。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于调节卵母细胞所产生胚胎的发育能力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6； (ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂。
在另一种形式中，本发明提供了一种调节卵母细胞所产生胚胎的发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡； (ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和 (iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
在另一种形式中，本发明还提供了一种涉及卵母细胞所产生胚胎的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞和/或胚胎的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)BMP-15和/或BMP-6； (ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂；和 (iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡的试剂。
本发明还提供了一种用于涉及卵母细胞所产生胚胎的辅助生殖的组合物。
在体外给予本发明的各种试剂的情况中，试剂的合适的递送形式和浓度应能够使该试剂达到所需作用部位并具有抑制颗粒细胞凋亡的作用。
可在适合产生所需的调节颗粒细胞凋亡的效果的任何时间内施用该试剂。就这点而言，在本发明的各种有关形式中，可在对体外或体内与颗粒细胞相关联的卵母细胞进行授精之前、之间和之后的任何时间向颗粒细胞施用所述试剂。
在人或动物对象中，所述试剂可通过口服、肠胃外、局部或通过任何其他合适方式施用，因此必需考虑试剂的传输时间(transit time)。
在本发明的各种形式中，体内施用试剂可包括使用一种或多种药学上可接受的添加物，包括药学上可接受的盐、氨基酸、多肽、聚合物、溶剂、缓冲剂、赋形剂和填充剂，需要考虑所用试剂的特定物理和化学性能。
例如，该试剂可被制成各种药物制品，其形式可以是，例如，水性溶液、油性制品、脂肪性乳剂、乳剂、凝胶等，且这些制品可作为肌内或皮下注射剂或作为卵巢注射剂、或作为包埋制品或作为透粘膜制品通过鼻腔、直肠、子宫、阴道、肺等的给予。所述制品可以口服制品(例如固体制品，如片剂、胶囊、颗粒或粉末；液体制品，如糖浆、乳剂或悬浮剂)的形式给予。含所述试剂的组合物还可含有防腐剂、稳定剂、分散剂、pH控制剂或等渗剂。合适的防腐剂的例子有甘油、丙二醇、苯酚或苄基醇。合适的稳定剂的例子有葡聚糖、明胶、α-生育酚乙酸酯或α-硫代甘油。合适的分散剂的例子包括聚氧化乙烯(20)、脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80)、失水山梨糖醇倍半油酸酯(Span 30)、聚氧化乙烯(160)、聚氧丙烯(30)、乙二醇(普流罗尼F68(Pluronic F68))或聚氧化乙烯氢化蓖麻油60。合适的pH调节剂的例子包括盐酸、氢氧化钠等。合适的等渗剂的例子有葡萄糖、D-山梨糖醇或D-甘露醇。
在本发明的各种形式中，体内给予的试剂的形式可以是含有药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、悬浮剂、润滑剂，佐剂，运载体、递送系统、乳化剂、崩解剂、吸附剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、调味剂或甜味剂的组合物，需要考虑所用特定试剂的物理和化学特性。
出于这些目的，所述组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、吸附、吸收、局部、直肠、经鼻、含服施用，可以是通过植入型药物储库，以含有常规的无毒药用载体的剂量形式，或通过任何其他方便的剂型。术语肠胃外在这里包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、胸骨内以及颅内注射或灌输技术。
当肠胃外施用时，所述组合物将通常采取单位剂量的无菌可注射形式(溶液、悬浮液或乳剂)，并优选用药学上可接受的载体使其与受者的血液等渗。这种无菌可注射形式的例子是无菌可注射的水性或油性悬浮液。可按照本领域熟知的技术采用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来制造这些悬浮液。所述无菌可注射形式也可以是用肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂配制的无菌可注射溶液或悬浮液，例如用1，3-丁二醇配制的溶液。在本发明各种实施方式中，可采用的可接受的运载体和溶剂包括水、盐水、林格(Ringer’s)溶液、葡萄糖溶液、等渗氯化钠溶液和汉克斯(Hanks’)溶液。此外，通常采用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。出于该目的，可采用任何温和的混合油，其中包括合成的甘油单酯或甘油二酯、玉米油、棉籽油、花生油和芝麻油。脂肪酸如油酸乙酯、肉豆蔻酯异丙酯、和油酸及其甘油酯衍生物，包括橄榄油和蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式，可用于制备注射剂。这些油性溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂。
所述载体可含有少量添加物，如提高溶解度、等渗性和化学稳定性的物质，例如抗氧化剂、缓冲剂和防腐剂。
当口服施用时，将通常采用本领域已知的常规设备和技术将所述组合物制成单位剂型，如片剂、扁囊剂、粉末剂、颗粒剂、珠、可咀嚼的锭剂、胶囊剂、液体、水性悬浮液或溶液、或类似剂型。这种制剂通常包含固体、半固体或液体载体。载体的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、可可脂、可可油、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、羰基、甲基纤维素、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁等。
可将活性成分以及任选的一种或多种附加成分压制或模制成片剂。可在合适的机器内将任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式如粉末或颗粒形式的活性成分来压制成压制片。可在合适的机器内将粉末状活性成分和用惰性液体稀释剂润湿的合适的载体模塑成模压片。
在本发明的各种形式中，也可采用控释技术施用所述试剂。也可将该试剂制成缓释药物来施用。为进一步提高缓释效果，可在组合物中加入例如一些组份植物油(例如大豆油、芝麻油、山茶油、蓖麻油、花生油、菜籽油)；中性脂肪酸甘油三酯；脂肪酸酯如油酸乙酯；聚硅氧烷衍生物；或者是水溶性高分子量化合物如透明质酸或其盐(重均分子量约80,000-2,000,000)、羧甲基纤维素钠(重均分子量约20,000-400,000)、羟丙基纤维素(2％水溶液的粘度为3-4,000cps)、蛋白质充填剂(重均分子量约300,000)、聚乙二醇(重均分子量约400-20,000)、聚氧化乙烯(重均分子量约100,000-9,000,000)、羟丙甲基纤维素(1％水溶液的粘度为4-100,000cSt)、甲基纤维素(2％水溶液的粘度为15-8,000cSt)、聚乙烯醇(粘度2-100cSt)、聚乙烯吡咯烷酮(重均分子量25,000-1,200,000)。
或者，在本发明各种实施方式中，所述试剂可被掺入疏水聚合物基质中以实现为期数天的控释。然后可将本发明的组合物模制成固体植入物或外用贴剂，它们适合在较长时间内提供有效浓度的药剂而无需频繁地重复给药。这种控释薄膜是本领域熟知的。通常用于该目的的聚合物的其他例子包括可外敷或内服的可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物和不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物。某些水凝胶如聚(异丁烯酸羟乙酯)或聚(乙烯基醇)也是可用的，但只适用于与其他聚合物(例如以上所述)相比释放周期较短的情况。
所述载体还可以是具有合适的时间释放特性和释放动力学特征的固体生物可降解聚合物或生物可降解聚合物的混合物。然后可将所述组合物模压成固体植入物，它适合在较长时间内提供有效浓度的所述试剂而无需频繁地重复给药。可采用本领域的一般技术人员已知的任何合适方式将所述试剂掺入生物可降解的聚合物或聚合物混合物，并可与生物可降解的聚合物形成均匀基质，或者可将所述试剂包裹入聚合物，或者可被模压成固体植入物。
本发明还提供了一种通过测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度来评价卵母细胞发育能力的方法。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度；和 (ii)通过测得的与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度来评价卵母细胞的发育能力； 其中，凋亡水平降低表明卵母细胞的发育能力增强，而凋亡水平升高表明卵母细胞的发育能力减弱。
就这点而言，术语“发育能力”应理解为是指卵母细胞发育成能够着床的胚胎的能力。
应理解，提高的发育能力将与较低的颗粒细胞凋亡水平有关，而降低的发育能力将与升高的颗粒细胞凋亡水平有关。
可对体外卵母细胞或体内卵母细胞进行发育能力的评价。
在体外和体内评价细胞凋亡程度的方法之前已经描述过。
因此，本发明包括，例如，评价作为卵丘卵母细胞复合体一部分或作为卵泡一部分的体外卵母细胞的发育能力，或者评价体内卵母细胞的发育能力。
本发明还适用于通过测定以下一项或多项来评价卵母细胞的发育能力 (i)与卵母细胞相关联的颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (ii)与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性水平；和 (iii)与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性水平。
这种情况中，提高的发育能力将与颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的较高浓度和/或活性有关，或者与颗粒细胞内BMP-15或BMP-6信号传导途径的较高活性有关，而降低的发育能力将与颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的较低浓度和/或活性有关，或与颗粒细胞内BMP-15或BMP-6信号传导途径的较低活性有关。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定下述一项或多项与卵母细胞相关联的颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性水平；以及测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性水平；和 (ii)用上述测定的结果来评价卵母细胞的发育能力； 其中，BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性升高和/或依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性升高表明卵母细胞的发育能力增强，而BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性降低和/或依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
测定BMP-15和BMP-6的浓度或活性以及测定相应信号传导途径活性的方法是本领域已知的。
本发明还提供了一种通过测定卵母细胞中BMP-15和BMP-6的表达、产生和/或分泌来评价卵母细胞发育能力的方法。
例如，在人IVF期间，所用卵母细胞通常被裸化，可以在授精前通过测定含有卵母细胞的培养基内BMP-15和/或BMP-6的水平来评价卵母细胞的发育能力。测定BMP-15和/或BMP-6水平的合适方法之一是通过ELISA。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定卵母细胞内BMP-15和/或BMP-6的表达水平和/或测定卵母细胞分泌的BMP-15和/或BMP-6的浓度；和 (ii)评价卵母细胞的发育能力； 其中，BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度升高表明卵母细胞的发育能力增强，而BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
目前的研究(见优选实施方式中的“研究II”)已发现，在体外成熟阶段将卵丘卵母细胞复合体与其他裸卵母细胞共培养导致卵丘卵母细胞复合体受精后的胚泡形成率显著升高。这一结果证实，卵母细胞分泌的因子对卵母细胞的发育能力有显著影响。
此外，还发现，负责提高卵母细胞发育能力的卵母细胞分泌因子至少包括GDF-9和/或BMP-15。因此，GDF-9同型二聚体、BMP-15同型二聚体以及GDF-9/BMP-15杂二聚体可能参与其中。
还认为，BMP-6是一种将导致卵母细胞发育能力改善的卵母细胞分泌因子。
因此，还提供了一种调节卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
就这点而言，越来越明显的是，需要开发一种新的技术以调节和诊断卵母细胞和胚胎的发育和发育能力。
还已经充分论述了与人和动物辅助生殖技术有关的困难。具体地说，需要改善所有年龄雌性的卵母细胞的体外成熟，还需要改善受精卵母细胞的发育能力，尤其是对于涉及40岁以上妇女的IVF过程而言，因为与35岁以下的妇女相比，40岁以上妇女通过IVF成功受孕的比例只有约1/4。
就这点而言，“辅助生殖”应理解为是指用于人类和动物的涉及分离的卵母细胞、分离的胚胎和/或分离的精子的任何授精技术，包括采用体外培养卵母细胞或胚胎的技术(例如体外成熟)、体外授精(IVF；抽取卵母细胞，在实验室授精并将胚胎移植到受者)、配子输卵管内移植(GIFT；将卵母细胞和精子放置到输卵管内)、合子输卵管内移植(ZIFT；将受精卵母细胞放置到输卵管内)、输卵管胚胎移植(TET；将分裂中的胚胎放置到输卵管内)、配子腹腔内移植(POST；将卵母细胞和精子放置到骨盆腔内)、精子卵浆内注射技术(ICSI)、睾丸精子提取(TESE)和显微外科附睾支精子抽取术(MESA)；或者用于在人和/或动物中制造胚胎的任何其他体外技术，如核移植、孤雌生殖(parthenogenic activation)以及使用全能细胞。
术语“分离的”，就卵母细胞和胚胎而言，应理解为是指，有时，卵母细胞或胚胎离开其天然环境离开或被从中纯化(至少部分纯化)出来。分离的胚胎的例子是采用辅助生殖技术在体外制造的胚胎或是从对象中分离出的胚胎。分离的卵母细胞的例子是作为卵泡的一部分、卵丘卵母细胞复合体或裸卵母细胞从对象中分离的卵母细胞。
术语“有发育能力”应理解为是指胚胎或卵母细胞能够形成能够着床的胚胎。
术语“发育能力”应理解为是指卵母细胞或胚胎发育成能够着床的胚胎的能力。具有改善的发育能力的卵母细胞或胚胎在成功着床后发育成有生命力的动物或人的可能性将提高。
该方法还适用于改变受精后卵母细胞继续发育的能力。
例如，通过提高(i)、(ii)和(iii)中的一项或多项，卵丘细胞复合体中的受精卵母细胞更有可能发育到胚泡或桑椹胚阶段(i)卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；(ii)卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；(iii)卵母细胞中和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞中依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性。
一种或多种卵母细胞分泌因子的合适来源包括使卵母细胞接触一种或多种额外的裸卵母细胞。或者，可使卵母细胞接触来自一种或多种卵母细胞的条件培养基。
优选地，可通过调节卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度来调节卵母细胞的发育能力。
就这点而言，可通过提高卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度来改善卵母细胞的发育能力。
因此，在优选的形式中，提供了一种调节卵母细胞发育能力的方法，该方法包括调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度的步骤。
应理解，上述单步骤或多步骤调节可在对卵母细胞授精之前、与卵母细胞授精同时、或在卵母细胞授精之后发生。
优选地，所述单步骤或多步骤调节在卵母细胞授精之前发生。例如，该方法可用于在对卵母细胞授精前改善卵母细胞的发育能力。
还应理解，该方法可用于在体外或体内调节卵母细胞的发育能力。
例如，该方法可用于在体外调节卵母细胞的发育能力。就这点而言，所述卵母细胞可以是，例如，存在于卵泡内的卵母细胞、存在于卵丘-卵母细胞复合体内的卵母细胞、剥去其卵丘细胞的裸化卵母细胞、或存在于卵丘卵母细胞复合体内的或裸化的受精卵母细胞。优选地，所述卵母细胞是卵丘-卵母细胞复合体的一部分。
从合适的雌性受者采集卵母细胞和卵丘-卵母细胞复合体以及对卵母细胞体外授精的方法是本领域已知的。
就这点而言，还提供了一种用本发明方法产生的具有改进的发育能力的分离卵母细胞(如裸化的体外卵母细胞，或作为存在于体外的卵丘-卵母细胞复合体一部分的卵母细胞)，以及从所述卵母细胞生成的胚胎或非人动物。
所述在体外产生的改变了发育能力的卵母细胞可用于辅助生殖技术，包括被移植到合适的雌性对象受者，或者可在体外培养同时保持生存力以用于胚胎移植、IVF和/或遗传操作，或者可被储存或冷冻然后再进行胚胎移植或其他操作。此外，由所述受精卵母细胞产生的胚胎可被用作胚胎细胞的来源以用于核移植或制造胚胎干细胞。
因此，在另一种形式中，还提供了一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
例如，所述辅助生殖方法可以是卵母细胞体外授精。
因此，在另一种形式中，还提供了一种对卵母细胞体外授精方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
本发明还提供了一种用于涉及卵母细胞的辅助生殖的组合物。
在另一种形式中，还提供了一种涉及卵母细胞所产生胚胎的辅助生殖方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
本发明还提供了一种用于涉及卵母细胞所产生胚胎的辅助生殖的组合物。
在优选的形式中，还提供了一种用于提高卵母细胞发育能力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
在优选的形式中，所述组合物是卵母细胞培养基。
因此，还提供了卵母细胞培养基，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
优选地，所述组合物或培养基被用于提高卵母细胞的发育能力。
在另一种形式中，提供了一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)一种或多种裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
所述培养基可以基本上不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和生长因子如IGF(例如IGF-1)和EGF(包括双调素和表调节素(epiregulin))中的一种或多种。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于提高卵母细胞发育能力的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂； 其中，所述组合物基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和生长因子中的一种或多种。
所述培养基包括配制培养基的其他合适添加物。
优选地，所述培养基包含NaCl。更优选地，所述培养基含有40-400mM NaCl。
优选地，所述培养基包含KCl。更优选地，所述培养基含有0.1-20mM KCl。
优选地，所述培养基包含葡萄糖。更优选地，所述培养基含有0.1-40mM葡萄糖。
本发明还提供了一种用于涉及卵母细胞的辅助生殖的组合物。
可根据所需的提高发育的程度来选择一种或多种裸卵母细胞的有效量，或卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度。可类似地选择卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的有效量，以及提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关卵丘细胞内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径活性的试剂的有效量。
试剂的例子包括药物、小分子、核酸、寡核苷酸、多肽、肽、蛋白质、酶、多糖、糖蛋白、激素、受体、受体的配体、辅因子、反义寡核苷酸、核酶、小干扰RNA、脂质、抗体或其一部分、适体、或病毒。
在优选的形式中，提供了一种用于提高卵母细胞发育能力的组合物，该组合物含有GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物。
在特别优选的形式中，所述组合物是培养基。
就这点而言，术语“变体”应理解为是指有一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。变体可具有“保守性”改变，其中被取代的氨基酸与替代氨基酸具有类似的结构或化学特性(例如用异亮氨酸代替亮氨酸)。变体也可以具有“非保守性”改变(例如，用色氨酸代替甘氨酸)或者删除和/或插入了一个或多个氨基酸。
优选地，所述变体在氨基酸水平上与原生(native)蛋白质有75％以上的同源性。更优选地，所述变体与原生蛋白质的同源性大于90％。最优选地，所述变体与原生蛋白质的同源性大于95％。
术语“类似物”应理解为是指与参照分子具有类似结构、调节或生化功能的分子，包括参照分子的生物活性片段。
优选地，卵母细胞所接触的GDF-9的浓度为1-1000ng/ml。
优选地，卵母细胞所接触的BMP-15的浓度为1-1500ng/ml。
优选地，卵母细胞所接触的BMP-6的浓度为1-200ng/ml。
所述方法和组合物还适用于使卵母细胞体外成熟，以及提高卵母细胞的质量。
因此，还提供了一种调节卵母细胞成熟和/或调节卵母细胞质量的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
就这点而言，还提供了一种通过该方法产生的具有改变的成熟度和/或质量的分离的卵母细胞，以及由该卵母细胞生成的胚胎和非人动物。
在另一种形式中，还提供了一种用于使卵母细胞体外成熟和/或提高卵母细胞质量的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
优选地，所述组合物是用于培养卵母细胞的培养基。
所述培养基可以基本上不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和生长因子如IGF(例如IGF-1)和EGF(包括双调素和表调节素(epiregulin))中的一种或多种。优选地，所述培养基是无血清培养基。
在优选的形式中，所述培养基包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6。因此，还提供了卵母细胞培养基，所述培养基包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6。
在优选的形式中，还提供了一种用于使卵母细胞体外成熟的培养基，所述培养基包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6。
该培养基还适用于提高卵母细胞的质量以及提高卵母细胞的发育能力。因此，还提供了一种用于提高卵母细胞质量和/或提高卵母细胞发育能力的培养基，所述培养基包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6。
合适培养基的一个例子是来自澳大利亚库克公司(Cook Australia)的牛体外授精培养基(Bovine Vitro Fert Medium)或牛体外胚泡培养基(Bovine Vitro Blast Medium)，其中添加有10％v/v BMP-15和/或175ng/ml GDF-9和/或10ng/ml BMP-6。
所述组合物和/或培养基还特别适用于培养用于辅助生殖技术的卵母细胞。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)一种或多种裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
例如，本发明还适用于体外授精技术。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种卵母细胞体外授精的方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)一种或多种裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种用于涉及卵母细胞的辅助生殖的组合物。
所述方法和组合物还适用于调节卵母细胞受精产生的胚胎的发育或发育能力。就这点而言，可在授精之前、之间或之后对卵母细胞进行处理。
因此，还提供了一种改善由卵母细胞生成的胚胎的发育或发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (vi)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
如此产生的胚胎更可能发育到胚泡或桑椹胚阶段，并且更可能在胚胎移植后植入子宫。
应理解，GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，和/或提高卵母细胞内、与卵母细胞相关联的卵丘细胞或胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂，和/或提高卵母细胞内、与卵母细胞相关联的卵丘细胞或胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂，和/或提高卵母细胞内、与卵母细胞相关联的卵丘细胞或胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂，也可被用作胚胎和/或卵母细胞培养基的添加物。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种包含以下组分的组合产品 卵母细胞和/或胚胎培养基；和 GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；和/或 一种或多种卵母细胞分泌因子；和/或 提高卵母细胞内、与卵母细胞相关联的卵丘细胞或胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；和/或 提高卵母细胞内，与卵母细胞相关联的卵丘细胞或胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和/或 提高卵母细胞内、与卵母细胞相关联的卵丘细胞或胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂； 其中，所述组分以适合将其加入培养基的形式提供。
所述组合产品可用于这里所述的任何应用。
所述培养基以及其他各种组分可分别包装在合适的容器(优选灭菌容器)内，所述容器如安瓿、瓶子或小瓶，其形式可以是多剂次或单位剂量形式。在填装后可将容器气密密封。蛋白质组分可以分离的形式或以纯化或半纯化形式存在，并且可含有其他有助于蛋白质的稳定和/或使用的添加物。包装不同组分的方法是本领域已知的。
还认为，本发明可调节胚胎的发育和/或发育能力。
因此，还提供了一种改善胚胎的发育或发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节胚胎所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (v)调节胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
该方法还适用于改变胚胎的发育和/或发育能力。
具体地说，通过提高以下一项或多项，该方法可用于改善从授精到胚泡期卵母细胞期间的胚胎发育(i)胚胎所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；(ii)胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；和(iii)胚胎内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性。
因此，胚胎更可能发育到胚泡或桑椹胚阶段，并且更可能在胚胎移植后在子宫内着床。
一种或多种卵母细胞分泌因子的合适来源包括使胚胎接触一种或多种另外的裸卵母细胞。或者，可使胚胎接触一种或多种来自卵母细胞的条件培养基。
优选地，可通过调节胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度来调节胚胎的发育和/或发育能力。
就这点而言，可通过提高胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度来改善胚胎的发育和/或发育能力。
因此，在优选的形式中，提供了一种调节胚胎的发育和/或发育能力的方法，该方法包括调节胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度的步骤。
应理解，所述单步骤或多步骤调节可在对卵母细胞授精之后发生。
还应理解，该方法可用于在体外或体内调节胚胎的发育和/或发育能力。优选地，胚胎在体外。
在体外制造胚胎的方法是本领域已知的。
就这点而言，还提供了一种用该方法产生的具有改进的发育或发育能力的分离的胚胎，以及由该胚胎生成的非人动物。
所述在体外产生的具有改进的发育或发育能力的胚胎可用于辅助生殖技术，包括被移植到合适的雌性对象受者，或者可在体外培养同时保持生存力以用于胚胎移植、遗传操作，或者可被储存或冷冻然后再进行胚胎移植或其他操作。此外，由所述胚胎产生的胚胎可被用作胚胎细胞的来源以用于核移植或制造胚胎干细胞。
因此，在另一种形式中，提供了一种涉及胚胎的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养胚胎的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)一种或多种裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
本发明还提供了一种用于涉及胚胎的辅助生殖的组合物。
在优选的形式中，还提供了一种用于提高胚胎的发育和/或发育能力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
在优选的形式中，所述组合物是胚胎培养基。
因此，还提供了胚胎培养基，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
所述培养基可以基本上不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和生长因子如IGF(例如IGF-1)和EGF(包括双调素和表调节素(epiregulin))中的一种或多种。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种用于提高胚胎发育能力的培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂； 其中，所述组合物基本上不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和生长因子中的一种或多种。
所述培养基包含用于配制培养基的其他合适添加物。
优选地，所述培养基包含NaCl。更优选地，所述培养基包含40-400mM NaCl。
优选地，所述培养基包含KCl。更优选地，所述培养基包含0.1-20mM KCl。
优选地，所述培养基包含葡萄糖。更优选地，所述培养基包含0.1-40mM葡萄糖。
可根据所需的提高发育的程度来选择一种或多种裸卵母细胞的有效量，或卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度。可类似地选择胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的有效量，以及提高胚胎内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径活性的试剂的有效量。
试剂的例子包括药物、小分子、核酸、寡核苷酸、多肽、肽、蛋白质、酶、多糖、糖蛋白、激素、受体、受体的配体、辅因子、反义寡核苷酸、核酶、小干扰RNA、脂质、抗体或其一部分、适体、或病毒。
在优选的形式中，提供了一种用于改善胚胎的发育或发育能力的组合物，该组合物包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物。
在特别优选的形式中，所述组合物是培养基。
优选地，胚胎所接触的GDF-9的浓度为1-1000ng/ml。
优选地，胚胎所接触的BMP-15的浓度为1-1500ng/ml。
优选地，胚胎所接触的BMP-6的浓度为1-200ng/ml。
所述方法和组合物还适用于提高胚胎发育到胚泡期的可能性。
因此，还提供了一种提高胚胎发育到胚泡期的可能性的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节胚胎所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性； (ii)调节胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性； (iii)调节胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性； (iv)调节胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和 (v)调节胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
就这点而言，还提供了一种通过该方法产生的分离的胚胎，以及由该胚胎生成的非人动物。
在另一种形式中，还提供了一种用于提高胚胎发育到胚泡期的可能性的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
优选地，所述组合物是用于培养胚胎的培养基。
因此，还提供了胚胎培养基，所述培养基包含以下组分中的一种或多种 (i)一种或多种另外的裸卵母细胞； (ii)一种或多种卵母细胞分泌因子； (iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物； (iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂； (v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和 (vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
在优选的形式中，所述培养基包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6。因此，还提供了胚胎培养基，所述培养基包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6。
该培养基还适用于改善胚胎发育和/或发育能力。因此，还提供了一种用于提高胚胎的发育和/或发育能力的培养基，该培养基包含GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6。
所述培养基可以基本上不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和生长因子如IGF(例如IGF-1)和EGF(包括双调素和表调节素(epiregulin))中的一种或多种。
优选地，所述培养基是无血清培养基。
合适培养基的一个例子是来自澳大利亚库克公司的牛体外授精培养基或牛体外胚泡培养基，其中添加有10％BMP-15和/或175ng/ml GDF-9和/或10ng/ml BMP-6。
可通过本领域已知的方法调节胚胎内GDF-9和/或BMP 15和/或BMP-6的活性，和/或它们的信号传导途径的活性。测定细胞内这些途径的活性的各种方法是本领域已知的。
可通过许多不同方法实现对胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性的调节。例如，当需要提高这些蛋白质之一或两者的浓度时，可使胚胎暴露于或接触所述蛋白质。
就这点而言，应理解，提及BMP-15时包括来自合适物种的蛋白质(包括与所述卵母细胞或胚胎来自相同物种的蛋白质)，该蛋白质的变体(如与野生型相比有一个或多个氨基酸取代的蛋白质形式)，或者该蛋白质的生物活性片段。该蛋白质可以是分离的蛋白质、重组蛋白、纯化或半纯化的、或是蛋白质复杂混合物(例如来自卵母细胞的条件培养基中的那样)的一部分。
类似地，提及GDF-9时包括来自合适物种的蛋白质(包括与所述卵母细胞或胚胎来自相同物种的蛋白质)，该蛋白质的变体(如与野生型相比有一个或多个氨基酸取代的蛋白质形式)，或者该蛋白质的生物活性片段。该蛋白质可以是分离的蛋白质、重组蛋白、纯化或半纯化的、或是蛋白质复杂混合物(例如来自卵母细胞的条件培养基中的那样)的一部分。
类似地，提及BMP-6时包括来自合适物种的蛋白质(包括与所述卵母细胞或胚胎来自相同物种的蛋白质)，该蛋白质的变体(如与野生型相比有一个或多个氨基酸取代的蛋白质形式)，或者该蛋白质的生物活性片段。该蛋白质可以是分离的蛋白质、重组蛋白、纯化或半纯化的、或是蛋白质复杂混合物(例如来自卵母细胞的条件培养基中的那样)的一部分。
如上所述，被递送的蛋白质可以是纯化或半纯化的蛋白质。制造蛋白质的方法是本领域已知的。或者，被递送的蛋白质的形式可以是含有一种或多种其他组分的提取物。
还可通过测定卵母细胞或胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度，和/或卵母细胞和/或胚胎内依赖于它们的信号传导途径的活性来评价卵母细胞或胚胎的发育能力。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；和/或 (ii)测定卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；和/或 (iii)测定卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和/或 (iv)测定卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性；和 (v)通过卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性，和/或卵母细胞或卵丘细胞内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性来评价卵母细胞的发育能力； 其中，卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性提高，和/或卵母细胞或卵丘细胞内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性提高表明卵母细胞的发育能力增强，而卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性降低，和/或卵母细胞或卵丘细胞内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
这种情况中，发育能力提高将与较高的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性，和/或较高的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导活性相关。
测定GDF-9和/或BMP-15和BMP-6的浓度或活性的方法以及测定相应信号传导途径活性的方法是本领域已知的。
例如，在人IVF期间，所用卵母细胞通常被裸化，并在授精前通过测定含有卵母细胞的培养基内GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的水平来评价卵母细胞的发育能力。测定GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6水平的合适方法之一是通过ELISA。
因此，在另一种形式中，本发明提供了一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤 (i)测定卵母细胞中GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的表达水平和/或测定卵母细胞分泌的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度；和 (ii)评价卵母细胞的发育能力； 其中，GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度提高表明卵母细胞的发育能力增强，而GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
还提供了一种调节卵丘卵母细胞复合体扩展的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步 (i)调节卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种物质的浓度和/或活性；和 (ii)调节卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径的活性。
例如，可通过调节卵丘卵母细胞复合体内胞内信号传导分子Smad2和Smad3之一或两者的水平和/或活性来调节卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径的活性。
可在体外或体内调节卵丘卵母细胞复合体的扩展。
在优选的形式中，对卵丘扩展的调节可通过使卵丘卵母细胞复合体接触能够调节以下之一或两者的试剂来实现(i)卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性；和(ii)由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径的活性。
还提供了一种用于调节卵丘卵母细胞复合体的表达的组合物，该组合物包含这种试剂。
对于体内的卵丘卵母细胞复合体而言，该方法还适用于调节雌性对象排卵。例如，所述雌性对象可以是女性人类、雌性哺乳动物，所述哺乳动物包括灵长类、家畜(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)、陪伴动物(例如狗、猫)或实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)。
因此，还提供了一种调节雌性对象排卵的方法，该方法包括给予所述雌性对象以下试剂中的一种或多种的步骤 (i)调节该雌性对象的卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性的试剂；和 (ii)调节该雌性对象卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径活性的试剂。
还提供了一种用于调节雌性对象排卵的组合物，该组合物包含能够调节以下之一或两者的试剂(i)该雌性对象的卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性；和(ii)该雌性对象卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径的活性。
所述还适用于调节雌性对象的生育力。
因此，还提供了一种调节雌性对象生育力的方法，该方法包括给予所述雌性对象以下试剂中的一种或多种的步骤 (i)调节该雌性对象的卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性的试剂；和 (ii)调节该雌性对象卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径活性的试剂。
还提供了一种用于调节雌性对象的生育力的组合物，该组合物包含能够调节以下之一或两者的试剂(i)该雌性对象的卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性；和(ii)该雌性对象卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径的活性。
例如，该方法适用于通过使用一种试剂来降低雌性对象的生育力，所述试剂能够抑制以下之一或两者(i)雌性对象的卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性；和(ii)该雌性对象卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径的活性。
还提供了一种含有这种试剂的避孕组合物。
优选实施方式 现在将描述具体描述上述本发明一般原则的实验。然而，应理解，以下描述并非要限制以上描述的通用性。
研究I卵母细胞分泌因子预防卵丘细胞凋亡 实施例1 牛卵母细胞的采集和培养条件(COC的采集和制备) 除非另有说明，所有化学药品和试剂均购自密苏里州圣路易斯的西格玛公司(sigma，St Louis，MO)。
从本地屠宰场采集牛卵巢并在温盐水(30-35℃)中运送到实验室。用18号针头和10ml针筒从窦状卵泡(直径为2-8mm)中吸出卵丘-卵母细胞复合体(COC)，针筒中装有约2ml添加有50μg/ml卡那霉素(密苏里州圣路易斯西格玛奥尔德利希公司(Sigma-Aldrish，St.Louis，MO))、4mg/ml无脂肪酸的牛血清白蛋白(FAF-BSA)(新西兰奥克兰的ICP生物有限公司(ICPbio Ltd，Auckland，NZ))的抽吸培养基(Hepes缓冲组织培养培养基-199TCM-199，美国加利福尼亚州俄弗因的ICN生化制品公司(ICN Biochemicals，Irvine，CA，USA))。在解剖显微镜下选择具有大于5个细胞层的致密卵丘外衣和均匀染色的细胞质的完全COC，用Hepes-缓冲的TCM-199洗涤两次并用相应的培养基洗涤一次。将复合体与或不与0.1IU/mlFSH(荷兰乌甘诺(Organon，Netherlands))一起在50μg预平衡的培养基(碳酸氢盐-缓冲的TCM-199，添加有0.23mmol/l丙酮酸钠，0.3mg/ml聚乙烯醇(PVA；西格玛公司，圣路易斯，密苏里州)中于5％CO2、39℃的湿润空气中培育24小时，培养基用矿物油覆盖。
实施例2 卵丘细胞的处理 (i)产生卵母细胞切除复合体 按照Buccione等的描述(Buccione等，(1990)Dev Biol 138.16-25)用显微操作器通过显微外科手术从COC中除去各卵母细胞的细胞质(卵母细胞切除术)。所得卵母细胞切除复合体(OOX)由中空卵透明带和周围若干层完全CC构成。
(ii)产生裸卵母细胞 将COC在2ml H-TCM-199/BSA中涡漩振荡约4分钟除去CC以产生裸化卵母细胞(DO)。让卵母细胞在H-TCM-199/BSA中多次通过细口烧边玻璃移液管以除去所有残余的CC。
(iii)生长因子和结合蛋白 按照之前的描述(Kaivo-Oja等，(2003)J Clin Endocrinol Metab 88，755-62；McNatty等，(2005)Reproduction 129473-480)用转染的293人胎肾细胞系(293H)自行制造重组小鼠GDF-9和重组绵羊BMP-15)。重组蛋白质用疏水相互作用色谱(HIC)部分纯化，然后通过Western印迹估算它们的浓度(Kaivo-Oja等，(2003)JClin Endocrinol Metab 88755-62)。另用未转染的293H细胞制造对照条件培养基(293H)并通过HIC纯化。重组人BMP-6、重组人BMP-7、BMP-6中和抗体、和grem蛋白获自R&D系统(R&D systems，明尼苏达州，明尼阿波利斯)。
实施例3 通过TUNEL测定DNA损伤(通过TUNEL评价卵丘细胞的凋亡) 采用TUNEL(德国盘芝堡罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostic，Penzberg，Germany))按照制造商的说明检测CC的凋亡DNA。简言之，培养之后用含有1％BSA的PBS(pH7.4)将COC和OOX复合体洗涤两次，在用PBS(pH7.4)配制的4％低聚甲醛中4℃固定过夜，用PBS/BSA洗涤两次，然后置于Cell-Tak-涂布的盖玻片上(新泽西州富兰克林湖BD生物科技公司(Beckton Dickinson Biosciences，Franklin Lakes，NJ))。复合体然后用0.1％柠檬酸钠配制的0.1％Triton X-100室温预透化1小时并用PBS/BSA洗涤三次。然后将复合体与荧光素-偶联的dUTP和末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL试剂，罗氏)在37℃避光培育1小时。将阳性对照与能切割所有DNA的DNA酶1(0.005U/□l)一起室温培育20分钟，用PBS/BSA洗涤两次，然后进行TUNEL。阴性对照在不含TdT条件下与荧光素-dUTP一起培育。TUNEL之后将复合体用PBS/BSA洗涤两次并在室温、避光条件下用0.5μg/ml碘化丙锭(PI)+RNA酶A(0.1mg/ml)复染1小时以标记所有的核。复合体然后用PBS/BSA洗涤两次，用微盖玻片加压固定在VectaShield抗-漂白液(加州伯林盖姆载体实验室公司(Vector Labs，Burlingame，CA))中，并于4℃黑暗储存以备共焦分析。
实施例4 共焦显微术及分析 用共焦显微术观察并量化COC和OOX的凋亡。用尼康(Nikon)C1共焦扫描头和尼康TE2000E显微镜(日本东京尼康公司(Nikon，Tokyo，Japan))检测CC发出的双荧光。同时捕捉凋亡信号的发射(荧光素，激光激发波长为488nm，发射波长为510-530nm)和核信号的发射(碘化丙锭，激光激发波长为532，发射波长为590-640nm)。
为准确反映所有复合体整体凋亡率，通过Z系列(Z series)测量每个复合体的深度以将构建物分成25％、50％和75％这3个百分位(光学Z平面切面)。获得这些光学切面图，保存为各自独立的颜色频道(绿色是凋亡的卵丘荧光，红色是核卵丘荧光)。然后用Scanalytics IP Lab软件3.6版(弗吉尼亚州费尔伐克斯的扫描分析公司(Scanalytics，Fairfax，VA))处理捕获的图像。使用采用自动分割滤波器的大脚本法(macro script)测量各光学切面百分位(每个复合体有3个光学“z”-平面切面)的(各颜色频道的)CC数量。由此获得各切面的凋亡核百分比，然后将3个百分位的数值平均以得到代表整个复合体总凋亡核百分比的数值。分别对每个复合体重复这些过程。
实施例5 Western印迹分析 培养处理之后，将OOX复合体溶解于25ml RIPA溶胞缓冲液(10mM Tris[pH7.4]、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Trinton X-100)并储存于-80℃，以便用灵敏的增强型化学发光(ECL)增强系统(ECL Advance system)(加拿大安大略爱美沙生物科技公司(Amersham Biosciences，Ontario，Canada))检测蛋白质的凋亡。将解冻后的溶解产物与含有100mM二硫苏糖醇(DTT)的4X加样缓冲液混合并进行SDS-PAGE(12％聚丙烯酰胺凝胶)。随后，在含20％甲醇的25mM Tris-192mM甘氨酸中，将蛋白质电转移到硝基纤维素膜(加拿大安大略爱美沙生命科学公司(Amersham Life Science，Ontario，Canada)的Hybond-ECL)上。印迹在含13.7mMNaCl、1％Tween-20和2％封闭剂的20mM Tris(pH7.6)(包含于ECL增强试剂盒中)中室温封闭1小时，然后与Bcl-2或Bax兔多克隆抗体(0.35μg/ml；Santa CruzBiotechnology，CA，USA)在4℃孵育过夜，之后与辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体(1∶200000；澳大利亚墨尔本塞尔墨斯实验室(Silemus laboratories，Melbourne，Australia))一起孵育。然后用平板扫描仪扫描图像并通过ImageJ成像系统软件1.3版(美国国立健康研究所(National Institutes of Health，USA))定量测定各样品中Bcl-2和Bax条带的强度。
实施例6 卵母细胞切除术对卵丘细胞凋亡的影响 为确定完全COC是否有不同于OOX的凋亡水平，将5个一组的COC或OOX在50ul培养基液滴中培养24小时，然后评价凋亡。进行6份复制实验。
TUNEL与共焦扫描显微术结合显然是观察和定量测定CC凋亡的高度有效的方法。TUNEL的阳性和阴性对照(图1A和1B；分别为99％和0％凋亡)展现了特异性。COC显示出低CC凋亡发生率(9％；图1C)，而除去卵母细胞导致OOX的凋亡发生率显著升高到35％(p＜0.001；图1D)。在培养基中添加FSH使OOX(降低10％)和COC(降低6％)的凋亡发生率显著降低(p＜0.001；图2)。
实施例7 卵母细胞-分泌的因子对卵丘细胞凋亡的影响 为确定是否是OSF造成完全COC中CC的低凋亡发生率，将OOX与递增数量的DO一起培养并与COC进行比较。在含有5OOX的50μl培养物液滴中加入5、25或50DO。进行3份复制实验。
为确定是否是卵母细胞旁分泌因子造成低COC凋亡，尝试通过将OOX与递增浓度的DO共培养在OOX中诱导COC水平的凋亡。将OOX与递增数量的DO一起培养使CC凋亡以剂量依赖性方式显著降低(p＜0.001)。无论存在或不存在FSH，在DO数目最大时(50DO/孔)，OOX的凋亡水平完全降至COC的水平(图2)。这些结果表明OSF能防止CC凋亡。
实施例8 与OSF源靠近程度相关的凋亡模式 为确定CC复合体内与复合体接近卵母细胞程度相关的凋亡分布情况，我们定量测定了COC的凋亡发生率，其中OSF源位于CC复合体的中心，而在与DO共培养OOX时，OSF源在CC复合体之外。采用共焦显微镜，使用ScanalyticsIPLab软件3.6版，将卵母细胞源的直径扣除，测得复合体的直径。然后将复合体的直径等分成3层内部、中间和外部CC层，从而在卵母细胞周围形成3个环形区域。各层占总半径的33％。然后分别分析各层中凋亡的发生率。
共焦图像的定量观测结果提示，COC中的凋亡细胞大多数分布在复合体外层，而在与DO共培养的OOX中主要在内部卵丘层中观察到凋亡。因此我们假设OSF沿℃各层中形成了抗凋亡形态发生梯度。为验证这种假设，我们测量了COC和OOX复合体的直径，然后将它们分成3层内层、中层和外层(图3A)。在含有完全卵母细胞的COC中，凋亡的发生率从内层向外层显著升高(P＜0.026)(图3B和3C)。相反，当将OOX与DO共培养时，凋亡的发生率从内层向最接近OSF源的外层逐渐降低(图3B和3D)。为进一步阐述这种效应，最接近卵母细胞的COC内层具有最低的凋亡发生率，与OOX+DO组的内层相比，其凋亡发生率低4倍且具有显著性(P＜0.026)，OOX+DO组的内层即最远离DO的层的凋亡发生率最高(图3B)。
实施例9 GDF-9、BMP-6、BMP-15对卵丘细胞凋亡的剂量效应 为检测哪种推定OSF对于在COC中观察到的低凋亡发生率有贡献，在不存在或存在FSH的条件下，将OOX与递增浓度的GDF-9(0-175ng/ml)、BMP-6(0-100ng/ml)或BMP-15(0-20％v/v)一起培养。还用10％(v/v)293H处理OOX，这是作为GDF-9(相当于132ng/ml)和BMP-15(相当于10％(v/v))的亲本细胞系-条件培养基阴性对照。上述实验复制三份，每份中每处理组10个OOX。
进行这些实验以确定这些推定OSF对于调节CC凋亡的影响。用递增剂量的GDF-9、BMP-6和BMP-15处理OOX复合体。在存在或不存在FSH的条件下，GDF-9对CC凋亡发生率没有显著影响，因为最高剂量(175ng/ml)GDF-9的凋亡与293H对照条件培养基组没有显著不同(图4A、4B)。而无论存在或不存在FSH，随着BMP-6剂量的升高，CC凋亡显著降低(P＜0.001)(图4C、D)。用递增剂量的BMP-15处理OOX使CC凋亡以剂量依赖方式显著降低(p＜0.001)，在20％BMP-15时影响最大(图4E)。当将BMP-15与FSH组合使用时观察到类似的反应(图4F)。
实施例10 DO、GDF-9和BMP-15对OOX表达Bcl-2和Bax蛋白的影响 本实验是为了确认以证实处理对CC凋亡产生的影响(据TUNEL测定)是与调节细胞死亡和存活的关键蛋白质的表达变化相伴发生的。OOX培养24小时，期间，对其不作处理，或用132ng/ml GDF-9、10％v/v BMP-15、与35DO/孔共培养、或10％293H(对照条件培养基)进行处理，然后进行Western印迹以分析Bcl-2和Bax的表达。
本项实验是为了研究OOX复合体内CC中Bcl-2和Bax的表达模式。与无处理或用GDF-9处理的OOX相比，与DO和BMP-15共培养使CC中Bcl-2蛋白的表达显著升高(P＜0.001)(图5)。相反，与DO或BMP-15共培养的OOX中，Bax水平几乎测不到，与之相比，不处理或与GDF-9共培养时，CC中Bax蛋白的表达显著升高(P＜0.001)(图5)。这些结果都支持我们的TUNEL结果；即DO和BMP-15，而不是GDF-9，与防止CC凋亡有关，且DO和BMP-15能向有利细胞存活方向改变Bcl-2与Bax的比例(Oltvai等，1993)，而GDF-9对于Bcl-2与Bax的比值没有影响。
实施例11 DO、BMP-6和BMP-15对星形孢菌素诱导的卵丘细胞凋亡的影响 进行初步实验以确定星形孢菌素对牛CC凋亡的影响，星形孢菌素能以剂量依赖方式诱导凋亡(范围为0.1-100μM，未显示数据)。该实验的目的是确定OSF是否能够防止CC发生星形孢菌素诱导的凋亡。使单独的或与35DO、10ng/mlBMP-6或10％(v/v)BMP-15共培养的OOX在24小时培育期的最后6个小时中接触0.1μM或1.0μM星形孢菌素。该实验复制三份，每份中每处理组10个OOX。
该实验的目的是确定卵母细胞是否能够保护CC免受凋亡诱导因素作用，以及BMP-15和BMP-6是否能够模拟这种效应。星形孢菌素使CC的凋亡发生率显著升高(P＜0.001)，当用0.1和1.0μM处理时，分别从41％分别升高到51％和74％(图6)。当将星形孢菌素处理的OOX与DO共培养时，这两种剂量的星形孢菌素诱导凋亡的效应被完全消除，凋亡被降至COC水平。而且，用10％BMP-15或10ng/ml BMP-6处理的OOX在接触上述两个剂量的星形孢菌素时也显示出凋亡显著减低，分别为17％和21％(0.1μM)以及25％和31％(1μM)(P＜0.001)。这些结果表明，OSF的抗凋亡作用能保护CC免遭凋亡伤害，且BMP-15和BMP-6都能模拟这种效应。
实施例12 BMP拮抗剂对卵丘细胞凋亡的影响 促滤泡素抑制素以高亲合力结合BMP-15和活化素并拮抗它们的生物活性(Lin等，2003；Otsuka等，2001)。Grem蛋白在壁GC和CC中都表达并选择性阻断BMP-4和BMP-7(Merino等，1999)，并可能拮抗BMP-15。本实验的目的是检测这些拮抗剂对BMP-6-阻止和BMP-15-阻止的CC凋亡的拮抗功效。在递增剂量的促滤泡素抑制素(0-100μg/ml)存在下或在递增剂量的grem蛋白(0-40μg/ml)存在下，将OOX与10％(v/v)BMP-15一起培养。在另一个实验中，在不存在或存在高剂量(20μg/ml)BMP-6单克隆中和抗体(NAb)的条件下用10ng/ml BMP-6处理OOX。这些实验各自复制三份，每份中每处理组10OOX。
进行这些实验以检测BMP-15和BMP-6拮抗剂是否能够中和BMP-15和BMP-6对CC凋亡的抗凋亡效应。
当BMP-15处理的OOX与递增浓度的促滤泡素抑制素一起培养时，凋亡显著地(P＜0.001)、剂量依赖性地升高(图7A)。用高剂量(20μg/ml)的BMP-6中和抗体处理与10ng/ml BMP-6一起培养的OOX复合体。图7B显示，BMP-6拮抗剂显著(P＜0.001)中和10ng/ml BMP-6的抗凋亡效应。
实施例13 BMP-15和BMP-6在卵母细胞抗卵丘细胞凋亡功能中的作用 为中和卵母细胞对CC的抗凋亡生物活性，在不存在或存在50μg/ml促滤泡素抑制素、20μg/ml BMP-6Nab、或存在这两种拮抗剂的条件下，将OOX与25DO共培养。另外进行实验检测BMP-15和BMP-6相比OOX+DO是否有任何累加效应。OOX用DO处理，或用10ng/ml BMP-6和/或10％v/v BMP-15处理。将这些实验复制三份，每份中每个处理组采用10OOX。
为进一步检测卵母细胞对CC的抗凋亡效应是否可归结于BMP-15和/或BMP-6，纯用促滤泡素抑制素或用促滤泡素抑制素和BMP-6中和OSF。图8A显示，与卵母细胞共培养的OOX可使CC凋亡发生率相比单独的OOX降低，降低后的水平可与COC对照相比。单独的促滤泡素抑制素或单独的BMP-6Nab能显著拮抗约50％的卵母细胞抗卵丘细胞凋亡效应(P＜0.001)。促滤泡素抑制素和BMP-6Nab的效应不是累加的，因为当它们联合存在时不能进一步降低凋亡水平。
图8A的结果提示，卵母细胞-分泌的BMP-15和BMP-6各自都能防止CC凋亡，有其一既可，因此不以累加方式发生作用。进行实验以检测这种说法。将OOX与DO共培养或者仅用BMP-15或者仅用BMP-6处理能显著(P＜0.001)降低CC凋亡(图8B)。用BMP-6和BMP-15组合处理OOX不会使凋亡水平相比单独的BMP-15进一步降低(P＞0.05)，提示这两种BMP没有累加效应。
实施例14 BMP-7及其拮抗剂grem蛋白对卵丘细胞凋亡的影响 为了检查BMP-7及其拮抗剂，grem蛋白，对CC凋亡的影响，在2μg/ml grem蛋白存在或不存在的条件下，用100ng/ml BMP-7和/或10％BMP-15处理OOX。实验复制三份，每份的每个处理组采用10OOX。
进行该实验以检测在存在BMP-15时加入BMP-7及其拮抗剂grem蛋白对于调节CC凋亡的影响。BMP-7和BMP-15显著降低卵丘细胞凋亡(P＜0.001；图9)。当将BMP-15处理的OOX与递增剂量的grem蛋白一起培养时凋亡不会显著升高(图9A)。相反，2μg/ml grem蛋白能显著(P＜0.001)逆转100ng/ml BMP-7的抑制效应，但当存在BMP-15时则不是如此(图9B)。
实施例15 统计分析 采用SigmaStat软件(伊利诺斯州芝加哥SPSS公司(SPSS Inc，Chicago，IL))通过ANOVA分析卵丘细胞的凋亡频率，并采用Tukey-Kramer事后比较分析(Tukey-Kramer post-hoc test)检测平均值之间的显著差异以便进行多个平均值的比较。对所有细胞比例数据进行反正弦转换之后再分析。当p＜0.05时认为差异是统计学上显著的。
讨论-研究I 该研究证实，通过卵母细胞切除术从COC中除去卵母细胞导致CC凋亡显著升高。然而，将OOX与卵母细胞共培养可恢复低凋亡水平，卵母细胞能以剂量依赖性方式降低凋亡发生率，且在50DO/孔的最大浓度时能完全恢复至COC水平。这些发现证实，低CC凋亡水平极大程度上依赖于卵母细胞的存在。此外，特有的低CC凋亡发生率可特别归因于卵母细胞的可溶性旁泌信号而并非卵母细胞向CC的间隙连接信号传导，这是因为在缺乏卵母细胞-CC直接接触的共培养环境下观察到了这些效应。
该研究证实，卵母细胞通过建立OSF形态发生梯度而有效防止CC凋亡。首先，通过两种不同方法评价CC凋亡的降低TUNEL和定量共焦显微术。还通过Western印迹测定调节凋亡的关键蛋白质的表达。使OOX接触卵母细胞能显著诱导抗凋亡Bcl-2表达。相反，促凋亡Bax的表达在独处的OOX中较高，而OSF可使其显著降低。这些结果表明，卵母细胞能通过向有益于细胞存活方向改变Bax与Bcl-2的比值从而防止CC凋亡。其次，卵母细胞的抗凋亡作用从卵母细胞的位置开始形成一个梯度。在完全COC中，最内层CC的凋亡发生率最低，并随着远离卵母细胞而升高。相反，在卵母细胞位于复合体外部而OOX呈中空的OOX+DO中，最靠近卵母细胞的外层CC具有最低的凋亡水平。这是COC中OSF高度地域化形态发生梯度的第一直接证据。第三，OSF能够保护CC免遭凋亡损伤。星形孢菌素通过细胞信号级联诱导凋亡(尚不完全清楚)而不是造成散在性DNA损伤。OSF能阻止星形孢菌素诱导的凋亡证明，卵母细胞能够保护CC免遭凋亡诱导因素的作用。综合这些结果证明，卵母细胞能够分泌一种或多种以高度地域化的方式发挥作用的强效抗凋亡因子。
在培养基中添加FSH也还降低COC和OOX中CC凋亡的发生率。这与其他研究以及FSH是驱使卵泡生长的一种必不可少的激素而卵泡闭锁的主要原因是未充分接触FSH的提法相一致。
GDF-9对于CC凋亡发生率没有显著影响，尽管GDF-9是异常有效的GC促分裂原。相反，BMP-15、BMP-6和BMP-7能显著降低CC凋亡，而这些都是弱促分裂原。本研究提供了是BMP信号传导而非GDF-9信号传导阻止了CC凋亡的多方面证据1)所有这三种测试的BMP都能以剂量依赖性方式降低CC凋亡的发生率，2)BMP-6和BMP-15都能保护CC免遭星形孢菌素诱导的凋亡，3)BMP-15能刺激CC抗凋亡凋亡Bcl-2表达，而GDF-9不能，与之相对的是，4)BMP-15能抑制促凋亡蛋白Bax表达，而GDF-9不能。这些发现支持以下观点，即Bcl-2与Bax之比决定了细胞将存活或死亡，且BMP-15和BMP-6可调节这一比例。
存在被TGF-β超家族激活的两条信号传导途径分枝BMP途径和TGFβ/活化素途径。GDF-9信号经ALK5受体传导，激活SMAD 2/3分子并因此引发TGF-β-样胞内应答。另一方面，BMP-15、BMP-6和BMP-7信号经ALK6和BMPRII受体传导，从而激活另一途径即SMAD 1/5/8途径。因此，牛OSF似乎能同时激活CC内的这两种信号传导途径；BMP-15和BMP-6激活SMAD 1/5/8途径从而引发卵母细胞的抗凋亡作用，另一方面，GDF-9激活SMAD 2/3途径而引发卵母细胞的丝裂信号。
本研究的另一个目的是尝试鉴定能防止CC凋亡的原生(native)OSF。为此，最方便的做法是实验中和卵母细胞对CC的效应，因为迄今尚无法真正纯化OSF。有数种高亲和性结合蛋白拮抗BMP的作用，其中包括促滤泡素抑制素和grem蛋白。促滤泡素抑制素(在发育中的卵泡中由GC高度表达)通过形成无活性复合体而抑制活化素和BMP-15的生物活性。在本发明的研究中，促滤泡素抑制素和一种BMP-6中和抗体能够分别拮抗BMP-15和BMP-6的抗凋亡作用。Grem蛋白(在GC和CC中表达并已知是BMP-2、BMP-4和BMP-7的拮抗剂)不拮抗BMP-15的抗凋亡作用。
我们接下来检测了BMP拮抗剂中和卵母细胞抗凋亡作用的能力。单用促滤泡素抑制素或BMP-6中和抗体能够部分拮抗卵母细胞的抗凋亡作用，这提示牛卵母细胞的这种作用可能部分归因于BMP-15和/或BMP-6。这些发现描述了这些卵母细胞分泌分子的全新功能。BMP-15和BMP-6之一似乎就足以防止卵丘细胞凋亡。这两种重组蛋白一起使用对于凋亡没有累加效应，同时由BMP-15和BMP-6中和天然卵母细胞的效果并不高于各自单用。这些数据提供了证明内源性BMP-15和BMP-6卵母细胞蛋白是重要的抗凋亡OSF的第一手直接证据。
在本研究中，我们证明，BMP-7可模拟卵母细胞-分泌的BMP-15或BMP-6在预防CC凋亡中的作用，尽管它不是一种OSF且仅由卵泡泡膜表达。已知能高度有效拮抗BMP-2和BMP-4的作用的Grem蛋白能中和BMP-7的抗凋亡效应，但对BMP-15无效。因此，卵母细胞内源产物BMP-15对CC的抗凋亡作用不受联合存在BMP-7和grem蛋白的影响。
研究II含裸卵母细胞培养系统中牛卵丘-卵母细胞复合体的发育能力卵母细胞-分泌因子的作用 实施例16 牛卵母细胞的采集和培养条件 除非另有说明，所有化学药品和试剂均购自密苏里州圣路易斯的西格玛公司。
从本地屠宰场采集牛卵巢并在温盐水(30-35℃)中运送到实验室。用18号针头和10ml针筒从窦状卵泡(直径为2-8mm)中吸出卵丘-卵母细胞复合体(COC)，针筒中装有约2ml添加有50μg/ml卡那霉素、0.5mM丙酮酸钠、50μg/ml肝素和4mg/ml无脂肪酸的牛血清白蛋白(FAF-BSA)(新西兰奥克兰的ICP生物有限公司)的抽吸培养基(Hepes缓冲组织培养培养基-199TCM-199，美国加利福尼亚州俄弗因的ICN生化制品公司)。在解剖显微镜下选择具有大于5个细胞层的致密卵丘外衣和均匀染色的细胞质的完全COC，用Hepes-缓冲的TCM-199洗涤两次并用添加有10％胎小牛血清(FCS)(加州卡尔斯拜德因维曲根公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))的Hepes-TCM199洗涤一次。卵母细胞成熟的基础培养基为牛VitroMat(澳大利亚库克公司(Cook Australia，Eight Mile Plain，Qld，Australia))，这是一种基于牛卵泡液离子组合物并含有100μm甘氨酰谷氨酰胺(Glutamax；美国加州卡尔斯拜德基伯科因维曲根公司(Gibco Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))、100μm N-乙酰-1-半胱氨酸、100μm 2-半胱胺、1％v/v非必需氨基酸(100x；基伯科因维曲根公司)、2％v/v必需氨基酸(50x；基伯科因维曲根公司)、4mg mL-1无脂肪酸的BSA和5.6mm葡萄糖的培养基。所有IVM处理添加0.1IU/ml FSH(Puregon，Organon，Oss，荷兰)。将复合体与预平衡的50ml液滴一起于5％CO2、39℃的湿润空气中培育24小时，培养基用矿物油覆盖。
实施例17 处理卵丘-卵母细胞复合体 (i)产生裸化卵母细胞 将COC在2ml H-TCM-199/BSA中涡漩振荡约4分钟除去CC以产生裸化卵母细胞(DO)。将卵母细胞在H-TCM-199/BSA中反复通过细口烧边玻璃移液管以除去所有残余的卵丘细胞。
(ii)生长因子 按照之前的描述(Kaivo-Oja等，(2003)J Clin Endocrinol Metab 88，755-62；McNatty等，(2005)Reproduction 129473-480)用经转染的293人胎肾细胞系(293H)自行制造重组小鼠GDF-9和重组绵羊BMP-15。按照最新描述(Hickey等，(2005)Biol Reprod，在线)将重组蛋白质用疏水相互作用色谱(HIC)部分纯化，然后通过Western印迹估算它们的浓度(Kaivo-Oja等，(2003)J Clin Endocrinol Metab 88755-762)。另由未转染的293H细胞制造了对照条件培养基(293H)并通过HIC纯化。
(iii)体外授精和胚胎培养 所有实验都用来自生育力经验证的同一头公牛的冷冻精子进行。简言之，将一串保存在液氮中的精子在水浴中快速解冻1分钟。将精子样品铺放在不连续(45％90％)珀可(Percoll)梯度(爱美沙生物科技公司)顶层并在室温以700g离心20-25分钟。除去上清，用500ml牛体外洗液(Bovine Vitro Wash，澳大利亚库克公司)洗涤精子团并再在200g离心5分钟。精子用IVF培养基(牛体外授精培养基(Bovine Vitro Fert)，库克公司)重悬，然后加入授精培养基液滴(牛体外授精培养基，库克公司，添加有0.01mM肝素、0.2mM青霉素和0.1mM亚牛磺酸)，使精子的终浓度为1×106精子/ml。在39℃、6％CO2的加湿空气中在培养基中对COC进行24小时的授精，培养基密度为10ml IVF培养基/COC。
授精后23-24小时，通过温和移液管抽吸除去卵丘细胞，将5个推定的合子转移至20μl预平衡的库克牛卵裂培养基(Cook Bovine Cleave medium)液滴(改进的SOFaa，库克公司)并在矿物油覆盖下于38.5℃和7％O2、6％CO2、其余为N2的气氛下培养5天(第1天-第5天)。
在第5天，将胚胎以5-6个一组转移到20ml预平衡的牛体外胚泡液滴(库克牛胚泡培养基；库克公司)，用矿物油覆盖并于38.5℃培养到第8天。在第8天按照国际胚胎移植协会手册中的定义评价胚胎，评价由有经验的牛胚胎学家以盲试方式独立进行。
实施例18 统计分析 采用SigmaStat软件(伊利诺斯州芝加哥SPSS公司)通过ANOVA进行统计分析，采用Tukey-Kramer事后比较分析检测平均值之间的显著差异以便进行多个平均值的比较。对所有细胞比例数据进行反正弦转换之后再分析。当p＜0.05时认为差异是统计学上显著的。
实施例19 IVM期间将完全COC与DO共培养对随后胚胎发育能力的影响 为测定卵母细胞-分泌的因子对卵母细胞发育能力的影响，在体外成熟(IVM)期间将卵丘-卵母细胞复合体随机分成4个处理组。IVM之后对所有的复合体和卵母细胞授精，并在第8天评价胚泡形成的质量。
处理(1)将20个裸卵母细胞在200ml液滴中培育24小时(DO；图1A)。处理(2)将20个卵丘卵母细胞复合体在200ml液滴中培育24小时，(COC；图1B)。处理(3)从0小时开始将20个COC与100个裸卵母细胞一起在200ml液滴中共培养24小时，IVM之后将其中的20个复合体(COC-0h；图1C)和20个裸露的卵母细胞(DO-1h；图1D)授精。处理4在前9个小时，20个COC在200ml IVM培养基中熟化，是为完全COC。同时，取100个COC熟化9小时，然后裸化，之后再将所得的100个DO转移到20个COC中一起继续后15小时的成熟。相处理3一样，然后如前所述对20个复合体(COC-9h；图1E)和20个裸卵母细胞(DO-9h；图1F)授精。实验复制7份。
将1个COC与5个DO一起在10ml液滴中培养，时DO的浓度为0.5DO/ml，该浓度处于用来检测卵母细胞分泌因子的影响的特有范围内。
结果提供于表1以及图11和12。
表1 IVM期间将完全COC与DO共培养对随后胚胎发育能力的影响
*数值表示为平均值±SEM。
可见，与单独培养的COC相比(40％；图12)相比，在第0或9小时，完全卵丘-卵母细胞复合体与裸卵母细胞共培养可显著(P＜0.001；图12)增加受精后到达胚泡期的卵母细胞的数目(分别为50％和61％)，这表明裸卵母细胞分泌的旁泌因子增强了COC发育到胚泡期的能力。此外，卵母细胞在IVM的前9个小时在与完全卵丘细胞交互作用下成熟，然后化，并在IVM的后15个小时与复合体一起培育，使第8天时的胚泡数显著增加。
存在卵丘细胞(来自相邻COC)不会提高DO(DO-0h)的发育能力，其胚泡率与单独培养的DO(DO)类似(图12)。与完全COC相比，IVM之前除去卵丘细胞能显著(P＜0.001；图12)降低受精后到达胚泡期的卵母细胞的数目(分别为12％和40％)。与单独培养的DO相比，带有完全卵丘的卵母细胞成熟完全9小时后再裸化，与DO相比，能显著(P＜0.001；图12)提高胚泡率(分别为12％、25％)。
在裸卵母细胞处理之间，或在卵丘-卵母细胞复合体处理之间，卵母细胞卵裂没有显著差异(图11)，但裸化总体上显著降低随后的受精率。然而，裸卵母细胞和卵丘-卵母细胞复合体之间的多精入卵发生率(通过用DNA荧光H33349染色的卵母细胞同龄组来评估)是相同的(数据未显示)。
实施例20 GDF-9、BMP-15(单独和组合)对卵母细胞发育能力的影响 为检测哪种卵母细胞-分泌因子对观察到的COC发育能力有贡献，在存在或不存在10％293H(对照条件培养基)、10％BMP-15、175ng/ml GDF-9或BMP-15+GDF-9的条件下，将复合体培养24小时，采用与前述IVM系统。这些实验复制三份，每份中每个处理组采用25个COC。
如表2所示，与单独用GDF-9处理的COC和不存在任何添加物条件下成熟的COC相比，单用GDF9或联用BMP 15可更有效地提高受精后达到胚泡期卵母细胞的数目。
表2 GDF-9、BMP-15(单独和组合)对卵母细胞发育能力的影响 实施例21 卵母细胞旁分泌信号通过TGF-β超家族分子向卵丘细胞传导是卵丘扩展必不可缺的 TGF-β超家族的成员是小鼠卵丘扩展-促发因子(CEEF)的主要候选物。进行该研究以检测TGF-β超家族调节卵丘扩展的过程。从eGG初免小鼠采集COC并通过显微外科手术除去卵母细胞以产生卵母细胞切除(OOX)复合体。用已确立的评分系统来测量FSH-诱导的卵丘扩展0(无扩展)至+4(最大扩展)。仅用FSH处理的OOX复合体无法扩展(评分0)，而用GDF9(评分(平均值±SEM)3.7±0.1)、活化素A(2.6±0.1)或与卵母细胞共培养(评分3.2±0.2)可显著(p＜0.05)诱导扩展。GDF9和活化素的I型受体分别是ALK5和ALK4。我们检测了ALK4/5/7激酶抑制剂对于中和卵丘扩展的能力。数据显示于图13至15。
可以看到，抑制剂能完全中和GDF-9和卵母细胞诱导的卵丘扩展(图13)，且抑制剂还能完全消除GDF-9和卵母细胞诱导的颗粒细胞DNA合成(图14)。
抑制剂还能完全消除TGF-β1、GDF9和卵母细胞激发的Smad2/3分子活化，CAGA-萤光素酶活性被抑制证明了这一点(图15A和15B)。
促滤泡素抑制素(一种活化素拮抗剂)也能有效中和OOX复合体对活化素的反应(评分0)，但它对与卵母细胞共培养的OOX复合体的扩展(评分2.7±0.2)没有显著影响(p＞0.05)。该研究提供的证据表明活化素不是唯一的CEEF，但通过ALK4/5/7途径的信号传导是小鼠卵丘扩展必不可缺的。
实施例22 研究III-生长分化因子9信号传导系统调节绒猴颗粒细胞的增殖 介绍和目的 卵母细胞通过分泌作用于相邻颗粒细胞(GC)的旁泌生长因子来调节卵泡的生长和发育。在人和非人灵长类中，主要由于缺乏卵母细胞和非黄体化(nonluteinized)GC，对于这些卵母细胞-因子或它们利用的GC受体/信号传导系统知之甚少。该研究的目的是鉴定普通绒猴(Callithrix jacchus)中卵母细胞-分泌的生长分化因子9(GDF9)用来促进的GC生长的受体/信号传导系统。
方法 (i)动物 该研究采用了7只成年雌性绒猴，让它们住在伊丽莎白皇后医院动物病房(TheQueen Elizabeth Hospital Animal House)。该研究经当地动物伦理委员会批准并按照研究动物护理和应用指导原则进行。
通过连续6天、每天注射两次hFSH(50IU/天)来初免雌性绒猴，在卵泡期的第7天取出完整的卵巢。
(ii)GC培养 人工切取卵泡并按大小分成3组外周窦(PA；0.42-0.66mm)、小窦(SA；0.66-1.5mm)和大窦(LA；＞1.5mm)。采集各种卵泡大小的GC并混合，然后用添加有0.3mg/ml聚乙烯醇(PVA，西格玛公司)的碳酸氢盐-缓冲的组织培养基-199(B-TCM)洗涤两次。根据各个实验，在96孔板(Falcon)的孔中加入壁GC(1×105细胞/mi)、激素、抑制剂和培养基至最终体积为125μl。在各实验中，所有处理都至少以双复孔进行，且各实验被重复至少3次。将细胞在37℃、96％湿度、含5％CO2的空气中培育18小时，然后再在相同条件下用15.4kBq氚化胸苷(3H-胸苷，ICN)脉冲6小时。培养之后，收获壁GC，用闪烁计数器定量测定掺入的3H-胸苷，将其作为S期细胞比例的指标，从而提供壁GC DNA合成和增殖水平的指示(30)。
(iii)RNA和RT-PCR 通过RT-PCR检测颗粒细胞表达核糖体蛋白-L19(L19)、2型骨形态发生蛋白受体(BMPRII)、活化素受体样激酶5(ALK5)和Smad 3mRNA的情况。如上所述采集MGC。将各种卵泡大小的100,000细胞转移到冰上的离心管内，用RLT缓冲液(澳大利亚克利夫顿山恰根公司(Qiagen，Clifton Hill，Australia))溶胞并用液氮急冻，然后储存于-80℃。
采用微量RNA分离试剂盒(澳大利亚克利夫顿山恰根公司)分离RNA。操作过程包括在各样品中加入20ng载体RNA，然后均质，用DNA酶处理所有样品以除去所欲杂基因组DNA。
用Ribogreen RNA定量试剂盒(俄勒冈州尤金的分子探针公司(MolecularProbes，Eugene，OR))按照制造商的说明定量测定RNA。
采用随机引物(德国曼海姆博林格公司(Boehringer Mannheim，Germany))和Superscript II RT试剂盒(纽约州格兰德岛生命科技公司(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY))按照制造商的说明反转录70ng RNA。用水代替RNA制备阴性RT对照。
用HotStarTaq DNA聚合酶试剂盒(澳大利亚克利夫顿山恰根公司)中提供的试剂进行PCR扩增。各反应的组成为2.5μl Qiagen 10X缓冲液、0.4mM各dNTP(澳大利亚应用生物系统(Applied Biosystems，Australia))、0.5U HotStarTaq DNA聚合酶、0.56μM各种引物、1μl cDNA(1∶4稀释)，用超纯水(澳大利亚佩思费雪生物技术公司(Fisher Biotech，Perth，Australia))使终体积达到25μl。每次运行PCR时都包括原本以水代替cDNA的阴性PCR对照。一开始在95℃将聚合酶活化5分钟，然后进行40轮扩增循环，每轮包括95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟，最后72℃延伸7分钟。然后将产物在2％琼脂糖凝胶上跑电泳以确认正确大小的产物。最后通过测序鉴定各种PCR产物的同一性。
因为没有缺乏绒猴序列数据，采用引物速成(Primer Express)软件(加州福斯特城PE应用生物系统(PE Applied Biosystems，Foster City，CA))用人L19，BMPRII、ALK5和Smad3设计引物对，并由澳大利亚阿德莱德基因工作室(Geneworks，Adelaide，Australia)合成。所有引物对被设计成从旁包围一个内含子。该研究采用的引物的寡核苷酸序列列于表1。
(iv)萤光素酶 采用响应特异性磷酸化Smad的萤光素酶受体构建物来检测重组GDF9对壁GC Smad蛋白的活化。如上所述采集并处理壁GC，但最终用DMEM(澳大利亚七山MP生物医学公司(MP Biomedicals，Seven Hills，Australia))+2％FCS(澳大利亚卡斯特山特瑞斯生物科技公司(Trace Biosciences，Castle Hill，Australia))洗涤细胞。最终洗涤之后将细胞转移到96孔板(Falcon)的各孔内并以1.6×105细胞/ml的密度培养。培养4小时后，采用Fugene 6(澳大利亚卡斯特山罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostics，Castle Hill，Australia))用50ng萤光素酶受体构建物DNA瞬时转染细胞。转染后18小时，从细胞中吸出培养基并更换成添加有0.1％FCS的DMEM。此时在细胞内添加各种配体(见下文)并继续培养48小时。从细胞中除去培养基并将平板于-20℃冷冻，由此结束实验。为收获细胞，在各孔内加入100μl溶胞缓冲液并将平板在摇床上室温孵育20分钟。用20μl细胞溶解产物，采用Galaxystar光度计(德国奥芬博格GMB标记技术公司(GMB Labtechnologies，Offenburg，Germany))来测量萤光素酶活性。
(v)Stat 用hFSH将7只成年雌性绒猴初免6天，在第7天取出完整的卵巢，人工切取卵泡，然后采集3种大小的GC外周窦(PA；0.42-0.66mm)、小窦(SA；0.66-1.5mm)和大窦(LA；＞1.5mm)。采用四种不同方法来研究GC中的GDF9作用。从卵母细胞、卵丘细胞(CC)和GC提取RNA，用人引物对其进行RT-PCR以确认被认为参与其他物种中GDF9信号转导的受体/胞内信号传导分子的表达。为研究GDF9信号传导途径，用CAGA-萤光素酶或BRE-萤光素酶受体构建物转染来自LA卵泡的培养的GC，并用各种TGF-β超家族生长因子处理或与小鼠卵母细胞共培养。为确定GDF9对绒猴GC增殖的影响，我们采用GC生物测定，该测定检测24小时的3H-胸苷的掺入，以此作为DNA合成和细胞增殖的指标。用各种浓度的GDF9单独处理或与FSH和/或IGF1一起处理细胞。在另一个实验中，在存在GDF9+/-IGF1的条件下，用递增剂量的活化素样激酶(ALK)4/5/7抑制剂SB431542处理GC。
结果 实验1卵母细胞的GDF9mRNA表达 对外周、小窦状或大窦状卵泡中裸露卵母细胞的cDNA进行RT-PCR。不出所料，各种大小的卵母细胞都表达GDF9mRNA(图16)。通过测序验证了PCR产物的同一性。
实验2GC的GDF9信号传导途径分子表达 该实验确定来自小窦状和大窦状卵泡的GC是否表达以下三种关键GDF9信号传导途径分子的mRNA骨形态发生蛋白受体II、ALK5和Smad3。在来自小窦状和大窦状卵泡的GC中都检测到所有三种转录物的mRNA表达(图17)。所有PCR产物经测序显示出与相应的人序列的同源性。
实验3Smad胞内信号传导途径的活化 该实验确定来自大窦状卵泡的GC是否能够响应TGF-β和/或BMP信号。用CAGA或BRE萤光素酶质粒构建物转染细胞，然后用TGF-β1、GDF9、BMP7或卵母细胞处理。TGF-β1、卵母细胞和GDF9刺激产生的CAGA-萤光素酶活性分别超过对照水平19倍、6倍和5倍，但BMP7无此激发效果(图18A)。相反，BMP7刺激的BRE-萤光素酶活性为对照水平的31倍，但TGF-β1、GDF9或卵母细胞无此刺激效果(图19B)。
实验4GDF9通过TGF-β/活化素信号传导途径刺激颗粒细胞增殖 我们接下来用ALK 4/5/7激酶抑制剂来提供GDF9能通过TGF-β/活化素信号传导途径来促进GC增殖的另一项证据。抑制剂SB431542特异性拮抗ALK4、ALK5和ALK7的激酶活性但不影响ALK6的活性(Inman 2002)。我们之前已经证实SB431542在小鼠中剂量依赖性地抑制TGF-β1、GDF9和卵母细胞-刺激的壁GC生长。我们在本次研究中采用来自大窦状卵泡的绒猴GC，还证明GDF9刺激的DNA合成在存在SB431542时被剂量依赖性地抑制(图18)。浓度为1μM的激酶抑制剂能完全消除GDF9的刺激作用。
实验5来自外周窦状卵泡的壁颗粒细胞具有较高促有丝分裂指数 在该实验中我们关注来自不同大小卵泡的壁颗粒细胞响应GDF9的生长促进活性的能力。大致上，来自大卵泡的GC的DNA合成最低(399cpm/12,500细胞)，而来自外周窦状卵泡的GC的DNA合成最高(5936cpm/12,500细胞)(图19)。
GDF9和卵泡大小对壁颗粒细胞DNA合成的影响 图20显示了用递增剂量的GDF9(0-350ng/ml)处理24小时的小和大窦状卵泡的壁GC。在培养期结束时测量掺入的3H-胸苷。各点代表7份复制实验的平均cpm/12,500细胞+/-SEM。
GDF9与FSH和/或IGF1的组合对壁颗粒细胞DNA合成的影响 图21显示了与FSH和/或IGF-1组合的GDF9对壁颗粒细胞DNA合成的影响。将来自小(A)或大(B)窦状卵泡的壁GC与GDF9(175ng/ml)、rhFSH(50mIU/ml)和IGF-1(25ng/ml)的组合一起培养24小时。各柱代表7份复制实验的平均cpm/12,500细胞+/-SEM。
GDF9+/-BMP 15对壁颗粒细胞DNA合成的影响 图22显示了GDF9+/-BMP 15对壁颗粒细胞DNA合成的影响。将来自小(A)或大(B)窦状卵泡的壁GC与GDF9(175ng/ml)或BMP15(10％)或者与这两者的组合一起培养。各柱代表3份复制实验的平均值+/-SE。
结论 该研究确定了卵母细胞分泌因子GDF9刺激灵长类颗粒细胞增殖的分子基础。从卵泡发育早期到晚期，绒猴CC和GC具有响应GDF9所需的分子组分。实际上，GDF9刺激所有大小卵泡中GC的DNA合成，但在小卵泡中最显著，尤其是，与IGF1具有协同作用。随着绒猴GC在排卵前的分化，它们变得对GDF9没有反应。GDF9通过利用TGF-β信号传导系统的组分和诱导TGF-β-样胞内应答调节绒猴GC增殖。
实施例23 研究IV-卵母细胞-分泌的因子能增强卵母细胞的发育能力 材料和方法 卵母细胞的采集和培养条件 除非另有说明，所有化学药品和试剂均购自密苏里州圣路易斯的西格玛公司。从本地屠宰场采集牛卵巢并在温盐水(30-35℃)中运送到实验室。用18号针头和10ml针筒从窦状卵泡(直径为2-8mm)中吸出COC，针筒中装有约2ml添加有50μg/ml卡那霉素、0.5mM丙酮酸钠、50μg/ml肝素和4mg/ml无脂肪酸的牛血清白蛋白(FAF-BSA)(新西兰奥克兰的ICP生物有限公司)的抽吸培养基(Hepes缓冲组织培养培养基-199TCM-199，美国加利福尼亚州俄弗因的ICN生化制品公司)。在解剖显微镜下选择具有大于约5个细胞层的致密卵丘外衣和均匀染色的细胞质的完整COC，用Hepes-缓冲的TCM-199洗涤两次并用添加有10％胎小牛血清(FCS)(加州卡尔斯拜德因维曲根公司)的Hepes-缓冲的TCM-199洗涤一次。卵母细胞成熟的基础培养基为牛VitroMat(澳大利亚库克公司)，这是一种基于牛卵泡液离子组合物的培养基。所有IVM处理添加0.1IU/ml FSH(Puregon，Organon，Oss，荷兰)。将复合体与预平衡的300□l液滴一起于5％CO2、39℃的加湿空气中培育24小时，培养基用矿物油覆盖。
产生裸卵母细胞 将COC在2ml Hepes-缓冲的TCM-199中涡漩振荡约4分钟除去CC以产生裸化卵母细胞(DO)。将卵母细胞在TCM-199中反复通过细口烧边玻璃移液管来除去所有残余的卵丘细胞。
生长因子和拮抗剂 按照之前的描述用转染的293人胎肾细胞系(293H)自行制造重组小鼠GDF-9和重组绵羊BMP-15，293人胎肾细胞系(293H)最初由O.Ritvos(赫尔辛基大学(University ofHelsinki))惠赠。从未转染的293H细胞制造对照条件培养基(以后称为‘293H’)，并和GDF9和BMP 15条件培养基一样进行层析。
将Glaxo SmithKline(英国史蒂文艾基(Stevenage，UK))惠赠的SB-431542用作竞争性ATP结合位点激酶抑制剂，它特异性拮抗活化素受体样激酶(ALK)4、5和7的活性，但不影响ALK 1、2、3或6及其他细胞激酶的活性。因此，SB-43l542强效拮抗ALK 4/5配体TGF-β1、活化素和GDF9，但不影响BMP信号传导(Inman等，2002；Gilchrist等，2006)。我们最近证实，SB-431542完全拮抗原生OSF和GDF9对颗粒细胞的生长促进作用。促滤泡素抑制素-288由S.Shimasaki(美国加州大学圣地亚哥分校(University of California San Diego，USA))惠赠，我们之前已经证实这种结合蛋白拮抗原生OSF和重组BMP 15在CC中的生物活性。
体外授精和胚胎培养 采用确定组成的无血清培养基(牛体外(Bovine Vitro)培养基系列，库克公司)体外产生胚胎。所有实验都用来自生育力经验证的同一头公牛的冷冻精子进行。简言之，将解冻的精子铺放在不连续(45％∶90％)珀可梯度(爱美沙生物科技公司)顶层并在室温以700g离心20-25分钟。除去上清，用500μl牛体外洗液(库克公司)洗涤精子团并再在200g离心5分钟。精子用IVF培养基(牛体外受精培养基，库克公司)重悬，然后加入授精培养基液滴(牛体外受精培养基，库克公司，添加有0.0l mM肝素、0.2mM青霉素和0.1mM亚牛磺酸)，使精子的终浓度为1×106精子/ml。在39℃、6％CO2的加湿空气中在培养基中对COC进行24小时的授精，培养基密度为10ml IVF培养基/COC。
受精后23-24小时，通过温和移液管抽吸除去CC，将5个推定合子转移至20μl预平衡的库克牛卵裂培养基液滴(库克公司)，在矿物油下于38.5℃和7％O2、6％CO2、其余为N2的气氛下培养5天(第1天-第5天)。
在第5天，将胚胎以5-6个一组转移到20μl预平衡的牛体外胚泡液滴(库克公司)，用矿物油覆盖并于38.5℃培养到第8天。在第8天按照国际胚胎移植协会手册(Stringfellow，1998)中的定义评价胚胎，评价由有经验的牛胚胎学家以盲试方式独立进行。
区别染色 采用Fouladi-Nashta等(2005)所述技术的改进形式进行细胞技术。简言之，将扩展/孵化的胚泡置于酸性Tyrode溶液中以除去透明带，然后用4mg/mL聚-乙烯醇(PVA)的磷酸缓冲盐水(PBS/PVA)简单冲洗。然后将无透明带胚胎在10mM三硝基苯磺酸(TNBS)存在下在PBS/PVA中于4℃培育10分钟。之后将胚胎与0.1mg/mL抗-二硝基酚-BSA抗体(美国俄勒冈州尤金的分子探针公司)一起37℃孵育10分钟。之后用豚鼠补体进行补体介导的溶胞，胚胎经洗涤后与10μg/mL碘化丙锭一起37℃孵育20分钟(以染色滋养外胚层)，然后与4μg/mL双苯酰亚胺(Hoechst 33342；西格玛公司-Aldrich)一起在100％乙醇中4℃培育过夜(以同时染色内细胞团(ICM)和滋养外胚层)。然后将胚胎整个固定在显微镜载玻片上的一滴80％甘油的PBS溶液中，盖上盖玻片后用指甲油密封。然后用装备有紫外滤光片和数码照相机的荧光显微镜(日本东京奥林巴斯公司(Olympus，Tokyo，Japan))放大400X检测胚胎，以测定内细胞团(ICM)的核呈蓝色而滋养外胚层(TE)的核被染成粉红色的区室细胞数和总细胞数。
实验1IVM期间将完全COC与DO共培养对随后发育能力的影响 为确定原生OSF对卵母细胞发育能力的影响，在IVM期间将COC随机分配到2个处理组处理(1)，将30个COC在300μl液滴中培育24小时，处理(2)，将30个COC和150个DO一起在300μl液体中共培养0-24小时，之后取出这30个复合体授精(图24)。处理2在10μl液滴中产生的COC与DO之比为1∶5，得到的DO浓度为0.5DO/μl，该浓度在用来检测OSF的影响的特有范围之内。IVM之后对所有复合体授精，并在第8天估算胚泡形成的数量和质量。进行6份复制实验。
实验2IVM期间BMP 15和/或GDF9对卵母细胞发育能力的影响 该实验确定在IVM期间加入外源重组OSF、GDF9和/或BMP 15是否能改善随后卵母细胞的发育能力。如上所述将COC在基础IVM培养基中培养24小时，附加以下处理1)无(对照)，2)175ng/ml GDF9，3)10％v/v BMP15，4)10％v/vBMP15和175ng/ml GDF-9，以及5)10％v/v 293H。IVM之后，对所有复合体授精，并在第8天评价胚泡形成。对这些实验进行4份复制实验，每份复制实验每个处理组使用50个COC。
实验3和4GDF9或BMP 15拮抗剂对卵母细胞发育能力的影响 该实验的目的有二；(1)研究对完全COC内卵母细胞所分泌GDF9或BMP 15影响随后发育的抑制，和(2)特异性中和各种重组OSF对COC的影响，引物这些制剂并非纯物质。COC单独培养或与175ng/ml GDF9或10％v/v 293H一起培养，期间在存在或不存在4μM SB-431542(GDF9拮抗剂)。在另一个实验中，将COC单独培养或与10％v/v BMP15或10％v/v 293H一起培养，IVM期间在存在或不存在10μg/ml促滤泡素抑制素-288。IVM之后，对所有复合体授精并在第8天评价胚泡形成。对这些实验进行3份复制实验，每份复制实验每个处理组使用60个COC。
统计分析 对所复制实验所得成比例发育数据进行反正弦转换之后再分析。采用SigmaStat软件(伊利诺斯州芝加哥SPSS公司)通过ANOVA进行统计分析，并采用Tukey-Kramer事后分析法检测平均值之间的显著差异以便进行多个平均值的比较。当p＜0.05时认为差异是统计学上显著的。结论 实验1IVM期间完全COC与DO共培养对随后发育能力的影响 与单独培养的COC相比(39％)，完全COC接触来自DO的原生OSF能显著提高(P＜0.001)受精后到达卵泡期的卵母细胞的比例(51％)。此外，与对照COC相比，此后生成的胚泡细胞数显著(P＜0.05)增加，总细胞数和滋养外胚层细胞数增加。然而，在IVM期间接触OSF不会显著影响卵母细胞的卵裂(P＞0.05)。
实验2IVM期间BMP 15和/或GDF9对卵母细胞发育能力的影响 加入BMP 15以使COC成熟显著提高了(P＜0.05)它们发育到胚泡期的比例，相比对照COC提高了16％，而相比293H-处理的COC提高了30％。来自亲本293H细胞系的条件培养基对卵母细胞的发育潜能有不利影响，使胚泡率相比对照COC降低了14％(P＜0.001)。与293H-处理的COC相比，GDF9还提高了(P＜0.05)胚泡产量，但与单独培养的COC相比则没有提高。加用GDF9未对胚泡产量产生超过单用BMP 15的累加效应。各种处理对卵母细胞卵裂没有显著影响，尽管接触293H对照条件培养基的处理组的卵裂率明显较低。
实验3和4GDF9或BMP 15拮抗剂对卵母细胞发育能力的影响 之前在实验2中观察到的IVM期间加入293H对卵裂率的不利影响在这两个实验中也观察到了；但与对照组的差异变得显著(双向ANOVA，p＜0.05；图25A和26A)。GDF9拮抗剂SB-431542(一种ALK 4/5/7抑制剂)对卵母细胞的卵裂率没有影响(p＞0.05；图25A)。相反，无论是否用BMP 15处理，用促滤泡素抑制素处理COC显著降低了卵母细胞的卵裂率(促滤泡素抑制素，71.8±1.3；对照，76.2±1.3；p＝0.007；图26A)。与实验2一致，与对照相比，用GDF9处理COC不会显著改变卵裂率，用BMP 15处理亦是如此，这种影响与促滤泡素抑制素所有影响都无关(图25A和26A)。
与未处理的COC相比，用SB-431542或促滤泡素抑制素处理对照COC能显著(P＜0.05)降低胚泡发育，提示这些拮抗剂至少能够部分中和分别由卵母细胞分泌的内源GDF9或内源BMP 15的影响(图2B和3B)。与实验2一致，在这些实验中外源GDF9和BMP 15都增加了胚泡产量(P＜0.05)(图25A和26A)，而加入它们各自的拮抗剂能抵消这些增长。加入SB-431542或促滤泡素抑制素不仅将胚泡发育降至与未处理的对照COC类似的水平，而且还使卵泡率降至用拮抗剂处理的对照COC的水平(图25B和26B)。这说明SB-431542和促滤泡素抑制素中和了外源和内源GDF9或BMP 15对卵母细胞发育能力的影响。无论加入SB-431542还是加入促滤泡素抑制素，用293H熟化的COC的胚泡发育率被显著降低(P＜0.05)(图25B和26B)。
实施例24 研究V-卵母细胞体外成熟期间内源GDF9改善了随后的胚胎发育和胎儿形成 卵母细胞的发育能力决定了由其生成的胚胎的生命力。最近，越来越多证据表明在卵母细胞和它们的体细胞之间的存在且有必要存在一种双向调节回路(bi-directional regulatory loop)。本项研究的目的是评价在小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)期间加入卵母细胞旁泌因子-生长分化因子9(GDF9)对随后胚胎和胎儿发育的影响。
eCG后46小时，从青春期前(CBAxC57BL\6杂种)小鼠的窦状卵泡中抽取COC，将其在含或不含50m IU/ml FSH/10ng/ml EGF、重组小鼠GDF9(200ng/ml)的Waymouth培养基+5％FCS中，或在等v/v对照亲本细胞系293H条件培养基中，于37℃、6％CO2、5％O2下熟化17小时。然后对卵母细胞(n＝1106)授精，并在G1.2/G2.2培养基中于37℃、6％CO2、5％O2下培养至胚泡期。汇集胚泡，将其转移至假孕Swiss雌性小鼠中，或进行区别染色。在孕期第15天时评价受孕结果。
GDF9的影响取决于是否存在FSH/EGF。存在FSH/EGF时，GDF9能增强卵丘扩展(卵丘扩展指数分别为3.1±0.1和2.4±0.1；P＜0.05)。尽管GDF9对受精、发育率或胚泡百分比没有显著影响(83％相比75％)，但GDF9能显著增加胚泡总细胞数(P＝0.05)，引起的胚泡内细胞团细胞数差异(P＝0.003)大于滋养外胚层细胞数差异(P＝0.07)。因此，着床率不受影响(83％和77％)，但加入GDF9能使胎儿发育几乎翻倍(39％和21％；P＝0.04)。
该研究证明，FSH/EGF存在下，在IVM期间加入外源GDF9能提高胚泡质量和此后所得胎儿的生命力。这些发现突现了适当的卵母细胞-体细胞相互作用的重要性，并且对开发IVM培养基具有重要意义，因为GDF9缺乏可能是IVM卵母细胞发育能力低下的原因之一。
最后，应理解，本发明所述方法和组合物的各种修饰和变化对于精通本领域的技术人员而言将是显而易见的且不背离本发明的范围和精神。尽管已经联系具体的优选实施方式描述了本发明，但应理解如权利要求所要求的本发明不应过分局限于这些具体的实施方式。实际上，对所述执行本发明的模式的各种修饰对于精通本领域的技术人员是显而易见的且包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种调节颗粒细胞的凋亡的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过使颗粒细胞接触浓度和/或活性提高的BMP-15和/或BMP-6来抑制所述颗粒细胞的凋亡。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过使颗粒细胞接触提高依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径活性的试剂来抑制所述颗粒细胞的凋亡。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述试剂提高ALK6和/或BMPRII受体信号传导途径的活性。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述对凋亡的抑制促进了卵母细胞的成熟和/或发育能力。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述颗粒细胞是体外卵丘卵母细胞复合体内的颗粒细胞。
7.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述颗粒细胞是体内的颗粒细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对凋亡的抑制提高了雌性对象的生育力。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过使颗粒细胞接触降低颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性的试剂来促进所述颗粒细胞的凋亡。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，通过使颗粒细胞接触降低依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性的试剂来促进所述颗粒细胞的凋亡。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述试剂降低ALK6和/或BMPRII受体信号传导途径的活性。
12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述颗粒细胞是体内的颗粒细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述对凋亡的抑制降低了雌性对象的生育力。
14.一种预防和/或治疗雌性对象的与卵母细胞成熟和/或卵泡成熟相关的疾病或状况的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
15.一种调节卵母细胞成熟的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
16.一种调节卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
17.一种调节卵母细胞所生成胚胎的发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡。
18.一种调节卵泡成熟的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
19.一种调节卵泡闭锁的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
20.一种调节卵泡发育的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节卵泡颗粒细胞的凋亡。
21.一种调节雌性对象排卵率的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
22.一种调节雌性对象生育力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)通过调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞的凋亡。
23.一种减轻冻融造成的颗粒细胞凋亡的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
24.一种减轻冻融对卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢的损伤的方法，该方法包括使卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢接触以下物质中的一种或多种
(i)有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的调节卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(iii)有效量的调节卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
25.一种用于抑制颗粒细胞凋亡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(iii)有效量的调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
26.一种卵丘卵母细胞复合体培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体中或卵泡中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
27.一种卵母细胞体外成熟培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(iii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
28.一种卵母细胞和/或卵泡培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(iii)有效量的提高与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
29.如权利要求28所述的培养基，其特征在于，所述培养基是用于提高卵母细胞的发育能力的培养基。
30.如权利要求26-29中任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基基本不含血清、白蛋白、卵泡液、肽球蛋白、促卵泡激素(FSH)和抗凋亡生长因子。
31.如权利要求26-30中任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包含下述物质中的一种或多种40-400mM NaCl、0.1-20mM KCl和0.1-40mM葡萄糖。
32.一种用于调节雌性对象排卵率的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和
(iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
33.一种用来调节雌性对象每次卵巢或月经周期中成熟的卵泡数目的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和
(iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
34.一种用来调节雌性对象生育力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)调节对象颗粒细胞凋亡有效量的BMP-15和/或BMP-6；
(ii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂；和
(iii)有效量的通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来调节对象颗粒细胞凋亡的试剂。
35.一种组合物或培养基，其包含以下物质中的一种或多种
(i)BMP-15和/或BMP-6；
(ii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂；和
(iii)通过调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制颗粒细胞凋亡的试剂；
其中，所述组合物还包含40-400mM NaCl、0.1-20mM KCl和0.1-40mM葡萄糖。
36.一种用来减轻冻融造成的颗粒细胞凋亡的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)活性BMP-15和/或活性BMP-6；
(ii)提高颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(iii)提高颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
37.一种用来减轻冻融对卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢的损伤的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)有效量的活性BMP-15和/或活性BMP-6；
(ii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(iii)有效量的提高卵丘卵母细胞复合体、卵泡、卵巢组织或卵巢中颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
38.一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)BMP-15和/或BMP-6；
(ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和
(iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
39.一种对卵母细胞体外授精的方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)BMP-15和/或BMP-6；
(ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和
(iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
40.一种涉及卵母细胞所生成的胚胎的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞和/或胚胎的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)BMP-15和/或BMP-6；
(ii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂；和
(iii)通过调节一种或多种颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性来抑制一种或多种与卵母细胞相关联的颗粒细胞凋亡的试剂。
41.一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤
(i)测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度；和
(ii)由与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度来评价卵母细胞的发育能力。
42.一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤
(i)测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度；和
(ii)由与卵母细胞相关联的颗粒细胞的凋亡程度来评价卵母细胞的发育能力；
其中，凋亡水平降低表明卵母细胞的发育能力增强，而凋亡水平升高表明卵母细胞的发育能力减弱。
43.一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤
(i)测定下述一项或多项与卵母细胞相关联的颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性水平；以及测定与卵母细胞相关联的颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性水平；和
(ii)由上述测定评价卵母细胞的发育能力；
其中，BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性升高和/或依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性升高表明卵母细胞的发育能力增强，而BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性降低和/或依赖于BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
44.一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤
(i)测定卵母细胞的BMP-15和/或BMP-6表达水平和/或测定卵母细胞分泌的BMP-15和/或BMP-6的浓度；和
(ii)评价卵母细胞的发育能力；
其中，BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度升高表明卵母细胞的发育能力增强，而BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
45.一种调节卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；
(ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
46.一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；
(ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
47.一种对卵母细胞的体外授精方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；
(ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
48.一种涉及卵母细胞所生成胚胎的辅助生殖方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节卵母细胞或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；
(ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
49.一种调节卵母细胞成熟和/或调节卵母细胞质量的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性
(ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(v)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
50.一种用来改善卵母细胞发育能力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)一种或多种另外的裸卵母细胞；
(ii)一种或多种卵母细胞分泌因子；
(iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；
(iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；
(v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
51.卵母细胞培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)一种或多种另外的裸卵母细胞；
(ii)一种或多种卵母细胞分泌因子；
(iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；
(iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；
(v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
52.如权利要求51所述的培养基，其特征在于，所述培养基是用来改善卵母细胞的发育能力的培养基、是卵母细胞体外成熟培养基并且/或者是提高卵母细胞质量的培养基。
53.一种涉及卵母细胞的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)一种或多种裸卵母细胞；
(ii)一种或多种卵母细胞分泌因子；
(iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；
(iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；
(v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
54.一种对卵母细胞体外授精的方法，该方法包括在培养基内培养卵母细胞的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)一种或多种裸卵母细胞；
(ii)一种或多种卵母细胞分泌因子；
(iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；
(iv)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；
(v)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(vi)提高卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
55.一种改善卵母细胞所生成胚胎的发育或发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；
(ii)调节卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(vi)调节卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
56.一种改善胚胎的发育或发育能力的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节胚胎所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；
(ii)调节胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(v)调节胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
57.一种涉及胚胎的辅助生殖方法，该方法包括在培养基内培养胚胎的步骤，所述培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)一种或多种裸卵母细胞；
(ii)一种或多种卵母细胞分泌因子；
(iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；
(iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；
(v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
58.一种提高胚胎发育到胚泡期的可能性的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节胚胎所接触的卵母细胞分泌因子的浓度和/或活性；
(ii)调节胚胎所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；
(iii)调节胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；
(iv)调节胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和
(v)调节胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
59.一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤
(i)测定卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；和/或
(ii)测定卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于GDF-9的信号传导途径的活性；和/或
(iii)测定卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和/或
(iv)测定卵母细胞内和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性；和
(v)由卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性，和/或卵母细胞或卵丘细胞内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性来评价卵母细胞的发育能力；
其中，卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性提高，和/或卵母细胞或卵丘细胞内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性提高表明卵母细胞的发育能力增强，而卵母细胞和/或与卵母细胞相关联的卵丘细胞所接触的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性降低，和/或卵母细胞或卵丘细胞内依赖于GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的信号传导途径的活性降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
60.一种评价卵母细胞发育能力的方法，该方法包括以下步骤
(i)测定卵母细胞中GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的表达水平和/或测定卵母细胞分泌的GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的浓度；和
(ii)评价卵母细胞的发育能力；
其中，GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度提高表明卵母细胞的发育能力增强，而GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6的表达和/或浓度降低表明卵母细胞的发育能力减弱。
61.一种用来改善胚胎发育和/或发育能力的组合物，该组合物包含以下物质中的一种或多种
(i)一种或多种另外的裸卵母细胞；
(ii)一种或多种卵母细胞分泌因子；
(iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；
(iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；
(v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
62.一种胚胎培养基，该培养基包含以下组分中的一种或多种
(i)一种或多种另外的裸卵母细胞；
(ii)一种或多种卵母细胞分泌因子；
(iii)GDF-9和/或BMP-15和/或BMP-6，或其变体或类似物；
(iv)提高胚胎内依赖于GDF-9的信号传导途径活性的试剂；
(v)提高胚胎内依赖于BMP-15的信号传导途径活性的试剂；和
(vi)提高胚胎内依赖于BMP-6的信号传导途径活性的试剂。
63.如权利要求62所述的培养基，其特征在于，所述培养基是用来改善胚胎发育能力或用来提高胚胎发育到胚泡期的可能性的培养基。
64.一种调节卵丘卵母细胞复合体扩展的表达的方法，该方法包括以下步骤中的一步或多步
(i)调节卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性；和
(ii)调节卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径的活性。
65.一种调节雌性对象排卵的方法，该方法包括给予所述雌性对象以下试剂中的一种或多种的步骤
(i)调节该雌性对象的卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性的试剂；和
(ii)调节该雌性对象卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径活性的试剂。
66.一种调节雌性对象生育力的方法，该方法包括给予所述雌性对象以下试剂中的一种或多种的步骤
(i)调节该雌性对象的卵丘卵母细胞复合体所接触的TGF-β1、GDF-9、BMP-15和活化素中一种或多种的浓度和/或活性的试剂；和
(ii)调节该雌性对象卵丘卵母细胞复合体内由ALK4、ALK5和ALK7受体中的一种或多种介导的信号传导途径活性的试剂。
全文摘要
本发明涉及一种调节颗粒细胞的凋亡的方法。该方法包括以下步骤中的一步或多步(i)调节颗粒细胞所接触的BMP-15和/或BMP-6的浓度和/或活性；(ii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-15的信号传导途径的活性；和(iii)调节颗粒细胞内依赖于BMP-6的信号传导途径的活性。
文档编号A61K38/18GK101272804SQ200680034327
公开日2008年9月24日 申请日期2006年7月18日 优先权日2005年7月18日
发明者R·B·基尔克里斯蒂, J·汤普森, T·赫森 申请人:阿德莱德研究及创新控股有限公司