专利名称：Opg-hsp70融合蛋白的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用大肠杆菌表达制备重组骨保护素-热休克蛋白70 (OPG-HSP70)融合蛋 白的方法，含有由该方法制备的重组骨保护素-热休克蛋白70 (OPG-HSP70)的药物制剂以 及该药物制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎中的药物中的用途。
背景技术：
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种T细胞介导的，以滑膜炎症为主要 特征，同时伴有关节软骨及骨损伤的自身免疫性疾病。RA在中国的患病率为0.32%~0.38 %，且致残率高，RA给劳动力、社会经济造成的损失是巨大的。而RA又是一种难治性疾 病，虽然现有治疗手段多种多样，但都不甚理想。本发明针对RA发病中骨损伤及慢性炎 症反应这两个相关联的RA的关键性病理学问题，研制OPG-HSP70融合蛋白，为RA的治 疗开辟了一种新的思路。
近几年，对于破骨细胞(osteoclast, OC)的研究不仅引发了免疫调节、骨代谢疾病中的 理论研究，也为临床诊断和治疗骨代谢性疾病提供了新的依据。对OC从细胞生物学和分 子生物学方面等进行的研究，开辟了各种骨相关疾病的药物研发的新领域(N Engl J Med. 2005，353(9):872-75)。由于OC是形成侵蚀性关节炎的必要成分，因此其可以作为RA治疗 的一个靶点。
OC的分化和/或功能变化所导致的骨再建失衡是多种代谢性骨病，如骨质疏松症、骨 质硬化症和畸形性骨炎(Paget骨病)等形成的病理基础。目前己经证明多种激素和局部细 胞因子如活性维生素D3、糖皮质激素、甲状旁腺素(PTH)、前列腺素(PGE2)、 IL-6、 IL-ll 、 IL-12等不仅能调节OC生成，还能调节OC的功能。这些因子主要作用于成骨/基质细胞， 通过调节骨保护素(osteoprotegerin， OPG)和NF-kB受体活化因子配体(receptor activator of NF-kB ligand， RANKL)的表达，调控OPG、 RANKL和NF-kB受体活化因子(receptor activator of NF-kB, RANK)之间的比例，介导OC生成并维持其功能。因此OPG、 RANKL 及RANK是OC的最终调节因子。3种分子在OC分化成熟过程中的相互关系及作用机理的 阐明，为多种代谢性骨病的防治提供了理论依据(CurrOpinRheumatol. 2003, 15(3):280-7)。
1997年OPG被发现，它属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，有单体和由二 硫键连接的同源二聚体两种形式，分子量分别为60kD和120kD。单体存在于成骨细胞内， 而二聚体可分泌入基质中，是一种分泌型糖蛋白。OPG在进化中高度保守，大鼠和小鼠OPG的同源性为94%，小鼠和人OPG的同源性为89%。 OPG最初含401个氨基酸残基，在合 成过程中因去除21个氨基酸残基组成的信号肽，最终成为含380个氨基酸的成熟蛋白质。 其N端有4个富含半胱氨酸的功能域(D1 D4)与其配体结合，C端与已知的蛋白没有同 源性。许多组织器官可以表达OPGmRNA，如肺、心脏、肾脏、肝、胃肠、脑、脊柱、甲 状腺等，其主要作用是抑制骨吸收(Cell. 1997， 89(2):309-19)。实验表明，去除OPG的C端 部分(至194aa)并不影响OPG活性，因此包括TNFR样功能区的OPGN端序列对于抑制 OC分化成熟是必需的也是足够的。
在发现OPG的一年后，美国的同一个研究小组又发现了 OPG的配体OPGL(Cell. 1998, 93(2):165-76)，即RANKL，属TNF超家族成员，存在膜结合型和可溶性两种形式，主要由 成骨细胞和骨髓基质细胞表达，可以促进OC分化、刺激其活化并提高OC存活率。这些作 用出现于RANKL与其受体RANK结合时，并最后表现为对骨的吸收。RANK表达于破骨 细胞的前体细胞表面，与成骨/基质细胞表面的RANKL结合，可启动OC的分化和成熟。 OPG作为RANK的诱饵受体(decoy receptor),以竞争的方式，高亲和性地与RANKL特 异性结合，阻止RANKL与OC上的RANK结合，负向调节OC的分化和活化并促进破骨 细胞凋亡，从而抑制骨吸收，在骨代谢调节中起着关键性作用。实验研究表明，OPG缺陷 型小鼠出现严重的骨质疏松，并伴有低骨矿物密度和多发性骨折以及严重的动脉硬化，这 是由于RANKL和RANK的结合增加，从而导致OC的形成所致。给正常小鼠重组OPG可 以提高其胫骨和股骨的骨量，并可以补偿卵巢切除后由于雌激素丧失而引起的骨丢失。用 PG治疗青少年Pegat骨病取得了良好的效果，且没有明显的副反应发生(N Engl J Med. 2005, 353(9):918-23)。 2005年举行的美国内分泌学会(ENDO)年会上，报告了将重组的 OPG应用于40 70岁妇女，可以降低人体对骨的再吸收。这些临床研究进一步说明了 OPG 在防止骨破坏方面具有良好的应用前景。
RA的关节破坏包括滑膜表面、关节软骨和软骨下骨的侵蚀。近期研究发现OC是RA 关节破坏的关键成份，在病灶部位有大量的成熟OC及OC前体，另外活性淋巴细胞、巨噬 细胞、成骨细胞和其他细胞表达多种细胞因子，作用于OC生成、分化、活化等各个环节， 使OC过度增殖或异常活跃，打破了骨代谢的平衡，骨的破坏占据优势。目前认为活化的T 淋巴细胞表达的RANKL是RA中的关键调节因子，可为RA中免疫系统与骨代谢提供联系 (Arthritis Rheum. 2006， 54(6): 1772-7)。 RA关节病变部位出现的大量活化的T淋巴细胞能够 直接通过膜结合型的RANKL和可溶性RANKL启动破骨细胞的生成，使关节部位形成更 多的OC前体和成熟OC，并引起骨丢失。多种T细胞来源的细胞因子可能干扰RANK信 号通路，从而影响OC的生成，如IL-12、 IL-18、 IL-4等。其中IL-4作为抗炎性细胞因子通过STAT-6依赖机制抑制OC的分化，最新研究表明IL-4通过抑制NF-kB和(^2+信号通 路直接作用于OC而抑制骨的再吸收(J Immunol. 2005, 175(2):917-25)。在佐剂型关节炎动物 模型中，炎症活动部位可检测到RANKL的表达，且与OC的增加、活化相一致，从而导致 严重骨与关节破坏。给予OPG可阻抑骨关节的破坏，但对免疫炎症反应无改善作用(Nature. 1999,402(6759):304-9)。在胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis , CIA)模型中OPG 亦能减少或阻止骨破坏，但对滑膜炎症没有作用(Am J Pathol. 2002， 161(4):1419-27)。由此 表明，OPG并不能解决RA的慢性炎症问题，炎症仍是相当棘手的问题。动物试验发现，T 细胞在RA炎症的发生发展中起着重要作用，近年来的研究提示，热休克蛋白(heat shock protein, HSP)可通过调节T细胞功能抑制RA的炎性反应。
热休克蛋白属于分子伴侣蛋白，不仅仅对细胞内一些蛋白质分子构象和稳定性起调节 性作用，还对细胞应激、代谢、增殖以及凋亡等生理过程具有重要的调控作用。根据单体 分子量的大小，热休克蛋白可分有6个家族HSPIO、 HSP40、 HSP60、 HSP70、 HSP90和 HSPIOO。其中HSP70作为免疫显性抗原，在进化中高度保守，哺乳动物的HSP与微生物 的HSP有很高的同源性，所以也很容易引起免疫交叉反应。随着对免疫调节机制特别是调 节性T细胞的深入研究，HSP的免疫调节作用也逐渐被人们所认识。HSP诱导调节性T细 胞的能力是其他细菌保守抗原所不具备的，它可能与参与固有免疫应答细胞的某些HSP受 体有关，而这些受体又是连接固有免疫应答和适应性免疫应答的桥梁。哺乳动物和细菌的 HSP都可以直接活化APC (巨噬细胞和树突状细胞)，这种作用可能是通过结合到细胞表面 受体如CD14、 CD40、 TLRs、 CD36、 CD91和LOX1等实现的(Tissue Antigens. 2004, 64(4):442-51)。
HSP70作为免疫显性抗原，可以被机体识别并产生相应的免疫反应。分析HSP70的表 位发现，只有那些能够诱导自身HSP交叉反应性T细胞的表位才有保护作用。由于HSP70 进化保守区段在微生物与哺乳动物之间产生交叉反应，这些保守肽段产生的自身抗原交叉 反应性T淋巴细胞又可分泌抑制炎症的细胞因子，如IL-4、 IL-10和TGF-p，从而激活了免 疫调节机制，直接抑制前炎症性效应T淋巴细胞，或者调节APC，阻止炎性疾病的进程。 而且，HSP肽段的保护性作用与致病性作用无关。
研究表明用结核杆菌HSP70肽段免疫动物有较好的防治CIA的效果，关节炎指数明显 下降、病理变化较轻、抑制性细胞因子IL-4水平升高，而炎性细胞因子IFN-"/水平和抗CII 抗体水平降低，与阳性对照组相比有显著性差异(中国免疫学杂志.2006, 22(12):1092-5)。
鉴于滑膜炎和骨损伤是RA的两个最显著的病理学特征，我们将编码OPG及HSP70功
能性片段的DNA片段连接(去除两者的与治疗RA无关的或对机体有害的肽段，并有利于制剂的制备)，插入原核表达载体pET28a。在此基础上，对重组蛋白进行原核表达，并通 过分子筛或离子交换层析等方法对重组蛋白进行纯化，采用SDS-PAGE、 Western-blot法等 对融合蛋白进行理化鉴定。其次，通过体内外生物活性实验对融合蛋白做进一步分析。该 体系蛋白表达量高，可控性强，生产成本相对较低，且具有良好的生物学活性，容易实现 大规模生产。
发明内容
本发明的一个目的在于提供用大肠杆菌表达OPG-HSP70融合蛋白并分离纯化制备 OPG融合蛋白的生产方法。
本发明还提供一种OPG-HSP70融合蛋白，及其在制备用于预防和治疗类风湿关节炎的 药物中的用途。
本发明的另一个目的是提供含有本发明的OPG-HSP70融合蛋白和药学上可接受的载 体的药物制剂。
本发明所述的OPG融合蛋白指OPG或其活性变体、片段与HSP或其变体、片段融合 而成的蛋白。
本发明提供一种编码OPG与HSP70融合蛋白的核酸序列。但在某些实施方案中，可以 根据实际需要对核酸密码子进行突变，选用大肠杆菌偏好密码子，但编码OPG-HSP70融合 蛋白的氨基酸序列不变。
本发明所述的OPG-HSP70融合蛋白，其为Rl-L-R2形式，其中Rl为OPG蛋白、或 其变体或片段，R2为HSP蛋白、或其变体或片段，L为接头蛋白。
所述OPG蛋白，或其变体、片段选自
(a) SEQIDNo.l所示的蛋白序列；
(b) 氨基酸序列22-X，其中X为SEQIDNo.l所示的包括位置185—401的任意氨基酸 残基。
所述的HSP70蛋白、或其变体或片段选自
(a) SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；
(b) 氨基酸序列ITDAVITTPAYFNDA。 所述接头选自
(a) ala-(ala)n-ala， n可以是1 4间的整数；
(b) gly-(gly)n-gly, n可以是1 4间的整数；
(c) gly-pro-gly;
7(d) gly-gly-pro-gly-gly;
(e) ser- gly-(gly)n-gly， n可以是1 4间的整数；
(f) val;
(g) tyr-val;
(h) 亚部分(a)-(g)的任何组合。
本发明中所指的大肠杆菌包括大肠杆菌BL21 (DE3)等宿主细胞。本发明所使用的表 达载体可以选用各种已知的原核表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，利用合适的 条件筛选重组子，诱导表达OPG-HSP70融合蛋白。
在本发明的一个优选的实施例中，在合适的条件下发酵培养工程菌的步骤包括
将酶切鉴定正确的重组克隆质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑选单菌落 接种于5mL2xYT培养基(含25mg/L卡那霉素)，37'C振荡过夜。次日1: 50转接后，37°C 培养2h,加入IPTG使之终浓度为0.1mmol/L， 30'C继续振荡培养5h后离心收集菌体。
在本发明的一个优选的实施例中，从发酵产物中纯化分离并复性出OPG-HSP70融合蛋 白包括以下要点
阳性克隆菌株于0.1mmol/LIPTG， 30。C诱导培养5h后，4°C， 6000r/min离心15min， 收集菌体，用预冷的20mM Tris-HCL(pI^7.9)缓冲液洗涤菌体，按每克湿菌体加10倍体积 的Buffer A[lMTris-HCl(pH8.0)， 5MNaCl， 0.5M EDTA(pH8.0)， 0.5%Tritonl00， 1MDTT] 重悬，加入溶菌酶至lmg/ml，同时加入PMSF至lmM，冰上放置30min后，间歇超声破碎 菌体10min，离心收集包涵体沉淀，再分别用2M尿素包涵体洗涤液和Buffer A各洗两次， 然后用8M尿素变性液溶解包涵体，4°C， 12000r/min离心45min，取上清。上清再经0.22um 的微孔滤膜过滤，即为含有目的重组蛋白的变性液。将大量表达的重组蛋白变性液通过超 滤浓縮的方法浓縮为6mg/mL。按尿素浓度逐步递减(4M-3M-2M-1M-0.5M-0M)的方法配 好复性液(4M尿素，lmM还原型谷胱甘肽，O.lmM氧化型谷胱甘肽，20%甘油，5%葡萄 糖，PBS，pH7.2)，将浓縮的蛋白变性液5mL置于透析袋内，透析袋置于大体积的复性液中 4'C缓慢搅拌透析。根据透析过程中蛋白是否析出以及析出量的多少确定最佳透析条件，约 四个小时更换一次尿素浓度逐渐降低的透析液，对蛋白变性液进行稀释复性。复性后的蛋 白最后溶解于pH7.2的PBS溶液中。
已确证，OPG-Fc融合蛋白在临床应用上是安全有效的，因此，OPG-HSP70融合蛋白 可用于药物使用。
OPG-HSP70融合蛋白可以用于预防和治疗类风湿关节炎等疾病，抑制骨破坏作用并发 挥抑制炎症作用。
图1显示本发明重组质粒的构建示意图
图2显示本发明表达载体的示意图
图3 OPG/OPG-HSP70 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱
图4 OPG-HSP70融合蛋白SDS-PAGE电泳图谱
图5 OPG-HSP70包涵体洗涤过程的SDS-PAGE电泳图谱
图6 Western-blotting分析OPG-HSP70融合蛋白
图7复性后OPG-HSP70融合蛋白的SDS-PAGE电泳图谱
图8 OPG-HSP70融合蛋白对破骨细胞的分化抑制
图9 OPG-HSP70融合蛋白对炎性细胞因子产生的抑制作用
图10OPG-HSP70融合蛋白对炎症模型小鼠的抑炎作用
具体实施例方式
实施例l OPG全长基因的克隆
根据文献报道的人OPG编码区cDNA的序列(GenBank号NMJ)02546),设计2条针对 OPG编码区cDNA的寡核苷酸引物，人骨肉瘤细胞系MG63培养至对数生长早期，加入 rhBMP-2 (在培养基中终浓度达100ug/L)，继续培养至对数生长期后，细胞计数，离心收 集细胞。按照Trizol Reagent总RNA提取试剂说明书提取细胞总RNA。根据MMLV第一 链cDNA合成试剂盒说明书操作步骤，以寡聚(dT)为引物合成cDNA第一链。取8uL逆转 录产物为模板，在TaqDNA聚合酶作用下，分别用P1， P2引物进行PCR，反应条件为 95t:变性5min后，按下述参数循环35次94。C变性45s， 52。C退火30s， 68'C延伸lmin。 纯化后的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy在T4DNA连接酶的作用下，4t连接过夜，连接 产物转化￡.co// DH5a感受态细胞，挑选单菌落接种于5ml LB培养基(含100mg/L氨苄青霉 素)的试管中，37"C振荡过夜，收集菌体，碱裂解法小量提取质粒，经EcoRI酶切鉴定，构 建重组质粒pGEM-T-Easy-OPG。取酶切鉴定正确的重组克隆进行序列测定。
实施例2 OPG-HSP70融合蛋白原核表达载体的构建
以测序正确的重组质粒pGEMT-Easy-OPG为模板，P3和P4为引物进行第一次PCR扩
增，然后以此次的PCR产物为模板，P3和P5为引物进行第二次PCR扩增，得到OPG-HSP70
融合基因。PCR产物经纯化后与原核表达载体pET-28a同时利用Nco I和Xho I限制性内
切酶进行双酶切反应。酶切后的载体和目的DNA经纯化、连接后，转化￡.(:0//0}15&感受
态细胞中，挑选单菌落接种于5mLLB培养基(含25mg/L卡那霉素)的锥形瓶中，37。C振荡过夜。收集菌体，小量提取质粒，再经Ncol和Xhol双酶切鉴定。取酶切鉴定正确的
重组克隆进行序列测定。
实施例3 OPG-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
将酶切鉴定正确的重组克隆质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑选 单菌落接种于5mL 2xYT培养基(含25mg/L卡那霉素)，37'C振荡过夜。次日1: 50转接 后，37'C培养2h，加入IPTG使之终浓度为0.1mmol/L， 3(TC继续振荡培养5h后离心收集 菌体。
实施例4 OPG-HSP70融合蛋白在大肠杆菌中的纯化与复性
阳性克隆菌株于0.1mmol/LIPTG， 30。C诱导培养5h后，4°C， 6000r/min离心15min， 收集菌体，用预冷的20mMTris-HCL(pH-7.9)缓冲液洗涤菌体，按每克湿菌体加IO倍体积 的Buffer A[lMTris-HCl(pH8.0)， 5MNaCl， 0.5M EDTA (pH8.0)， 0.5。/。Tritonl00， 1MDTT] 重悬，加入溶菌酶至lmg/ml，同时加入PMSF至lmM，冰上放置30min后，间歇超声破碎 菌体10min，离心收集包涵体沉淀，再分别用2M尿素包涵体洗涤液和Buffer A各洗两次， 然后用8M尿素变性液溶解包涵体，4°C， 12000r/min离心45min，取上清。上清再经0.22um 的微孔滤膜过滤，即为含有目的重组蛋白的变性液。将大量表达的重组蛋白变性液通过超 滤浓縮的方法浓縮为6mg/mL。按尿素浓度逐步递减(4M-3M-2M-1M-0.5M-0M)的方法配 好复性液(4M尿素，lmM还原型谷胱甘肽，O.lmM氧化型谷胱甘肽，20%甘油，5%葡萄 糖，PBS,pH7.2)，将浓縮的蛋白变性液5mL置于透析袋内，透析袋置于大体积的复性液中 4'C缓慢搅拌透析。根据透析过程中蛋白是否析出以及析出量的多少确定最佳透析条件，约 四个小时更换一次尿素浓度逐渐降低的透析液，对蛋白变性液进行稀释复性。复性后的蛋 白最后溶解于pH7.2的PBS溶液中。
实施例5活性实验OPG-HSP70融合蛋白对破骨细胞的分化抑制
将冻存的原代小鼠骨髓细胞复苏后，37°C、 5%C02饱和湿度条件下培养。然后加入巨
噬细胞集落刺激因子M-CSF至终浓度为25ng/mL，于37匸、5%C02饱和湿度条件下培养
24h。次日收集细胞悬液，即为M-CSF依赖性非附着性骨髓单核细胞。1000r/min，常温离
心5min，弃上清，PBS洗两遍。用1640培养基(含25 ng/mL的M-CSF和40 ng/mL的
RANKL)重悬细胞，计数，并调整细胞浓度为lxl06/mL。 24孔板中每个孔分别放置一张
玻片，各孔分别加入培养液1640 200pL， 37'C温育2h后吸出培养液。按照加入OPG-HSP70
融合蛋白或PBS的不同分为实验组和对照组，每组10个复孔。实验组加入OPG-HSP70融
合蛋白至终浓度为10ng/mL，对照组加入同样的PBS液。然后每个孔中分别各加入M-CSF和RANKL重悬的骨髓细胞悬液lmL， 37°C、 5%C02饱和湿度条件下培养。三天后第一 次换液，此后每两天换液一次，每次换液50%，培养至第七天时，弃去培养基，PBS洗细 胞两次，4% (体积分数)甲醛溶液固定15min，然后再用PBS洗细胞两次，空气中自然干 燥。按照Sigma说明书行TRAP染色，于光学显微镜下计数多个核TRAP阳性破骨细胞。2 个以上细胞核、染为红色的为破骨细胞。
实施例6活性实验OPG-HSP70融合蛋白对炎症模型小鼠的抑炎作用
小鼠腹部皮肤脱毛，范围约3cmx3cm，用ly。二硝基氟苯(DNFB)溶液40pL均匀涂抹 致敏。固定小鼠5sec，使皮肤表面溶剂挥发。同时给予实验组小鼠腹腔注射OPG-HSP70融 合蛋白，0.2mg/只/次；对照组同时腹腔注射生理盐水。隔日注射，共注射三次。次日再涂 抹DNFB致敏强化一次。致敏后第5天，用1%DNFB溶液10pL均匀涂抹于小鼠右耳(两面) 进行攻击。24h后，断颈处死小鼠，用游标卡尺测量左右耳厚度之差为肿胀度。采用单因 素方差分析比较各实验组与对照组的差异。左右耳厚度之差表示DTH的程度。
于小鼠发病高峰，即攻击后24h，断颈处死小鼠，在装满酒精的大烧杯里浸泡2min左 右，然后将小鼠转移到超净工作台内。取一无菌培养皿，在其内加入8mL的1640细胞培 养液，将200目细胞筛浸入其中，将分离的脾脏放于细胞筛上，用注射器芯均匀研磨脾脏 到没有肉眼可见的组织碎块。用尖吸管吸取细胞筛下的8mL脾细胞悬液到无菌15mL离心 管内，轻轻吹打混匀。用尖吸管吸取脾细胞悬液滴加到己盛有4mL淋巴细胞分离液的15mL 离心管内，使脾细胞悬液重叠于分离液面。水平离心机2000rpm离心20min。离心后绝大 多数单个核细胞悬浮于血浆与分离液界面，呈白膜状。将尖吸管轻插至白膜层，沿试管壁
边缘吸出单个核细胞，移入另一无菌15mL离心管中。加入5mL 1640细胞培养液，充分 混匀，1500rpm离心15min后弃上清，将沉淀细胞再次重悬于5mL 1640细胞培养液中， 1500rpm离心15min后弃上清，吸净残液，然后于管中加入不含细胞刺激剂的完全培养基 50tiL，吹打混匀后将其转移到1.5mL离心管中。取出上述原液4pL到已盛有400pL生理盐 水的离心管中(即将细胞原液稀释100倍)，充分混匀后取10pL，从侧面加入已盖好盖玻 片的计数板上，取四个角4个大格进行计数。计数完毕后，计算细胞原液的浓度，公式为 细胞原液浓度=4个大格的细胞总数/4><10、稀释倍数(100)，用含有细胞刺激剂的完全培养 基稀释，使细胞的终浓度为3xlO"mL。
取PVDF膜包被的96孔板(MAIPAN4510板)，用来检测IFN-y。待检物共分实验组和 对照组2个组别。双孔检测，最后取平均值。每孔加10(^170Q/。乙醇预湿PVDF膜，盖上板 盖，室温孵育5min。然后吸出或弹出孔内乙醇，立即用PBS溶液洗两遍，在吸水纸上拍干。每孔加入50pL用5mLPBS稀释的包被抗体，添加无菌PBS至100|aL，盖上板盖，4'C包被 过夜。弃去孔中液体，用洗涤缓冲液PBST洗涤，静置15 30s后甩出液体，重复洗涤5次， 在无菌吸水纸上拍干板子。然后每孔加入200pL的lx封闭液R (用PBS溶液稀释10倍)， 盖上板盖，37'C孵育lh (或室温孵育2h)。弃去孔中封闭液，每孔加100pL细胞悬液(细 胞浓度为3xlO"mL，并且含有细胞刺激剂)，盖上板盖，在37。C、 5%C02、 100%湿度的环 境下孵育20 24h。甩出反应孔中的细胞，迅速在每孔加入室温下的PBS溶液250pL，然后 用力甩出，重复3次后，用PBST洗涤5次。然后每孔加入100pL生物素化检测抗体稀释 液，用封板膜封好反应板，于37'C孵育lh。弃去孔中液体，用PBST冲洗膜的两侧5次。 然后每孔加入10(VL链霉素-HRP亲和素稀释液，用封板膜封好反应板，于37'C孵育lh。 弃去孔中液体，用PBST冲洗膜的两侧5次。然后每孔立即加入100pL解冻的AEC底物液， 盖上板盖，室温避光反应15 30min;当清晰的斑点形成后，弃去孔中液体并用DDW充分 冲洗膜的两侧以终止反应。室温下干燥PVDF板，用免疫斑点图像分析仪计数。统计学处 理Eli-spot结果采用SPSS统计软件12.0中的单因素方差分析法进行各组之间的数据分 析。序列表
<110〉王炜赵文明马静李慎涛
〈120〉 0PG-HSP70融合蛋白的制备方法及用途
<腸9
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 401
<212> PRT
〈213> Artificial
<220>
〈223> OPG蛋白 〈220>
<221> MISC—FEATURE
<222> (1)..(401)
〈400〉 1
Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp lie Ser lie
15 10 15
Lys Trp Thr Thr Gin Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp
20 25 30
Glu Glu Thr Ser His Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr 35 40 45Lys Gin His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro 55
Thr Asp Ser Trp
Tyr Leu 50
Cys Pro Asp His Tyr 65
Leu Tyr Cys Ser
Tyr 70
Val Cys Lys Glu
Thr 60
Thr Ser Asp Glu
Pro 85
Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val 100
Glu Phe Cys Leu
His Thr Ser Asp Glu Cys 75 80
Leu Gin Tyr Val Lys Gin Glu 90 95
Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr
Leu Glu lie 115
Gly Val Val Gin Ala Gly 130
Cys Pro Asp Gly Phe 145
Arg Lys His Thr
Cys 105
His Arg Ser Cys
Lys 120
Thr Pro Glu Arg Asn 135
Ser Asn Glu Thr
Phe 150
Cys Ser Val Phe
Gly 110
Pro Pro Gly Phe 125
Thr Val Cys Lys Arg 140
Ser Lys Ala Pro
Asn 165
Gly Asn Ala Thr His Asp Asn lie 180
Gly lie Asp Val
Ser Ser Lys Ala Pro Cys
155 160
Gly Leu Leu Leu Thr Gin Lys
170 175
Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr
Gin Lys Cys 195
Phe Ala Val Pro Thr Lys 210
Asp Asn Leu Pro Gly 225
Lys Arg Gin His
Cys 185
Leu Cys Glu Glu
Thr 200
Phe Thr Pro Asn Trp 215
Lys Val Asn Ala
Thr 230
Ser Gin Glu Gin
Glu 190
Ala Phe Phe Arg 205
Leu Ser Val Leu Val 220
Ser Val Glu Arg
Ser 245
Trp Lys His Gin Asn Lys Ala Gin 260
Leu Cys Glu Asn
Glu Ser Val Glu Arg lie
235 240
Thr Phe Gin Leu Leu Lys Leu
250 255
lie Val Lys Lys lie lie Gin
Asp lie Asp 275
Ser 280
Asp 265
Val Gin Arg His
lie 285
lie 270
Gly His Ala
14Asn
Lys 305 Pro
Gly
Lys
lie
Phe 385 Leu
Leu Thr Phe 290
Lys Val Gly
Glu Gin Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly
300
lie Lys Ala Cys
Leu 295
Asp lie Glu Lys
Ala Glu 310
Ser Asp Gin lie Leu Lys Leu Leu 325
Thr Leu Lys Gly
Asp Gin Asp 340
Thr Tyr His Phe Pro Lys 355
Arg Phe Leu His Ser 370
Leu Glu Met
Thr lie Lys Ala Cys Lys 315 320 Ser Leu Trp Arg lie Lys Asn 330 335 Met His Ala Leu Lys His Ser
lie Gly 390
Leu 345
Thr Val Thr Gin Ser 360
Thr Met Tyr Lys
Phe 375
Asn Gin Val Gin
Lys 350
Leu Lys Lys Thr 365
Tyr Gin Lys Leu
Ser 395
Leu 380
Val Lys lie Ser
Cys 400
<210> 2
<211〉 625
〈212> PRT
<213〉 Artificial
〈220>
<223〉 HSP蛋白
<220>
〈221〉 MISC_FEATURE <222> (1)..(625)
<400> 2Met Ala Arg Ala Val Gly lie Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val 1
Ser Val
Val 5
Gly
Leu Glu Gly Gly Asp Pro
Val 25 Ala
Gly 10
Val Val Ala Asn
Ser 30 Gly
Val 15 Glu
Gly
Glu 20
Ser Arg Thr Thr Pro Ser lie Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val
Thr Thr Pro Ser lie Val Ala Phe Ala Arg Asn 35 40 45
Leu Val Gly Gin Pro Ala Lys Asn Gin Ala Val Thr Asn Val Asp Arg
50 55 60
Thr Val Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Ser Asp Trp Ser lie Glu 65 70 75 80
lie Asp Gly Lys乙ys Tyr Thr Ala Pro Glu lie Ser Ala Arg lie Leu
85 90 95
Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp lie Thr
100 105 110
Asp Ala Val lie Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gin Arg Gin 115 120 125
Lys Asp Ala Gly Gin lie Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg lie
Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gin lie Ala Gly Leu Asn 130 135 140
Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys 145
Glu Lys Glu Gin
Ala 150
lie Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly
Tyr 155 Leu
Arg lie Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr 165 170 175
Asp Val Ser Leu Leu Glu lie Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg
Gly 160 Phe
Ala
Leu Leu Glu lie Gly Glu Gly Val Val Glu Val 180 185 190
Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gin Arg Val
195 200 205
Val Asp T卬Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly lie Asp Leu
210 215 220
Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gin Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys 225 230 235 240Ala Lys lie Glu Leu Ser Ser Ser Gin Ser Thr Ser lie Asn Leu Pro
250 255 Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gin
Leu 245
Asp Ala Asp Lys
Tyr lie Thr Val 260
Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gin 275
Lys Pro Phe Gin
Thr Arg 290
Ser Glu lie Asp His 305
Ala Val Thr Asp
Asn 265
Arg lie Thr Gin Asp 280
Val lie Ala Asp
Ser 295
Val Val Leu Val Gly 310
Val Lys Glu Leu
Leu 325
Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val 340
Leu Lys Gly Glu
Thr 300
Gly Ser Thr Arg 315
Gly Gly Lys Glu
Asp 270
Leu Leu Asp Arg 285
Gly lie Ser Val
Ala Gly Val 355
Thr Pro Leu Ser Leu Gly 370
Leu lie Glu Arg Asn 385
Thr Thr Ala A印
Thr 330
Val Ala Val Gly Ala 345
Lys Asp Val Leu
Val 360
lie Glu Thr Lys Gly 375
Thr lie Pro Thr
Met Pro 320 Pro Asn 335 Ala Leu Gin 350
Leu Leu Asp Val 365
Val Met Thr Arg
Thr 390
Asn Gin Pro Ser
Gly 380
Arg Ser Glu
Asp 405
Gly Glu Arg Glu lie Ala Ala His 420
lie Pro Pro Ala
Leu Thr Gly 435
Thr Phe Asp lie Asp Ala 450
Lys Gly Thr Gly Lys Glu 465 470
Lys 395
Val Gin lie Gin Val 410
Asn Lys Leu Leu Gly 425
Arg Gly lie Pro
Pro 440
Gly lie Val His
Asn 455
Asn Thr lie
Thr Phe 400 Tyr Gin 415 Ser Phe Glu 430
Gin lie Glu Val 445
Thr Ala Lys Asp
Arg lie 475
Val 460
Gin Glu Gly
Ser Gly 480Leu Ser Lys Glu Asp lie Asp Arg 485
Arg Lys Arg Arg
Ala Glu Glu Asp 500
Als Glu Thr Leu 515
Glu Gly
Glu
Ala 530
Asp Ala Ala Val 545
Ser Ala lie Lys
Leu Gly Gin Ala 580
Gly Ala Ala His 595
Asp Val
Ala
Lys 625
Asp 610
Val Tyr Gin Thr 520
Gly Ser Lys Val 535
Ala Glu Ala Lys 550
Ser Ala Met Glu 565
lie Tyr Glu Ala
Pro Gly Gly Glu 600
Val Asp Ala Glu 615
Met lie Lys Asp Ala Glu Ala His
490 495 Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gin 505 510 Glu Lys Phe Val Lys Glu Gin Arg 525
Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val 540
Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp lie 555 560 Lys Leu Gly Gin Glu Ser Gin Ala
570 575 Ala Gin Ala Ala Ser Gin Ala Thr 585 590 Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser 605
Gly Arg Glu Ala
Val Val Asp Asp 620
〈210> 3
<211> 薦
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial
<220〉
〈223〉 OPG蛋白的编码序列
〈220>
18<221〉 misc—feature 〈222〉 (l)..(謹)
〈400〉 3
atgaacaagttgctgtgctgcgcgctcgtgtttctggacatctccattaagtggaccacc60
cagg犯acgtttcctccaaagtaccttcatt3tg3Cg犯g犯acctctcatcagctgttg120
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gtgtgcgccccttgccctgaccactactac3cagacagctggcacaccagtgacgagtgt240
ctatactgcagccccgtgtgCgagctgagc鄉agtgcaatcgcacc300
cacaaccgcgtgtgcg犯tgc卿g卿ggcgctaccttga_g3ta_g8gttctgcttga犯360
cataggagctgccctcctggatttggagtggtgc肌gctgg犯ccccagagcgaaataca420
gtttgcaaaagatgtccagatgggttcttctcaaatgagacgtcatctaaagcaccctgt480
caaattgcagtgtctttggtctcctgctaactcagaaagg540
tatgttccggtcaac tcaaaaatgtgg犯tagatgttacc600
ctgtgtg鄉aggcattcttcaggtttgctgttcctacaa8gttt8CgCCtaactggctt660
agtgtcttggtageic犯tttgcctggcacccag卿gtgt720
a犯cggcaacacagctcacattccagctgctgaagttatg780
犯gatatagtc犯g犯gatcttgacctctg840
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agcttaccgggaaag犯sgtgggagc卿3gacattgaaaaaacaataaaggc3tgca肌960
cccagtgaccagatcctg肌gctgctcagtttgtggcgaacgaccaagac1020
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gtcactcagagtCt犯3g^Lgaccatcsggttccttcacagcttcacaat1140
t8tC8g犯gttatttttagaaaccaggtccaat犯gctgc1200
ttataa1206
<210〉 4
<211> 1878
<212> DNA
〈213〉 Artificial<220>
<223> HSP蛋白的编码序列 〈220>
<221> misc一feature
〈222〉 (l)..(腦)
<400〉 4
atggctcgtgcggtcgggatcgacctcgggccgtcgtctcggttctggaa60
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gcgttcgcccgc犯cggtgaggtgctggtcggccagcccgggcsgtgacc180
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g卿鄉鄉agcgaatcctggtcttcgacttgggtggtggcactttcgacgtttccctg540
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gacatcgacg ccaacggcat tgtgcacgtc 1380
犯cacgatcc g犯tccfigg3 3ggctcgggc 1440
犯ggacgccg aagcgcacgc cgaggaggat 1500
aatc犯gccg agacattggt ctaccagacg 1560
gagggtggtt cg犯ggtacc tg犯gac3Cg 1620
gcgaaggcgg cacttggcgg atcggatatt 1680
ggcc鄉3gt cgc兆gctct ggggcaagcg 1740
gccactggcg ctgcccaccc cggcggcgag 1800
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1878
〈210〉 5
〈211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial
〈220〉
〈223〉 引物
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〈221〉 misc一feature 〈222〉 (l).. (23)
<400> 5
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〈210〉 6 <211> 23 <212> DNA<213> Artificial <220〉
<223〉 引物 <220>
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〈400〉 6
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〈220>
<223〉 引物 <220>
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<400> 7
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<223> 引物 <220>
<221> misc—feature
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〈213〉 Artificial
<220>
〈223> 引物 〈220〉
<221> misc—feature
〈222> (1)..(51)
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ccgctcgagt caggcgtcat tgaagtaggc gggcgtcgtg ataaccgcgt c 51
2权利要求
1. 一种产生OPG-HSP70融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码OPG、其变体或片段的核苷酸序列和编码HSP蛋白、其变体或片段的核苷酸序列可操作地连接于表达载体，得到OPG-HSP70融合蛋白重组表达载体；(b)将步骤(a)中的重组表达载体转化入大肠杆菌，筛选获得表达OPG-HSP70融合蛋白的工程菌；(c)在合适的条件下发酵培养诱导表达融合蛋白；(d)从步骤(c)中的培养产物中纯化分离所述融合蛋白；其中所述融合蛋白的形式为R1-L-R2形式，其中R1为OPG蛋白、或其变体或片段，R2为HSP蛋白、或其变体或片段，L为接头蛋白。所述OPG蛋白，或其变体、片段选自(1)SEQID No1所示的蛋白序列；(2)氨基酸序列22-X，其中X为SEQIDNo1所示的包括位置185—401的任意氨基酸残基。所述的HSP70蛋白、或其变体或片段选自(1)SEQIDNo2所示的氨基酸序列；(2)氨基酸序列ITDAVITTPAYFNDA。所述L接头选自(1)ala-(ala)n-ala，n可以是1～4间的整数；(2)gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；(3)gly-pro-gly；(4)gly-gly-pro-gly-gly；(5)ser-gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；(6)val；(7)tyr-val；(8)亚部分(1)-(7)的任何组合。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)包括重组克隆质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞，挑选单菌落接种于5mL2xYT培养基(含25mg/L卡那霉素)，37°C 振荡过夜。次日1: 50转接后，37。C培养2h，加入IPTG使之终浓度为0.1mmol/L， 30。C继 续振荡培养5h后离心收集菌体。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)包括采用包涵体的溶解，稀释复性及分子筛层析获得目的蛋白。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列22_X是第22_194为氨基酸。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白潜在用于类风湿关节炎的治疗。
全文摘要
本发明为“OPG-HSP70融合蛋白的制备方法及用途”，属生物医药新技术领域。本发明提供了一种骨保护素-热休克蛋白70(OPG-HSP70)融合蛋白药物。该药物针对类风湿性关节炎(RA)最重要的病理学特征关节滑膜炎伴有软骨和骨的破坏，通过骨保护素(OPG)作为诱饵受体，可与成骨细胞等细胞表达的核因子κB受体活化因子配体(RANKL)结合，阻断RANKL与破骨细胞表达的RANK结合，从而抑制破骨细胞参与的骨吸收；利用热休克蛋白(HSP)的保护性多肽片段抑制关节炎症。发明包括编码该融合蛋白的DNA序列；经重组技术产生这种融合蛋白的方法；以及该融合蛋白的生物学活性等。
文档编号C07K19/00GK101434656SQ20071018793
公开日2009年5月20日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者李慎涛, 炜 王, 赵文明, 静 马 申请人:王 炜;赵文明;马 静