专利名称：Sg融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学生物学技术领域，是一种可用于预防和治疗放、 化疗所引起的造血损伤和具有增强免疫功能的融合蛋白。
背景技术：
放疗和化疗是治疗多种恶性肿瘤的有效手段，肿瘤患者在放、化 疗过程中造血系统最容易诱发损伤，同时出现免疫功能下降。目前同 步放化疗的应用提高了肿瘤患者的生存率，但患者的造血和免疫系统 损伤加重，使得感染、出血等并发症的发生率增加，影响疗效，因此 尽快重建造血功能对治疗顺利进行至关重要。目前临床常用于造血损 伤修复的药物是GM-CSF、 G-CSF， GM-CSF主要作用于粒单系祖细 胞，促进其增殖分化，它对造血干细胞、髓系多能祖细胞以及红系、 巨核系造血均有作用。但是它促进造血增殖的作用为暂时性，维持时 间短暂，停药后效果即消失，因此寻找新的能够修复造血损伤，同时 尽快恢复患者免疫功能的方法十分必要。
近年来趋化因子及其受体在造血调控中的作用日益引起人们的 关注，趋化因子超家族的成员多为分子量8 12KD的小分子蛋白，现 在已经知道有50多种趋化因子，其中基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor,SDF-1)对造血功能的调节显得最为突出。SDF-1属CXC 型趋化因子，较低浓度的SDF-1能够产生趋化及抗肿瘤免疫反应。同 时不会诱导肿瘤细胞产生对放化疗的抵抗作用。SDF-1可与多种造血 生长因子协同，促进髓系、巨核系造血前体细胞的增殖与分化。
GM-CSF是一种能促进骨髓粒系、单核细胞系、巨噬细胞系发育 和成熟，增加外周血成熟粒细胞、单核细胞功能的一种细胞因子，主 要应用于各种原因引起的白细胞减少症，与其它造血调控因子如EPO、 G-CSF不同，它不是刺激单一一种细胞增殖，而是作用于多种细胞而 发挥效应。临床己应用于放化疗患者的造血恢复，但效果不十分满意,
大部分患者停药后白细胞即下降，再次应用疗效不佳。 发明内容:
本发明的目的是提供一种可用于预防和治疗放、化疗所引起的造 血损伤和具有增强免疫功能的融合蛋白。
本申请人在实验中发现当SDF-1与GM-CSF联用后，能够快速趋 化、动员造血干/祖细胞，促进造血重建效应，与单独应用GM-CSF相 比，效果更为迅速和持久。
本发明构建SDF-1与GM-CSF的融合基因，该融合基因由SDF1 基因、rhGM-CSF基因，连接肽设计合成。
SDF-1基因(genebank号AY802782)序列如SEQ IDNO:l所示， 具体序列如下
atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60 gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120 agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180 gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240 gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatg 279
rhGM-CSF基因(genebank号M11734)序列如SEQ ID NO:2所
示，具体序列如下
aaagttctct ggaggatgtg gctgcagagc ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc 60
atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc agcacacagc cctgggagca tgtgaatgcc 120
atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa 180
acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc 240
ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc 300
atgatggcca gccactacaa acagcactgc cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc 360
cagattatca cctttgaaag tttcaaagag aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc 420
tttgactgct gggagccagt ccaggagtga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg 480
gagctgctct ctcatgaaac aagag 505
连接肽为(Gly4Ser) 3，编码该连接肽的基因序列如SEQ ID NO:3 所示，具体序列如下
ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct ggtggcggtg gttct本发明提供一种SG融合蛋白，编码该蛋白的基因具有如SEQID NO:4所示的核苷酸序列，全长为850bp，具体序列如下
勘I
Kex2
gacgggaagcccgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagcc
catgaaacaagagTGAGMTTC Stop
上述基因中，头尾部分添加了酶切位点，CTC GAG和GM TTC;中间 部分用小写字母表示的为目的序列，加框的为连接肽；末尾添加了终 止密码子TGA，通过^TwI/五coi I这两个位点亚克隆入pPIC9k载体中。
SG融合蛋白的表达，因为pPIC9K质粒载体带有两个Xho I位点， 分别位于1193 (MCS)和5710处，需要将5710处的Xhol进行了点 突变，对pPIC9K载体进行改造，之后才能将上述目的基因在Xho I 和EcoRI双酶切位点转入载体，这样表达的蛋白为分泌蛋白，而且不 带有任何多余的氨基酸，不会对重组蛋白的结构和功能造成影响。
本发明构建新型细胞因子SDF-1/GM-CSF (SG)，这种新型细胞 因子会具有比单一细胞因子更好的生物学功能，有望成为一种在造血 调控及抗肿瘤免疫中具有应用价值的新型细胞因子。
上述的SG融合蛋白可用于制备预防和治疗放疗或化疗所引起的 造血损伤药物。
上述的SG融合蛋白可用于制备增强免疫功能药物。
图1是改造后的pPIC9K载体的结构示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述 实施例l: SG融合蛋白的制备 1. PPIC9K- SDFl-rhGM-CSFl克隆的制备
1) SDFl-rhGM-CSFl基因委托invitrogen公司合成，装载在 pMD18-T (购自TAKARA公司)载体中。用EcoRI和Xho I(TAKARA 公司产品)双酶切pMD18-T-SDFl-rhGM-CSFl，割胶回收小片断，即得 到两端带有EcoRI和Xho I多克隆位点的SDFl-rhGM-CSFl基因片断。
2) pPCI9K质粒(购自Invitrogen公司)同样用EcoRI和Xho I进 行双酶切处理后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示条带大小正确，割胶 后用Axygen公司胶回收试剂盒回收。
pMD18-T-SDFl-rhGM-CSFl和pPCI9K质粒酶切反应体系如下
Vector (ppic9k， pMD 18-T) 8(il ( 1吗)
10xH Buffer 2^1
10xBSA 2pl
EcoRI 0.5jil
Xho I I
H20 7^1 Total 20^1 37°C 2—3h
3) 将酶切好的片段SDFl-rhGM-CSFl和载体PPIC9K用T4 DNA Ligase (MBI公司产品)16。C连接3小时，连接体系如下
H20 Oul T4buffer M PPIC9K (已处理) 2ul SDFl-rhGM-CSFl 6ul
T4 DNA Ligase_M
Total 10ul
4) .将连接产物PPIC9K-SDFl-rhGM-CSFl进行转化大肠杆菌ToplO 感受态细胞,37"C培养过夜,挑取转化子，选用pPIC9K通用引物，进行 煮菌PCR验证。
5) .挑取其中的4个菌株抽提质粒进行测序验证，得到正确的 pPIC9K誦SDFl画rhGM誦CSFl克隆。
2. pPIC9K- SDFl-rhGM-CSFl亚克隆转化酵母菌株GS115
1) 重组质粒的抽提，采用华舜公司的质粒大量提取试剂盒抽提 pPIC9k及pPic9k- SDFl-rhGM-CSFl质粒(各50ml菌液)，具体操作 依试剂盒说明书进行。获得pPic9k及pPic9k-HbsAg质粒各约40ug， 重新测序验证。
2) 质粒线性化，用SalI酶切pPIC9k及pPic9k-SDFl-rhGM-CSFl
质粒，条件如下
Sal I 50 U
10 XH buffer 5 ul
pPIC9k-SDFl 15 ug
ddH20 add to 50 ul
37°C 3 h
3) 将上述酶切后的质粒分别用酚-氯仿，氯仿各抽提一次，随后加 入1/10体积3 M的NaAc(pH 4.8)和2.5倍体积的无水乙醇，-20。C放置 20 min后，15000g离心15 min沉淀DNA，质粒干燥后溶于5ul无菌 超纯水中。
4) 将已线性化的pPIC9K- SDFl-rhGM-CSFl质粒DNA电转化宿主 菌GS115感受态细胞(购自Invitrogen公司)中。将转化产物涂布于 缺乏组氨酸的RDB营养缺陷平板，3-4天后可见重组克隆长出。电转 化仪为Bio-Rad公司产品；电转条件电压，1.5KV;电容，25|LlF; 电阻，200Q;电击时间，3.8 5ms。
3. 毕赤酵母表达菌株的筛选和条件优化
1)挑取48个长势较好的酵母转化菌落进行小规模发酵，用Dolt Bolting方法进行初步筛选。
①在48孔深孔版中加入3 mLBMGY培养基中，接种单菌落，于 30°C ， 250 rpm培养至OD綱约5-6 (20-24h)
② 1500g， 5min离心收集菌体，用BMMY重悬菌体，使006。。约在 10-15左右(约lmL),于3(TC，250rpm继续培养至OD6。o约为20(6-8h)
(另取一部分菌株在YPD培养基中做快速表达实验)。
③ 每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5-1.0%
④ 表达48小时后取样，在醋酸纤维膜上点样lul (x2)，用SDF1 抗体做Dolt Bolting检测目的蛋白的表达情况。
2)高拷贝重组子煮菌PCR验证Taq buffer2ul
10mMdNTPslul
10mM SHH-Flul
10mM SHH-Rlul
Taq酶0.5U
水补充至20ul
95 °C5min
95 。C30sec
50°C30sec
72 °C45 sec
以上35个循环
挑取以上7个表达菌株按以上程序进行PCR
3)将上述筛选出有表达的酵母转化子菌株进行放大诱导表达实验。 用SDS-PAGE和免疫印迹(WesternBolt)验证筛选高水平表达菌株。
① .挑选上述的4个菌落和空载体对照株，接种于装有25 ml BMGY 培养基的250 ml摇瓶中，于30。C/250 rpm培养至OD, = 2-6 (16-18 h);
② .室温下1500 3000 g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养 体积的BMMY重悬菌体(约10 20ml);
③ .将步骤2所得的菌液置于100 ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布 封口，放置于30。C/250rpm的摇床上继续生长；
.每24h向培养基中添加100X甲醇至终浓度为0.5 1.0%; ⑤.按时间点分别取菌液样品，取样量约为lml (似需要量取样)， 置于1.5ml EP管中，最大转速离心2 3min，分别收集上清和菌体，分
析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取0、 24、 48、 72、 96和120h;
⑥.12， OOOrpm离心30分钟，收集样品的上清液，用SDS-PAGE和 Western blotting鉴定融合蛋白的表达。
4) SDS-PAGE
① .取第一天发酵上清15ul上样，12%SDS PAGE检查蛋白表达情况。
② .发酵液上清浓縮10倍SDS-PAGE电泳
实验方法在第6天样品发酵上清液中加入2倍体积的乙醇，-20°C 沉淀2h，用1/10体积的1Xloadingbuffer溶解，上样15u1, 15%SDS PAGE
胶电泳，考马斯亮蓝染色，扫描胶片。
5) 表达上清的Western Blotting检领!j
取发酵液上清原液lOul上样，SDS-PAGE蛋白电泳完成后，将蛋 白转印至PVDF膜上，结合一抗(SDF1单抗，鼠抗)和HRP标记 的二抗(兔抗鼠)，然后用immobion western chemiluminescent hrp substrate (MiUipore公司产品)显色并显影到胶片上。
将经过优化的化学全合成的SDFl-rhGM-CSFl基因装到毕赤酵母 分泌表达载体pPIC9k上，再重组入毕赤酵母菌株GS115中，优化诱导 表达条件，并通过SDS-PAGE 、 WESTERN Blotting检测 SDFl-rhGM-CSFl重组蛋白的表达。
体外生物学实验显示SG融合蛋白能促进骨髓集落细胞形成，能有 效趋化未成熟的树突状细胞，其作用强于GM-CSF。
SEQUENCE LISTING
〈110〉中国人民解放军第二军医大学
<120> SG融合蛋白
〈130>说明书，权利要求书
<160> 4
<170〉 Patentln version 3.1
<210> 1 〈211〉 279 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈400〉 1
atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60 gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120 agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180 gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240 gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatg 279
〈210〉 2 〈211〉 505 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 2
aaagttctct ggaggatgtg gctgcagagc ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc 60 atctctgcac ccgcccgctc gcccagcccc agcacacagc cctgggagca tgtgaatgcc 120 atccaggagg cccggcgtct cctgaacctg agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa 180 acagtagaag tcatctcaga aatgtttgac ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc 240
ctggagctgt acaagcaggg cctgcggggc agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc 300
atgatggcca gccactacaa acagcactgc cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc 360
cagattatca cctttgaaag tttcaaagag aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc 420
tttgactgct gggagccagt ccaggagtga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg 480
gagctgctct ctcatgaaac aagag 505
〈210〉 3 〈211〉 45 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400> 3
ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct ggtggcggtg gttct 站
〈210〉 4 〈211〉 850 〈212〉 ■ <213〉人工序列 〈400〉 4
ctcgagaaaa gaatgaacgc caaggtcgtg gtcgtgctgg tcctcgtgct gaccgcgctc 60
tgcctcagcg acgggaagcc cgtcagcctg agctacagat gcccatgccg attcttcgaa 120
agccatgttg ccagagccaa cgtcaagcat ctcaaaattc tcaacactcc aaactgtgcc 180
cttcagattg tagcccggct gaagaacaac aacagacaag tgtgcattga cccgaagcta 240
aagtggattc aggagtacct ggagaaagct ttaaacaaga ggttcaagat gggtggcggt 300
ggttctggtg gcggtggttc tggtggcggt ggttct,g ttctctggag gatgtggctg 360
cagagcctgc tgctcttggg cactgtggcc tgcagcatct ctgcacccgc ccgctcgccc 420
agccccagca cacagccctg ggagcatgtg aatgccatcc aggaggcccg gcgtctcctg 480
aacctgagta gagacactgc tgctgagatg aatgaaacag tagaagtcat ctcagaaatg 540
tttgacctcc aggagccgac ctgcctacag acccgcctgg agctgtacaa gcagggcctg 600
cggggcagcc tcaccaagct caagggcccc ttgaccatga tggccagcca ctacaaacag 660
cactgccctc caaccccgga aacttcctgt gcaacccaga ttatcacctt tgaaagtttc 720
aaagagaacc tgaaggactt tctgcttgtc atcccctttg actgctggga gccagtccag 780
gagtgagacc ggccagatga ggctggccaa gccggggagc tgctctctca tgaaacaaga 840
gtgagaattc 850
权利要求
1.一种SG融合蛋白，编码该蛋白的基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
2、 如权利要求1所述的SG融合蛋白在制备用于预防和治疗放疗或化 疗所弓i起的造血损伤药物中的应用。
3、 如权利要求1所述的SG融合蛋白在制备用于增强免疫功能药物中 的应用。
全文摘要
本发明涉及医学生物学技术领域，目前临床常用于造血损伤修复的药物是GM-CSF、G-CSF，GM-CSF主要作用于粒单系祖细胞，促进其增殖分化，它对造血干细胞、髓系多能祖细胞以及红系、巨核系造血均有作用。但是它促进造血增殖的作用为暂时性，维持时间短暂，停药后效果即消失。本发明提供一种可用于预防和治疗放、化疗所引起的造血损伤和具有增强免疫功能的融合蛋白。编码本发明SG融合蛋白的基因具有如SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，全长为850bp。体外生物学实验显示本发明的SG融合蛋白能促进骨髓集落细胞形成，能有效趋化未成熟的树突状细胞，其作用强于GM-CSF。
文档编号A61P7/00GK101372513SQ20081020139
公开日2009年2月25日 申请日期2008年10月20日 优先权日2008年10月20日
发明者刘永明, 居小萍, 张晓青, 斌 徐, 樱 陈 申请人:中国人民解放军第二军医大学