专利名称：对溶菌酶有高效吸附和可控缓释的纳米羟基磷灰石及制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程材料技术领域，涉及一种用于对溶菌酶吸附和缓释的纳米羟基磷灰 石材料及其制备方法。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme， LSZ)是一种由129个氨基酸构成的碱性球蛋白，能破坏细菌胞壁和杀 灭细菌，因而具有抗菌、抗病毒并加快组织恢复等作用。在食品工业、生物工程及医学等领 域有着广泛的应用，如食物的防腐保鲜、提取菌体内活性物质的工具酶、龋齿的预防等。龋 齿的发生与齿质、糖和病原菌三种因子的相互作用有关。因此，有效消除口腔中各种病原菌 的存在是预防龋齿的有效措施。过去常用溶菌酶制备的口腔药片或漱口液来有效预防龋齿， 但该产品中游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活， 纯化困难，不能重复使用。为了克服这些问题，自20世纪60年代起，人们就致力于采用化学 或物理的手段，将其束缚或固定在一定的载体上发挥作用，但如何实现溶菌酶的缓释可控及 载体的同歩降解 一直是限制其应用领域的重要问题。
羟基磷灰石(Hydroxyapatite， HA)是常见的一种生物活性材料，与其它生物材料显著不 同之处在于它具有与人体骨骼和牙齿相同的无机矿物成分，并且物理和化学性质稳定。有关 纳米羟基磷灰石(n-HA)应用于硬组织修复的研究已经相当广泛，由于羟基磷灰石晶面规则的 立体化学结构，可以分辨出被吸附在分子表面上原子几何排列的微小差别，因此对DNA、核 苷酸、多肽以及多种蛋白质有很好的选择吸附性能。同时HA无毒，生物相容性好，多孔性质 结构易于在体内降解，适合做药物载体。同时，载药纳米羟基磷灰石具有粘附性，粒径小， 可以延长药物在局部组织或部位的滞留时间，增加药物的接触面积，提高药物的吸收和生物 利用度。
近年来有关纳米羟基磷灰石作为药物载体的报道日益增多。如中国专利(2006,公开 号CN1791424)公开了一种含有人体生长激素的药物缓释剂及其制备法，其载体为掺锌多 孔羟基磷灰石，可最大吸附20%的药物。为了避免药物初期的爆发性释放，在缓释剂中添加 了氯化锌。锌虽然是生物体必需的微量元素，但氯化锌却是一种毒性很强的物质，因此当该 缓释剂在自行降解的过程中就会在体液中产生氯化锌毒性物质，造成对生物体的伤害，因而 也限制了其在生物工程领域中的应用，例如不适合负载碱性蛋白。中国专利(2006，公开
号CN1799643)公开了生物医用缓释金属离子的磷酸钙复合粉末及其制备方法。磷酸钙作 为负载并缓释金属离子的载体材料，但其在制备过程中的烧结工艺，使得它的结晶度较高而 降解和吸收能力不够理想。目前应用于负载溶菌酶的载体均为各类有机物质，比如中国专利 (2003，公开号CN1413574)公开了一种溶菌酶防晒美白霜，其载体为甲氧基肉桂酸辛酯 等多种有机物质，虽然有机类物质可在体内水解消失而成为溶菌酶的理想载体，但溶菌酶水 溶性高，使用有机物质作为载体时，无法避免在投药初期产生过多释放的情况，因而在生物 医学工程领域中的应用受到限制。
基于上述事实，提出一种无毒、生物相容性好、表面活性高，对溶菌酶具有高效吸附性 能的纳米羟基磷灰石材料具有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备方法简单、吸附性能高且缓释可控的纳米羟基磷灰石材 料及其制备方法，这种材料可以作为溶菌酶制剂在龋齿防护等医学领域应用中的固相载体，
提供缓释性能，可用于疾病防护和治疗。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下采用化学共沉淀法制备羟基磷灰石纳米粉体 (n-HA)。配置合适pH值的缓冲溶液，将一系列不同浓度的溶菌酶溶液按照一定的固液比加 入n-HA进行搅拌吸附后过滤，室温下真空干燥得到载有溶菌酶的磷灰石粉末，根据不同应 用场合的需要，将其置于一定温度和pH值的缓冲溶液中进行解吸缓释。
本发明提供的具有高效吸附和可控缓释性能的羟基磷灰石的制备及其性能实施包括以下 步骤
(1) 弱结晶性羟基磷灰石的制备按照一定的Ca/P摩尔比(1.6-1.7)配制一定浓度的氢 氧化钙、碳酸钙或醋酸钙的含钙化合物和磷酸二氢铵、磷酸或磷酸氢钙的含磷化合物溶液， 完全混合后加入乙醇、聚乙二醇或异丙醇的醇类分散剂继续搅拌反应一段时间20 60min， 将生成的悬浊液在25 6(TC进行搅拌或陈化20 26h进行后续处理，过滤洗涤至溶液呈中性， 所得滤饼在8(TC烘箱隔夜干燥后碾磨成粉，制得所需纳米羟基磷灰石材料；
(2) 纳米羟基磷灰石材料吸附溶菌酶将一系列浓度的溶菌酶(0.2mg/ml 1.0mg/ml)溶 于最适酸碱度pH=7.3， 0.2mol/L的磷酸缓冲液中，溶菌酶与羟基磷灰石的质量配比为 3:100 3:20。在室温下，搅拌吸附1小时。过滤，真空干燥所得粉末，获得负载有溶菌酶的粉 体材料。
(3) 溶菌酶从粉体材料上的可控缓释按照8%的质量配比将负载有溶菌酶的粉体材料溶 于pH分布在4.0 7.3的醋酸缓冲液中，在37'C恒温下搅拌解吸，至载体中溶菌酶不再释出， 溶液中(^2+离子浓度不再增加为止。
本发明所提及的纳米羟基磷灰石载体材料具有以下特点
(1) 反应条件温和，操作简便易行，原料简单易得。
(2) 通过控制初始反应物的浓度、磷酸二氢铵和无水乙醇的体积比及陈化时间，制备弱 结晶性纯相羟基磷灰石，具有大比表面积、高表面活性的特点。选用最佳的缓冲液及其酸碱 度可以实现对溶菌酶的高效吸附。
(3)通过选择不同的解吸缓冲液、调节缓冲液的pH值来实现溶菌酶的缓释时间和缓释速 率可控。
图1是纳米羟基磷灰石的X射线衍射(XRD)测试结果，证明其属于弱结晶型的晶体
结构；
图2是纳米羟基磷灰石的透射电镜显微图(TEM)，证明其分散性良好，晶体为针状形貌， 且颗粒尺寸在纳米级别；
图3是纳米羟基磷灰石的孔径分布图，证明其孔径分布大小不一，在2.8nm至244nm 之间，以41.9nm处和244nm处最多；
图4是纳米羟基磷灰石的吸附-脱附回线，证明其属于介孔材料，吸附性能要优于微孔 和大孔材料；
图5是在p^7.3的磷酸缓冲液中，羟基磷灰石对不同浓度的溶菌酶的吸附曲线，分析 结果表明吸附率接近100%，证明其作为溶菌酶的载体利用率很高
图6是在pH=5.4的醋酸缓冲液中，溶菌酶随时间变化的缓释效果曲线和羟基磷灰石降 解溶出C^+离子浓度随时间变化曲线，证明其缓释效率可控，作用时间长，且分散性好；
图7是在pH=5.4的醋酸缓冲液中，羟基磷灰石降解溶出C^+离子浓度随时间变化曲线， 证明羟基磷灰石可以在溶菌酶完全释放前己完成降解。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。 实施例1.对溶菌酶吸附量为4.77%~19.06%，缓释时间在90 960min内可调，缓释效率最高 为95%的方法
分别配制浓度为0.5mol/L的氢氧化钙(中国医药集团上海化学试剂公司)悬浮液50mL 和浓度为0.3md/L的磷酸二氢铵(中国医药集团上海化学试剂公司)水溶液50mL，将磷酸 二氢铵水溶液以一定的速率(0.02ml/S)滴加到不断搅拌的氢氧化钙悬浮液中，搅拌速率为 180rad/min，滴加完毕后将50ml的无水乙醇以相同的速率滴加到反应溶液中，反应在室温下 进行，经30min反应后，将生成的乳浊液在室温下静置陈化24h，然后将沉淀产物经去离子 水反复洗涤至中性(pH-7)，滤纸过滤、于8(TC下隔夜干燥后，制成纳米羟基磷灰石粉体，其 粒径尺寸均匀，约为160X30 nm，孔径分布在在2.8nm至244nm之间,(如图3所示)，比表面 积为220m2/g。
取1.09g十一水合磷酸氢二钠，0.3g 二水合磷酸二氢钠配成5份250ml浓度为0.2mol/L, pH=7.3的磷酸缓冲液，分别将50、 100、 150、 200、 250mg的溶菌酶加入缓冲溶液中，配制 成浓度为0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l.Omg/ml的溶菌酶溶液，分别取120ml不同浓度的溶液，加入 0.8g纳米羟基磷灰石在室温下搅拌吸附lh。 一系列不同浓度的溶菌酶(0.2mg/ml 1.0mg/ml) 在纳米羟基磷灰石载体中的含量为4.77%~19.06%。
取吸附l.Omg/ml的溶菌酶悬浮液，准确称取负载有溶菌酶的粉体材料0.6g，将其溶于 400ml，浓度为0.2mol/L, pH分布在4.0 7.3的醋酸缓冲液中，在37。C恒温下搅拌解吸，至 溶液中Ca^离子浓度不再增加为止。释放时间在90 960min内可调，释放率保持在60%以 上最高可达95%。其中以pl^5.4的醋酸缓冲液缓释时间最长，释放率最高。
实施例2.对溶菌酶吸附量为3.58°/。~17.36%，缓释时间在90 360min内可调，缓释效率 最高为87%的方法
配制浓度为0.5mol/L的硝酸钙(中国国药集团上海化学试剂公司)水溶液50mL，加氨 水调节pH40.71;浓度为0.3mol/L的磷酸氢二铵(中国国药集团上海化学试剂公司)水溶液 50mL，加氨水调节pH=10.36。在4(TC水浴的条件下，将磷酸氢二铵水溶液以一定的速率 (0.02ml/S)滴加不断搅拌的硝酸钙水浮液中，搅拌速率为180转/分，滴加完毕后再用氨水 调节反应产物pH-lO，继续搅拌反应30min，将生成的乳浊液在恒温4CTC水浴下静置陈化24h， 然后将沉淀产物经去离子水反复洗涤至中性&11=7)，滤纸过滤、于8(TC下隔夜干燥后，制成 纳米羟基磷灰石粉体，其比表面积为135m2/g。
取1.09g十二水合磷酸氢二钠，0.3g 二水合磷酸二氢钠配成5份250ml浓度为0.2mol/L, pH=7.3的磷酸缓冲液，分别将50、 100、 150、 200、 250mg的溶菌酶加入缓冲溶液中，配制 成浓度为0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l.Omg/ml的溶菌酶溶液，分别取120ml不同浓度的溶液，加入 0.8g纳米羟基磷灰石在室温下搅拌吸附lh。 一系列不同浓度的溶菌酶(0.2mg/ml~1.0mg/ml) 在纳米羟基磷灰石载体中的含量为3.58% 17.36%。
取吸附l.Omg/ml的溶菌酶悬浮液，准确称取负载有溶菌酶的粉体材料0.6g，将其溶于 400ml,浓度为0.2mol/L， pH分布在4.0~7.3的醋酸缓冲液中，在37'C恒温下搅拌解吸，至 溶液中Ca^离子浓度不再增加为止。释放时间在90 360min内可调，释放率保持在60%以 上，最高可达87%。其中以pH-5.4的醋酸缓冲液缓释时间最长，释放率最高。
实施例3.对溶菌酶吸附量为2.14%~15.13%，缓释吋间在60 240min内可调，缓释率最高
为75%的方法。
配制浓度为0.5mol/L的硝酸钙(中国国药集团上海化学试剂公司)水溶液50mL，加氨 水调节pH-10.71;浓度为0.3moI/L的磷酸氢二铵(中国国药集团上海化学试剂公司)水溶液 50mL，加氨水调节pH=10.36。在6CTC水浴的条件下，将磷酸氢二铵水溶液以一定的速率 (0.02ml/S)滴加不断搅拌的硝酸钙水浮液中，搅拌速率为180转/分，滴加完毕后将生成的 乳浊液在恒温60'C水浴下搅拌反应24h，然后将沉淀产物经去离子水反复洗涤至中性(pH^7)， 滤纸过滤、于8(TC下隔夜干燥后，制成纳米羟基磷灰石粉体，其比表面积为135m2/g。
取1.09g十二水合磷酸氢一钠，0.3g 一水合磷酸二氢钠配成5份250ml浓度为0.2tnol/L, pH=7.3的磷酸缓冲液，分别将50、 100、 150、 200、 250mg的溶菌酶加入缓冲溶液中，配制 成浓度为0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l.Omg/ml的溶菌酶溶液，分别取120ml不同浓度的溶液，加入 0.8g纳米羟基磷灰石在室温下搅拌吸附lh。 一系列不同浓度的溶菌酶(0.2mg/ml 1.0mg/ml) 在纳米羟基磷灰石载体中的含量为2.14%~15.13%。
取吸附l.Omg/ml的溶菌酶悬浮液，准确称取负载有溶菌酶的粉体材料0.6g，将其溶于 400ml，浓度为0.2mol/L， pH分布在4.0 7.3的醋酸缓冲液中，在37'C恒温下搅拌解吸，至 溶液中Ca^离子浓度不再增加为止。释放时间在60 240min内可调，释放率保持在60%以 上，最高可达75%。其中以pH-5.4的醋酸缓冲液缓释时间最长，释放率最高。
以上不仅明确公开了所述羟基磷灰石的制备方法，而且公开了可以提高吸附量和实现缓 释性能可控的方法，利用酶和吸附剂之间的结合力变化，通过改变溶液pH、离子种类和浓度 以及温度等条件来进行解吸，从而实现吸附剂对酶的缓释可控；同时基于羟基磷灰石的弱结 晶性，其在溶菌酶完全释放前就会自行降解，溶出Ca2、不产生物毒性。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉 本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应 用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这些实施例，本领域技术 人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种具有高效吸附和可控缓释性能的纳米羟基磷灰石材料，其特征在于对溶菌酶等碱性蛋白具有较强的吸附性能，吸附率在95％以上；其缓释速率能够实现可控，羟基磷灰石同步降解，释放出Ca2+，不产生生物毒性。
2. 根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石材料，其特征在于该材料属于弱结晶性范畴，针状形貌，比表面积为80~220m2/g;具有天然微孔结构，孔径分布在3.1nm至120nm之间，其 中41.9nm处分布最多，约占70%-80%。
3. 权利要求1所述的纳米羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 弱结晶性羟基磷灰石的制备按照一定的Ca/P摩尔比配制一定浓度的含钙化合物和 含磷化合物溶液，完全混合后加入醇类分散剂继续搅拌反应一段时间，将生成的悬浊液在一定的条件下进行后续处理，过滤洗涤至溶液呈中性，所得滤饼在70°C-85'C烘箱干燥8-12小时后 碾磨成粉，制得所需纳米羟基磷灰石材料；(2) 纳米羟基磷灰石材料吸附溶菌酶将浓度为0.2mg/ml L0mg/ml的溶菌酶溶于最适酸 碱度pf^7.0-7.5， 0.2mol/L的磷酸缓冲液中，溶菌酶与羟基磷灰石的质量配比为3:100 3:20; 在室温下，搅拌吸附；过滤，真空干燥所得粉末，获得负载有溶菌酶的粉体材料；(3) 溶菌酶从粉体材料上的可控缓释按照8%的质量配比将负载有溶菌酶的粉体材料溶 于pH分布在4.0 7.3的醋酸缓冲液中，在36'C-38'C下搅拌解吸，至载体中溶菌酶不再释出， 溶液中(^2+离子浓度不再增加为止。
4. 根据权利要求3所述的纳米羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于(1)中所述一定的 Ca/P摩尔比指Ca/P=1.6~1.7,其中Ca/P=1.67为最佳配比。
5. 根据权利要求3所述的纳米羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于(1)中所述的含钙化 合物包括溶解度较低的氢氧化钙、碳酸钙或醋酸钙；所述的含磷化合物包括磷酸二氢铵、磷 酸或磷酸氢钙；所述的分散剂包括乙醇、聚乙二醇或异丙醇；其屮氢氧化钙作为钙源，磷酸 二氢铵作为磷源，乙醇作为分散剂为最佳原料选择；所述的一定速率是为了保证羟基磷灰石 前驱体能够均匀成核而不会累积长大的速率，以0.02ml/S为佳。
6. 根据权利要求3所述的纳米羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于(1)屮所述的完全混 合指含磷化合物以一定的速率，例如0.01 0.03ml/s，滴加到含钙化合物中，保证羟基磷灰石 前驱体能够均匀成核而不会累积长大；继续搅拌反应一段时间指20 60min,其中30min为 最佳搅拌时间。
7. 根据权利要求3所述的纳米羟基磷灰石材料的制备方法，其特征在于(1)中所述的将生 成的悬浊液在一定的条件下进行后续处理，指在25 6(TC进行搅拌或陈化20 26h,其中在 25'C下陈化处理24h为最佳后续处理方式。
8. 根据权利要求3所述的制备方法制得的纳米羟基磷灰石材料，其特征在于经步骤(l)、 (2) 所述的制备方法制得的纳米羟基磷灰石材料对溶菌酶的吸附性能按重量百分比计，溶菌酶 在所述纳米羟基磷灰石载体中的含量为2.14%~19.06%。
9. 根据权利要求3所述的制备方法制得的纳米羟基磷灰石材料，其特征在于经步骤(l)、 (2) 及(3)所述的制备方法制得的纳米羟基磷灰石材料对溶菌酶的可控缓释性能选用pH分 布在4.0~7.3的醋酸缓冲液，释放时间在60 960min内可调，释放率保持在60%以上，最 高可达95%;其中以pH=5.4的醋酸缓冲液缓释时间最长，释放率最高。
10. 根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石材料，其特征在于所述的同步降解纳米羟基磷灰石材料的降解率随缓释时间延长而线性增加，能够在溶菌酶完全释放之前完成降解。
全文摘要
本发明一种吸附性能良好的针状纳米羟基磷灰石材料，对于不同浓度的溶菌酶(0.2mg/ml～1.0mg/ml)其吸附含量为2.14％～19.06％，吸附率最高在95％以上，其缓释性能可控，缓释时间控制在60min～960min之间，缓释率在60％～95％之间，释放速度可以通过改变解吸溶液的种类和pH值来调节，该弱结晶性羟基磷灰石以含钙化合物和含磷化合物溶液为原料，经过滴加、反应、乙醇分散、室温搅拌或陈化等工艺制备而成，制备的羟基磷灰石粒径尺寸在纳米级别且分布均匀，具有结晶度低、比表面积大、表面活性高等特点。其对溶菌酶的吸附通过选用pH＝7.3的磷酸缓冲液依靠静电相互作用完成，具有吸附时间短、吸附量大的特点。本发明原料易得，成本低，操作简单，得到的材料具有良好的吸附性和缓释可控性能，可用作溶菌酶等碱性蛋白的缓释载体。
文档编号A61K38/43GK101385856SQ200810201339
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月17日 优先权日2008年10月17日
发明者萘 周, 姚爱华, 俊 张, 王德平, 黄文旵 申请人:同济大学