一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用的制作方法

一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。本发明公开一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重链可变区和compα螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白。本发明公开的人热休克蛋白gp96的scFv抗体具有抑制癌细胞的生长或增殖、诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭或转移、抑制肿瘤生长等作用，对于癌症的治疗具有重大价值。
【专利说明】一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人热休克蛋白gp96的抗体及其制备方法与应用；特别涉及一种 人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。

【背景技术】
[0002] 热休克蛋白（gp96蛋白）存在于人和动物几乎所有细胞的内质网膜中，也存在于 某些细胞的质膜上，它是热休克蛋白90家族（HSP90)中的成员。
[0003] 人的全长gp96蛋白由803个氨基酸组成，自N末端第1至21个氨基酸残基组成 信号肽，因此成熟的gp96蛋白由782个氨基酸组成。gp96蛋白是糖蛋白，该分子拥有6个 潜在的糖基化位点。
[0004] 犬类的gp96(与人的gp96高度同源，有98. 5%的同源性）与ATP结合的晶体结构 已经解析，单个分子分为N端结构域、中间（M)结构域和C端结构域，gp96蛋白以同源二聚 体的形式存在，其N端结合ATP，C端形成二聚化，整个二聚体从C端到N端围绕分子中轴左 旋扭曲形成扭曲的V字形。
[0005] gp96蛋白与ATP的结合及发挥水解ATP的功能与其构象变化相关，其构象变化涉 及N端结构域和M段结构域的90°的旋转，gp96蛋白构象变化引发与其它蛋白的结合或释 放。
[0006] 新型小分子抗体单链可变区片段（scFv)是由一弹性接头（linker)将Vh和V lj连 接而成的两个可变区首尾相接的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具 有抗原结合功能的Fv段，此单一肽链的结构既有利于表达和进行基因重组操作，也增加了 Fv的稳定性。scFv抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位，由于其分子量小、体内半 衰期短、免疫原性低、易于基因工程操作等特点而倍受关注。
[0007] Comp是来源于软骨寡聚基质蛋白的a螺旋肽段，该肽段自然存在于人类多种蛋 白质中，主要参与蛋白的寡聚化。


【发明内容】

[0008] 本发明的目的是提供一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用。
[0009] 本发明提供一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重 链可变区和comp a螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白；
[0010] 所述gp96抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中自N端起第3位至 第116位所示；
[0011] 所述comp a螺旋的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中自N端起第123位至第170位 所示；
[0012] 所述融合蛋白为由含有gp96抗体的重链可变区和comp a螺旋的抗体单体在所述 原核细胞中自动组装形成的多聚体。
[0013] 上述方法中，所述gp96抗体的重链可变区和所述comp a螺旋分别在所述含有 gp96抗体的重链可变区和comp a螺旋的抗体单体中的N端和C端。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述融合表达的方法是将5'_3'方向依次含有gp96抗体 的重链可变区编码基因和 comp a螺旋编码基因的DNA片段导入所述原核细胞中。
[0015] 上述任一所述的方法中，所述gp96抗体的重链可变区编码基因如SEQ ID No. 1中 自5'末端起第7位至第348位核苷酸所示；
[0016] 所述comp a螺旋编码基因如SEQ ID No. 1中自5'末端起第367位至第510位核 苷酸所示。
[0017] 上述任一所述的方法中，所述5'_3'方向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基 因和comp a螺旋编码基因的DNA片段如SEQ ID No. 1所示；
[0018] 所述含有gp96抗体的重链可变区和comp a螺旋的抗体单体的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示；
[0019] 所述DNA片段是通过重组表达载体导入所述原核细胞中的，所述重组表达载体具 体是将SEQ ID No. 1所示的DNA分子插入pET28a(+)质粒EcoR I和Xba I酶切位点间得 到的；
[0020] 所述原核细胞为大肠杆菌；
[0021] 所述大肠杆菌具体为BL21 (DE3)。
[0022] 上述任一所述的方法中，所述表达之后还包括细胞裂解、离心收集沉淀并将沉淀 进行层析分离的步骤；
[0023] 所述细胞裂解的方法具体为超声破碎。
[0024] 上述任一所述的方法中，所述层析分离包括镍离子亲和层析和分子筛层析；
[0025] 所述镍离子亲和层析的步骤如下：
[0026] a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱；
[0027] b、将所述离心收集的沉淀溶解后得到的上清加入镍离子柱；
[0028] c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去非特异性结合的蛋白；
[0029] d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；
[0030] 所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为 水；所述Na 2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述60mM咪唑溶液 中的浓度为〇. 5M，所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M，所述咪唑在所述60mM咪 唑溶液中的浓度为60mM，所述60mM咪唑溶液的pH为7. 7 ;
[0031] e、用500mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，记作蛋白液1 ;
[0032] 所述500mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂 为水；所述Na 2HPO4在所述500mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述500mM咪唑 溶液中的浓度为〇. 5M，所述尿素在所述500mM咪唑溶液中的浓度为8M，所述咪唑在所述 500mM咪唑溶液中的浓度为500mM，所述500mM咪唑溶液的pH为7. 7 ;
[0033] 所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为 水；所述Na 2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液 中的浓度为〇. 5M，所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M，所述咪唑在所述8M的尿 素溶液中的浓度为20mM,所述8M的尿素溶液的pH为7. 7 ;
[0034] 所述分子筛层析具体为Superdex 200分子筛层析；
[0035] 所述Superdex 200分子筛层析的步骤如下：
[0036] a、用pH7_7. 4的PBS溶液预平衡Superdex 200分子筛至少2个柱体积；
[0037] b、将蛋白液1加入分子筛；
[0038] c、用pH7_7. 4的PBS溶液冲洗分子筛，收集洗脱液，在280nm处测定洗脱液的吸收 值，收集分子量为440kD-669kD的洗脱峰，即为所述人热休克蛋白gp96的scFv抗体。
[0039] 上述任一所述的方法中，所述离心收集沉淀和所述将沉淀进行层析分离之间还包 括如下洗涤和调PH的步骤 ：
[0040] a、用IM的尿素溶液洗涤所述离心收集的沉淀，离心收集沉淀，记作沉淀1 ;
[0041] 所述IM的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水； 所述Na 2HPO4在所述IM的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述IM的尿素溶液中的 浓度为〇. 1M,所述尿素在所述IM的尿素溶液中的浓度为1M,所述IM的尿素溶液的pH为 7. 7 ；
[0042] b、用2M的尿素溶液洗涤沉淀1，离心收集沉淀，记作沉淀2 ;
[0043] 所述2M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水； 所述Na 2HPO4在所述2M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述2M的尿素溶液中的 浓度为〇. 1M,所述尿素在所述2M的尿素溶液中的浓度为2M,所述2M的尿素溶液的pH为 7. 7 ；
[0044] c、用3M的尿素溶液洗涤沉淀2,离心收集沉淀，记作沉淀3 ;
[0045] 所述3M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水； 所述Na 2HPO4在所述3M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述3M的尿素溶液中的 浓度为〇. 1M,所述尿素在所述3M的尿素溶液中的浓度为3M,所述3M的尿素溶液的pH为 7. 7 ；
[0046] d、将沉淀3用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液；
[0047] 所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为 水；所述Na 2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液 中的浓度为〇. 5M，所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M，所述咪唑在所述8M的尿 素溶液中的浓度为20mM,所述8M的尿素溶液的pH为7. 7 ;
[0048] e、将步骤d得到的蛋白溶液pH值调至10. 0 ;
[0049] 所述蛋白溶液pH值调至10. 0时所用的试剂具体为NaOH水溶液，再具体为IM的 NaOH水溶液；
[0050] f、离心取上清，记作上清1 ;
[0051] g、将上清1的pH值调回至7. 7 ;
[0052] 所述将上清1的pH值调回至7. 7时所用的试剂具体为HCl的水溶液，再具体为体 积百分含量为10%的HCl的水溶液；
[0053] h、离心取上清，记作上清2,即为所述镍离子亲和层析中所述步骤b中的所述沉淀 溶解后得到的上清；
[0054] 所述镍离子亲和层析和所述分子筛层析之间还包括将所述蛋白液1透析和浓缩 的步骤；
[0055] 所述浓缩为用IOkD的超滤管超滤浓缩。
[0056] 上述任一所述的方法中，所述人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所 示，其编码基因序列如SEQ ID No. 3所示。
[0057] 由上述任一所述的方法制备得到的人热休克蛋白gp96的scFv抗体也属于本发明 的保护范围。
[0058] 上述抗体在制备具有抗人热休克蛋白gp96的活性的产品中的应用也属于本发明 的保护范围；
[0059] 上述抗体在制备抑制癌细胞的生长或增殖、促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭或 转移或抑制肿瘤生长的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0060] 所述癌细胞具体为乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞或胃癌细胞；
[0061] 所述乳腺癌细胞具体为SKBr3细胞；
[0062] 所述肝癌细胞具体为SK-Ifep-I细胞；
[0063] 所述肺癌细胞具体为NCI-H460细胞；
[0064] 所述前列腺癌细胞具体为PC-3细胞；
[0065] 所述胃癌细胞具体为BGC-823细胞；
[0066] 所述肿瘤具体为乳腺肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤或肝肿瘤；
[0067] 或，
[0068] 上述抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0069] 所述癌为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌或肝癌。
[0070] 本发明提供的人热休克蛋白gp96的scFv抗体是将Comp肽段与gp96抗体重链可 变区在大肠杆菌中融合表达，所表达的融合蛋白在细菌体内自然形成的多聚体，该多聚体 蛋白经复性后大大增强了与癌细胞表面gp96蛋白的结合能力，从而达到抑制肿瘤的目的。
[0071] 本发明提供的人热休克蛋白gp96的scFv抗体具有抑制癌细胞的生长或增殖、诱 导癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭或转移、抑制肿瘤生长等作用，对于癌症的治疗具有重大价 值。

【专利附图】

【附图说明】
[0072] 图1为Superdex 200分子筛分离纯化结果。

【具体实施方式】
[0073] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0074] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0075] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0076] ATCC即美国模式培养物集存库（American type culture collection)的简写，网 址为 http: //www. atcc. org/。
[0077] .TCRB 即日本细胞库，网址为 http://cellbank. nibio. go. ip。
[0078] PBS 缓冲液的制备：将 8g NaCl、0. 2g KC1、3. 625g Na2HPO4.12H20、0. 24g KH2PO4溶 解在适量水中，并用水定容至1L，调pH为7. 3。
[0079] SKBr3细胞（又称SK-BR-3细胞，属于乳腺癌细胞）购自ATCC，ATCC编号为 HTB-30。
[0080] MDA-MB-231细胞（属于乳腺癌细胞）购自ATCC，ATCC编号为HTB-26。
[0081] SK-H印-1细胞（又称SK-HEP-I细胞，属于肝癌细胞）购自ATCC，ATCC编号为 HTB-52。
[0082] Bel-7402细胞（属于肝癌细胞）购自中国典型培养物保藏中心CCTCC，CCTCC编 号为⑶C0035。
[0083] NCI-H460细胞（属于肺癌细胞）购自ATCC，ATCC编号为HTB-177。
[0084] A549细胞（属于肺癌细胞）购自ATCC，ATCC编号为CCL-185。
[0085] PC-3细胞（属于前列腺癌细胞）购自ATCC，ATCC编号为CRL-1435。
[0086] DU-145细胞（又称DU 145,属于前列腺癌细胞）购自ATCC，ATCC编号为HTB-81。
[0087] BGC-823 细胞（属于胃癌细胞）在文献 "Wu XM，Shao XQ，Meng XX，Zhang XN，Zhu L, Liu SX, Lin J, Xiao HS. Genome-wide analysis of microRNA and mRNA expression signatures in hydroxycamptothecin-resistant gastric cancer cells.Acta Pharmacol Sin 2011 ;32:259-69. "中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0088] MNK-45细胞（又称MNK45细胞，属于胃癌细胞）购自JCRB，JCRB编号为JCRB0254。
[0089] pET28a(+)购自武汉华美生物工程有限公司，产品目录号为CSB-PL200040。
[0090] 大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技（北京）有限公司，产品目录号为 CB105-02。
[0091] Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒购自同仁化学研究所，货号为CK04-05。
[0092] Vybrant.? Apoptosis Assay kit 购自 Invitrogen 公司，产品目录号为 V13244。
[0093] BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0094] 实施例1、人热休克蛋白gp96的scFv抗体gp96-scFv_comp的制备
[0095] 一、pET28a-gp96-scFv_comp 载体的构建
[0096] 1、gp96-scFv_comp 基因的合成
[0097] 合成SEQ ID No. 1所示的DNA分子，SEQ ID No. 1所示的DNA分子自5'末端起第 1位至第6位为EcoR I酶切位点、第7位至第348位为gp96抗体重链可变区（gp96_scFv) 的编码基因序列、第349位至第357位为甘氨酸（3个）的编码基因序列、第358位至第366 位为NotI酶切位点、第367位至第510位为comp a螺旋编码基因序列、第511位至第519 位为甘氨酸（3个）的编码基因序列，第520位至第528位为XbaI酶切位点及保护性碱基。
[0098] 2、EcoR I和Xba I双酶切SEQ ID No. 1所示的DNA分子，得到基因片段；EcoR I 和Xba I双酶切pET28a(+)质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重 组质粒，将其命名为pET28a-gp96-scFv-comp，将pET28a-gp96-scFv-comp送测序，结果正 确。
[0099] 二、原核表达 gp96-scFv_comp 抗体
[0100] 利用大肠杆菌表达gp96-scFv-comp抗体蛋白，具体方法如下：
[0101] 1、将重组质粒pET28a-gp96-scFv-comp转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，从 平板上挑取单菌落接入含lOOmg/mL卡那霉素的2XYT培养基（胰蛋白胨16g，酵母提取物 l〇g，氯化钠5g，加水定容至IOOOmL)活化，得到活化液；取活化液接入2 X YT培养基，37°C 培养至OD6tltl值为0. 6-1. 0,然后加入IPTG (使其终浓度为lmmol/L)，37°C诱导4h，离心收集 菌体。
[0102] 2、菌体用PBS缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎（200W，破碎4s停6s，99次3个循 环），然后4°C 12000转/min离心20min，去上清，收集沉淀。
[0103] 3、用干净的玻璃棒轻轻刮去沉淀表层暗黄色的杂质。
[0104] 4、用IM的尿素溶液（由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水； 所述Na 2HPO4在所述IM的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述IM的尿素溶液中的 浓度为〇. 1M,所述尿素在所述IM的尿素溶液中的浓度为1M,所述IM的尿素溶液的pH为 7. 7)洗漆沉淀两遍，然后4°C 12000转/min离心20min,去上清，收集沉淀。
[0105] 5、用2M的尿素溶液（由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水； 所述Na 2HPO4在所述2M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述2M的尿素溶液中的 浓度为〇. 1M,所述尿素在所述2M的尿素溶液中的浓度为2M,所述2M的尿素溶液的pH为 7. 7)洗漆沉淀两遍，然后4°C 12000转/min离心20min,去上清，收集沉淀。
[0106] 6、用3M的尿素溶液（由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水； 所述Na2HPO4在所述3M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述3M的尿素溶液中的 浓度为〇. 1M,所述尿素在所述3M的尿素溶液中的浓度为3M,所述3M的尿素溶液的pH为 7. 7)洗漆沉淀两遍，然后4°C 12000转/min离心20min,去上清，收集沉淀。
[0107] 三、gp96-scFv_comp 抗体的纯化
[0108] 1、将步骤二收集的沉淀用8M的尿素溶液（溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶 剂为水；所述Na 2HPO4在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在8M的尿素溶液中的 浓度为0.5M，所述尿素在8M的尿素溶液中的浓度为8M，所述咪唑在8M的尿素溶液中的浓 度为20mM，8M的尿素溶液的pH为7. 7)溶解，得到蛋白溶液。
[0109] 2、加入IM的NaOH水溶液将蛋白溶液的pH值调至10. 0,室温下搅拌混匀10分钟。
[0110] 3、4°C 12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清1。
[0111] 4、加入体积百分含量10%的HCl水溶液将上清1的pH值调回至7. 7。
[0112] 5、4°C 12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清2。
[0113] 6、利用镍离子柱亲和层析法纯化上清2,步骤如下：
[0114] a、用8M的尿素溶液（溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na 2HPO4 在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在8M的尿素溶液中的浓度为0. 5M，所述尿素 在8M的尿素溶液中的浓度为8M，所述咪唑在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，8M的尿素溶 液的pH为7. 7)预平衡镍离子柱（至少3个柱体积，具体为3-5个柱体积）；
[0115] b、将上清2缓慢加入镍离子柱；
[0116] c、用8M的尿素溶液（溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水；所述Na 2HPO4 在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在8M的尿素溶液中的浓度为0. 5M，所述尿素 在8M的尿素溶液中的浓度为8M，所述咪唑在8M的尿素溶液中的浓度为20mM，8M的尿素溶 液的PH为7. 7)冲洗镍离子柱（至少5个柱体积，具体为5个柱体积）；
[0117] d、用60mM咪唑溶液（由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂 为水；Na 2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM，NaCl在所述60mM咪唑溶液中的浓度 为0. 5M，尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M，咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为 60mM，所述60mM咪唑溶液的pH为7. 7)冲洗镍离子柱（至少5个柱体积，具体为5个柱体 积）；
[0118] e、用500mM咪唑溶液（由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶 剂为水；Na 2HPO4在所述500mM咪唑溶液中的浓度为20mM，NaCl在所述500mM咪唑溶液中的 浓度为〇. 5M，尿素在所述500mM咪唑溶液中的浓度为8M，咪唑在所述500mM咪唑溶液中的 浓度为500mM，所述500mM咪唑溶液的pH为7. 7)(约3个柱体积）洗脱目的蛋白。
[0119] 7、将步骤6洗脱得到的目的蛋白溶液置于4°C PBS透析液中透析。
[0120] 8、透析后的蛋白溶液经IOkD规格的超滤管超滤浓缩至2mL，得到浓缩液。
[0121] 9、将浓缩液经Superdex 200分子筛分离纯化，步骤如下：
[0122] a、用pH7_7. 4 (具体为pH7. 4)的PBS溶液预平衡Superdex 200分子筛（至少2 个柱体积，具体为2个柱体积）；
[0123] b、用上样环将浓缩液加入分子筛中；
[0124] c、用pH7-7. 4(具体为pH7. 4)的PBS溶液冲洗分子筛，并在280nm处测定洗脱液 的吸收值，结果如图1中A所示；
[0125] d、在图IA中的多聚体蛋白主峰处（图IA中箭头所示）收集蛋白，蛋白经非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，将该多聚体命名为gp96-scFv-comp抗体。
[0126] 在上述Superdex 200分子筛分离纯化相同条件下建立各个已知分子量蛋白的洗 脱曲线，结果如图1中B所示，根据图1得到gp96-scFv-comp抗体的分子量为440kD-669kD。
[0127] gp96-scFv_comp抗体是由gp96-scFv_comp抗体单体在大肠杆菌中自动连接而成 的，这是Comp蛋白的特性。
[0128] 10、采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于_80°C。
[0129] gp96-scFv_comp抗体单体的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所不，SEQ ID No. 2中自 N端起第3位到第116位为gp96抗体重链可变区（gp96-scFv)氨基酸序列，第117位到第 119位为甘氨酸（三个）序列，第123位到第170位为comp a螺旋的氨基酸序列，第171位 至IJ 173位为甘氨酸（三个）序列。
[0130] gp96重链可变区（gp96_scFv)的⑶Rl的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中自N端起 第33位到第37位氨基酸所示，其编码基因序列如SEQ ID No. 1中自5'末端起第97位至 第111位核苷酸所示，⑶R2的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中自N端起第52位到第68位氨 基酸所示，其编码基因序列如SEQ ID No. 1中自5'末端起第154位至第204位核苷酸所示， ⑶R3的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中自N端起第101位到第105位氨基酸所示，其编码基 因序列如SEQ ID No. 1中自5'末端起第301位至第315位核苷酸所示。
[0131] 人热休克蛋白gp96的编码基因序列如SEQ ID No. 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0132] 实施例2、gp96-scFv_comp抗体对肿瘤细胞增殖的抑制
[0133] 通过Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒分别检测实施例1制备的 gp96-scFv-comp抗体对各种癌细胞（SKBr3细胞、SK-H印-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细 胞或BGC-823细胞）增殖的抑制作用。具体操作步骤如下 ：
[0134] 一、将浓度为50000个细胞/ml的各细胞液加入96孔板中，每种细胞设置24个复 孔，每孔加入0. Iml。
[0135] 二、分组处理
[0136] 实验组：待细胞贴壁后，向各细胞的12个孔中分别加入0. Iml浓度为lOOug/ml的 gp96-scFv-comp 抗体；
[0137] 对照组：待细胞贴壁后，向各细胞的另外12个孔中分别加入0. Iml PBS缓冲液；
[0138] 实验组和对照组的细胞均在37°C正常培养，从分组处理开始计时，分别在不同检 测时间点（〇,24,48,72小时）取各细胞的各组样本进行细胞增殖抑制率的检测，每次检测 取各细胞的各组的3个孔的样本。
[0139] 三、每孔样本加入CCK-8检测试剂（CCK-8试剂盒自带）10ul，37°C孵育2小时后测 定 490nm 的 OD 值，得到 0D49Qnm。
[0140] 细胞增殖抑制率=(对照组OD49tlmi值的平均值-实验组OD49tlmi值的平均值）/对 照组OD 49tlnm值的平均值X 100%。
[0141] 对照组OD49tlnm值的平均值即为对照组各检测时间点各个样本孔OD 49tol值的平均 值。
[0142] 实验组OD49tlnm值的平均值即为实验组各检测时间点各个样本孔OD 49tol值的平均 值。
[0143] 结果表明，72小时后，gp96-scFv-comp抗体对SKBr3细胞的增殖抑制率为60%， 对SK-Hep-I细胞的增殖抑制率为63 %，对NCI-H460细胞的增殖抑制率为57 %，对PC-3细 胞的增殖抑制率为62%，对BGC-823细胞的增殖抑制率为65%。
[0144] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp抗体能显著抑制SKBr3细胞、 SK-Ifep-I细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞和BGC-823细胞的增殖。
[0145] 实施例3、gp96-scFv_comp抗体对肿瘤细胞的诱导凋亡
[0146] 分别检测实施例1的gp96-scFv_comp抗体对各种癌细胞（SKBr3细胞、SK-Hep-I 细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞或BGC-823细胞）凋亡的促进作用。具体步骤如下：
[0147] 一、将各细胞液接种于6孔细胞培养板，每孔1ml，20万个细胞/孔。
[0148] 二、分组处理
[0149] 实验组（每种细胞设置3个复孔）：待细胞贴壁后，每孔加入0. Iml浓度为IOOug/ ml的gp96-scFv_comp抗体，37°C正常培养48小时；
[0150] 阴性对照组（每种细胞设置3个复孔）：待细胞贴壁后，每孔加入0. ImlPBS缓冲 液，37°C正常培养48小时。
[0151] 三、按照试剂盒Vybrant? Apoptosis Assay kit说明对各孔细胞染色后通过流 式细胞仪分析结果，具体操作步骤如下：
[0152] 1、用胰酶常规消化细胞，用PBS缓冲液洗细胞两遍。
[0153] 2、用 20ul I X Annexin V Buffer 将细胞轻轻悬起来，加入 Iul 的 FITC annexin V 后轻轻混匀，室温避光染色15分钟。
[0154] 3、向反应管中加入I XAnnexin V Buffer使终体积为200ul。
[0155] 4、加入浓度为lOOug/ml的PI，使其终浓度为lug/ml，室温避光染色3分钟左右即 可上机检测（凋亡率由流式细胞仪直接测出）。
[0156] 实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率的计算公式为：实验组细胞凋亡率-阴性 对照组细胞凋亡率。
[0157] 结果均取三个复孔的平均值。
[0158] 采用gp96-scFv_comp抗体诱导时：对于SKBr3细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为 3. 0%，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为50% ;对于SK-Hep-I细胞，阴性对照组 的细胞凋亡率为4. 3%，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为50% ;对于NCI-H460细 胞，阴性对照组的细胞凋亡率为5%，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为53% ;对于 PC-3细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为4. 7%，实验组比阴性对照组增加的细胞凋亡率为 54% ;对于BGC-823细胞，阴性对照组的细胞凋亡率为3. 6%，实验组比阴性对照组增加的 细胞凋亡率为49%。
[0159] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp抗体能明显促进SKBr3细胞、 SK-H印-1细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞和BGC-823细胞的凋亡。
[0160] 实施例4、gp96-scFv_comp抗体对肿瘤细胞侵袭的抑制
[0161 ] 分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对对各种癌细胞（SKBr3细胞、 SK-Ifep-I细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞或BGC-823细胞）侵袭作用的抑制效应。具体步 骤如下：
[0162] 一、将各细胞液接种于6孔细胞培养板，每孔1ml，20万个细胞/孔。
[0163] 实验组：六孔板中铺入各种癌细胞，待细胞贴壁后，每孔加入0. Iml浓度为IOOug/ ml的gp96-scFv_comp抗体，37°C正常培养48小时；
[0164] 阴性对照组：待细胞贴壁后，每孔加入0. ImlPBS缓冲液，37°C正常培养48小时。
[0165] 二、将 Matrigel Membrane Matrix (购自 Invitrogen)放入 4°C冰箱过夜融化，将 transwell、EP管和枪头过夜预冷。
[0166] 三、将Matrigel Membrane Matrix用预冷的PBS缓冲液以1:9的比例稀释后，在 每个transwell中加入80 u 1。
[0167] 四、37°C过夜，使 Matrigel Membrane Matrix 充分凝固。
[0168] 五、将各细胞消化、计数，用对应细胞的无血清的细胞培养基稀释成细胞悬液。
[0169] 六、在transwell的上部加入体积为IOOiil的IxlO5个细胞的各细胞悬液（含 100ug/ml 的 gp96-scFv_comp 抗体）。
[0170] 七、在transwell的下部加入600 ill含体积百分含量为10%的胎牛血清的对应细 胞的正常细胞培养基。
[0171] 八、将细胞置于37°C、5% CO2的培养箱中培养24-48小时（取决于各细胞周期和 侵袭能力）。
[0172] 九、将预冷的甘油和PBS缓冲液以体积比1:1的比例混合，加入DAPI，使其终浓度 达到I U g/mL，得到DAPI溶液。
[0173] 十、取出transwell，弃去上部培养基，用棉棒轻轻刮去Matrigel Membrane Matrix。
[0174] 十一、用镊子轻轻撕下transwell底部的膜，放入DAPI溶液中2分钟。
[0175] 十二、预冷的PBS缓冲液洗三遍。
[0176] 十三、封片。
[0177] 十四、显微镜下观察结果，随机选取5-10个视野计数。
[0178] 细胞侵袭抑制率=(对照组视野中细胞总数-实验组视野中细胞总数）/对照组 视野中细胞总数X 100%。
[0179] 采用gp96-scFv_comp抗体处理各种癌细胞，相对于阴性对照组，SKBr3细胞的 侵袭抑制率为60%，SK-Ifep-I细胞的侵袭抑制率为70%，NCI-H460细胞的侵袭抑制率为 63%，PC-3细胞的侵袭抑制率为67%，BGC-823细胞的侵袭抑制率为65%。
[0180] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp抗体能明显抑制SKBr3细胞、 SK-Ifep-I细胞、NCI-H460细胞、PC-3细胞和BGC-823细胞的侵袭能力。
[0181] 实施例5、gp96-scFv_comp抗体抑制乳腺肿瘤的生长
[0182] 分别检测实施例1的gp96-scFv_comp抗体对乳腺癌细胞（SKBr3细胞或 MDA-MB-231细胞）的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
[0183] -、将培养至对数生长期的乳腺癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万 SKBr3 细胞或 MDA-MB-231 细胞。
[0184] 二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3,将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进 行如下治疗处理：
[0185] gp96-scFv_comp抗体组（5只小鼠）：用gp96-scFv_comp抗体溶液（用PBS缓冲 液稀释）进行腹腔注射治疗，每次每只注射〇? 5ml (含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白）， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）；
[0186] 阴性对照组（5只小鼠）：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0. 5ml， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）。
[0187] 三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率（均计算该组的平 均值）。
[0188] 肿瘤抑制率的计算公式如下：（阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv_comp抗 体组小鼠的肿瘤重量）/阴性对照组小鼠的肿瘤重量X 100%。
[0189] 对于接种SKBr3细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1. 2g (p〈0. 01)， gp96-scFv-comp抗体对于接种SKBr3细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为74 % ;对于接种 MDA-MB-231细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为I. lg(p〈0. 01)，gp96-scFv-comp抗 体对于接种MDA-MB-231细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为77%。
[0190] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp抗体能有效抑制乳腺癌肿瘤生长。
[0191] 实施例6、gp96-scFv_comp抗体抑制肺癌肿瘤的生长
[0192] 分别检测实施例1的gp96-scFv_comp抗体对肺癌细胞（NCI-H460细胞或A549细 胞）的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
[0193] -、将培养至对数生长期的肺癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万 NCI-H460细胞或A549细胞。
[0194] 二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3,将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进 行如下治疗处理：
[0195] gp96-scFv_comp抗体组（5只小鼠）：用gp96-scFv_comp抗体溶液（用PBS缓冲 液稀释）进行腹腔注射治疗，每次每只注射〇? 5ml (含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白）， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）；
[0196] 阴性对照组（5只小鼠）：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0. 5ml， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）。
[0197] 三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率（均计算该组的平 均值）。
[0198] 肿瘤抑制率的计算公式如下：（阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv_comp抗 体组小鼠的肿瘤重量）/阴性对照组小鼠的肿瘤重量X 100%。
[0199] 对于接种NCI-H460细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为I. lg(p〈0. 01)， gp96-SCFv-C〇mp抗体对于接种NCI-H460细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为80% ;对于接种A549 细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为I. 3g(p〈0. 01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种 A549细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为77%。
[0200] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp抗体能有效抑制肺癌肿瘤生长。
[0201] 实施例7、gp96-scFv_comp抗体抑制前列腺癌肿瘤生长
[0202] 分别检测实施例1的gp96-SCFv-C〇mp抗体对前列腺癌细胞（PC-3细胞或DU-145 细胞）的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
[0203] -、将培养至对数生长期的前列腺癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万 PC-3细胞或DU-145细胞。
[0204] 二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3,将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进 行如下治疗处理：
[0205] gp96-scFv_comp抗体组（5只小鼠）：用gp96-scFv_comp抗体溶液（用PBS缓冲 液稀释）进行腹腔注射治疗，每次每只注射〇? 5ml (含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白）， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）；
[0206] 阴性对照组（5只小鼠）：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0. 5ml， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）。
[0207] 三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率（均计算该组的平 均值）。
[0208] 肿瘤抑制率的计算公式如下：（阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv_comp抗 体组小鼠的肿瘤重量）/阴性对照组小鼠的肿瘤重量X 100%。
[0209] 对于接种PC-3细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为I. 4g (p〈0. 01)， gp96-scFv-comp抗体对于接种PC-3细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为75% ;对于接种DU-145 细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为L 2g(p〈0. 01)，gp96-scFv-comp抗体对于接种 DU-145细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为91%。
[0210] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp能有效抑制前列腺癌肿瘤生长。
[0211] 实施例8、gp96-scFv_comp抗体抑制胃癌肿瘤生长
[0212] 分别检测实施例1的gp96-scFv-comp抗体对胃癌细胞（BGC-823细胞或MNK-45 细胞）的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
[0213] 一、将培养至对数生长期的胃癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万 BGC-823细胞或MNK-45细胞。
[0214] 二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3,将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进 行如下治疗处理：
[0215] gp96-scFv_comp抗体组（5只小鼠）：用gp96-scFv_comp抗体溶液（用PBS缓冲 液稀释）进行腹腔注射治疗，每次每只注射〇? 5ml (含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白）， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）；
[0216] 阴性对照组（5只小鼠）：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0. 5ml， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）。
[0217] 三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率（均计算该组的平 均值）。
[0218] 肿瘤抑制率的计算公式如下：（阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv_comp抗 体组小鼠的肿瘤重量）/阴性对照组小鼠的肿瘤重量X 100%。
[0219] 对于接种MNK-45细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为1.2g(p〈0. 01)， gp96-scFv-comp抗体对于接种MNK-45细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为74 %;对于接种BGC-823 细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为I. 4g(p〈0. 01)，gp96-scFv_comp抗体对于接种 BGC-823细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为82%。
[0220] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp抗体能有效抑制胃癌肿瘤生长。
[0221] 实施例9、gp96-scFv_comp抗体抑制肝癌肿瘤生长
[0222] 分别检测实施例1的gp96-scFv_comp抗体对肝癌细胞（SK-Hep-I细胞或 Bel-7402细胞）的移植瘤生长的抑制作用。具体步骤如下：
[0223] -、将培养至对数生长期的肝癌细胞皮下接种BALB/c裸鼠，每只接种500万 SK-H印-1细胞或Bel-7402细胞。
[0224] 二、7-14天后，待小鼠肿瘤长至100mm3,将形成肿瘤的小鼠随机分成两组，分别进 行如下治疗处理：
[0225] gp96-scFv_comp抗体组（5只小鼠）：用gp96-scFv_comp抗体溶液（用PBS缓冲 液稀释）进行腹腔注射治疗，每次每只注射〇? 5ml (含200ug gp96-scFv-comp抗体蛋白）， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）；
[0226] 阴性对照组（5只小鼠）：用PBS缓冲液进行腹腔注射治疗，每次每只注射0. 5ml， 每周治疗两次（分别于该周的第二天和第五天）。
[0227] 三、连续治疗5周后处死裸鼠，称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率（均计算该组的平 均值）。
[0228] 肿瘤抑制率的计算公式如下：（阴性对照组小鼠的肿瘤重量-gp96-scFv_comp抗 体组小鼠的肿瘤重量）/阴性对照组小鼠的肿瘤重量X 100%。
[0229] 对于接种SK-Ifep-I细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为I. 4g(p〈0. 01)， gp96-scFv-comp抗体对于接种SK-Hep-I细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为70% ;对于接种 Bel-7402细胞的裸鼠，阴性对照组小鼠的肿瘤重量为I. 3g(p〈0. 01)，gp96-scFv_comp抗体 对于接种Bel-7402细胞的裸鼠的肿瘤抑制率为73%。
[0230] 实验证明，实施例1制备的gp96-scFv_comp抗体能有效抑制肝癌肿瘤生长。
【权利要求】
1. 一种制备人热休克蛋白gp96的scFv抗体的方法，是将gp96抗体的重链可变区和 comp a螺旋在原核细胞中进行融合表达得到融合蛋白； 所述gp96抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中自N端起第3位至第116 位所示； 所述comp a螺旋的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中自N端起第123位至第170位所示； 所述融合蛋白为由含有gp96抗体的重链可变区和comp a螺旋的抗体单体在所述原核 细胞中自动组装形成的多聚体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述gp96抗体的重链可变区和所述 comp a螺旋分别在所述含有gp96抗体的重链可变区和comp a螺旋的抗体单体中的N端和 C端。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合表达的方法是将5' -3'方 向依次含有gp96抗体的重链可变区编码基因和comp a螺旋编码基因的DNA片段导入所述 原核细胞中。
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述gp96抗体的重链可变区编码 基因如SEQ ID No. 1中自5'末端起第7位至第348位核苷酸所示； 所述comp a螺旋编码基因如SEQ ID No. 1中自5'末端起第367位至第510位核苷酸 所示。
5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述5'-3'方向依次含有gp96抗 体的重链可变区编码基因和comp a螺旋编码基因的DNA片段如SEQ ID No. 1所示； 所述含有gp96抗体的重链可变区和comp a螺旋的抗体单体的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述DNA片段是通过重组表达载体导入所述原核细胞中的，所述重组表达载体具体是 将SEQ ID No. 1所示的DNA分子插入pET28a(+)质粒EcoR I和Xba I酶切位点间得到的； 所述原核细胞为大肠杆菌。
6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述表达之后还包括细胞裂解、离 心收集沉淀并将沉淀进行层析分离的步骤。
7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述层析分离包括镍离子亲和层 析和分子筛层析； 所述镍离子亲和层析的步骤如下： a、 用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱； b、 将所述离心收集的沉淀溶解后得到的上清加入镍离子柱； c、 用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去非特异性结合的蛋白； d、 用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白； 所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水； 所述Na2HP04在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述60mM咪唑溶液中的 浓度为〇. 5M，所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M，所述咪唑在所述60mM咪唑溶 液中的浓度为60mM，所述60mM咪唑溶液的pH为7. 7 ; e、 用500mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，记作蛋白液1 ; 所述500mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水； 所述Na2HP04在所述500mM咪唑溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述500mM咪唑溶液中 的浓度为〇. 5M，所述尿素在所述500mM咪唑溶液中的浓度为8M，所述咪唑在所述500mM咪 唑溶液中的浓度为500mM，所述500mM咪唑溶液的pH为7. 7 ; 所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水； 所述Na2HP04在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的 浓度为〇. 5M,所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述8M的尿素溶 液中的浓度为20mM，所述8M的尿素溶液的pH为7. 7 ; 所述分子筛层析具体为Superdex 200分子筛层析； 所述Superdex 200分子筛层析的步骤如下： a、 用pH7-7. 4的PBS溶液预平衡Superdex 200分子筛至少2个柱体积； b、 将蛋白液1加入分子筛； c、 用pH7-7. 4的PBS溶液冲洗分子筛，收集洗脱液，在280nm处测定洗脱液的吸收值， 收集分子量为440kD-669kD的洗脱峰，即为所述人热休克蛋白gp96的scFv抗体。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述离心收集沉淀和所述将沉淀 进行层析分离之间还包括如下洗涤和调pH的步骤： a、 用1M的尿素溶液洗涤所述离心收集的沉淀，离心收集沉淀，记作沉淀1 ; 所述1M的尿素溶液由溶剂和溶质组成,溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水；所述 Na2HP04在所述1M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述1M的尿素溶液中的浓度 为0. 1M,所述尿素在所述1M的尿素溶液中的浓度为1M,所述1M的尿素溶液的pH为7. 7 ; b、 用2M的尿素溶液洗涤沉淀1，离心收集沉淀，记作沉淀2 ; 所述2M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水；所述 Na2HP04在所述2M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述2M的尿素溶液中的浓度 为0. 1M,所述尿素在所述2M的尿素溶液中的浓度为2M,所述2M的尿素溶液的pH为7. 7 ; c、 用3M的尿素溶液洗涤沉淀2,离心收集沉淀，记作沉淀3 ; 所述3M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl和尿素，溶剂为水；所述 Na2HP04在所述3M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述3M的尿素溶液中的浓度 为0. 1M,所述尿素在所述3M的尿素溶液中的浓度为3M,所述3M的尿素溶液的pH为7. 7 ; d、 将沉淀3用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液； 所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶质为Na2HP04、NaCl、尿素和咪唑，溶剂为水； 所述Na2HP04在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的 浓度为〇. 5M,所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M,所述咪唑在所述8M的尿素溶 液中的浓度为20mM，所述8M的尿素溶液的pH为7. 7 ; e、 将步骤d得到的蛋白溶液pH值调至10. 0 ; f、 离心取上清，记作上清1 ; g、 将上清1的pH值调回至7.7 ; h、 离心取上清，记作上清2,即为所述镍离子亲和层析中所述步骤b中的所述沉淀溶解 后得到的上清； 所述镍离子亲和层析和所述分子筛层析之间还包括将所述蛋白液1透析和浓缩的步 骤。
9. 由权利要求1-8任一所述的方法制备得到的人热休克蛋白gp96的scFv抗体。
10. 权利要求9所述的抗体在制备具有抗人热休克蛋白gp96的活性的产品中的应用； 权利要求9所述的抗体在制备抑制癌细胞的生长或增殖、促进癌细胞凋亡、抑制癌细 胞侵袭或转移或抑制肿瘤生长的产品中的应用； 所述癌细胞具体为乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞或胃癌细胞； 所述肿瘤具体为乳腺肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤或肝肿瘤； 或， 权利要求9所述的抗体在制备预防和/或治疗癌症的产品中的应用； 所述癌具体为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌或肝癌。
【文档编号】C07K1/22GK104356233SQ201410535278
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】孟颂东, 侯军委, 桂明明, 赵报, 陈立钊 申请人:中国科学院微生物研究所