肺癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用的制作方法

肺癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一类与热休克蛋白结合的肺癌抗原，包括IMP-3抗原肽、MAGE-A3抗原肽。本发明同时还提供了抗原与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和HSP78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这种复合物可用于制备治疗肺癌的治疗性疫苗。
【专利说明】肺癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及肺癌抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的 复合物以及它们的用途。

【背景技术】
[0002] 肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。我国2012年肺癌发病率为 53. 6/10万，占肿瘤总发病率的18% ;死亡率为45. 6/10万，占肿瘤总死亡率的20%，已居常 见肿瘤之首。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌的80? 85%，而其中1/3初次确诊时已为局部晚期。非小细胞肺癌根治术后5年生存率约为25%。 晚期NSCLC如不经治疗，中位生存期（median survival times, MST)约为4?5个月，1 年生存率< 10%。
[0003] 晚期NSCLC患者标准的一线治疗方案是钼类药物联合第三代化疗药物，但其客观 有效率仅约为30%，MST仅为8?9个月，1年生存率仅为30%?40%。临床试验已证实，术 后辅助化疗可显著降低疾病复发率并使生存期明显延长。但由于化疗不可能杀灭体内全部 癌细胞，癌症是否复发最终取决于机体自身的自稳功能和免疫功能。而化疗给机体带来的 毒副作用、对机体免疫功能的打击远比化疗杀灭部分癌细胞给机体带来的益处要大得多。
[0004] 近年来新兴的靶向治疗药物通过特异性的靶向对肿瘤生长重要的信号通路抑制 肿瘤生长，具有高效低毒的特点。然而祀向药物治疗肺癌的疗效和治疗范围上都有一定的 局限性，同时也存在易发生耐药性、价格昂贵的问题。
[0005] 近年来肿瘤的治疗已取得长足进步，在现代分子生物学飞速发展的推动下免疫治 疗日益受到重视，显示出良好的应用前景，成为肿瘤治疗的新模式。gp96自体免疫作为个体 化、主动免疫治疗，国外临床已证实其治疗肿瘤的安全性及有效性，我们的临床试验也证实 自体gp96激活患者肺癌特异性CTL的能力，自体gp96免疫可能会是肺癌治疗的一个新的 有效方法。
[0006] gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员。热休克蛋白（Heat Shock Protein, HSP)是一类高度保守，广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。gp96蛋白在正常组织和 肿瘤中均有广泛表达，主要定位于内质网腔（Endoplasmic Reticulum)。正常情况下gp96 在细胞中呈低水平表达，但热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等均可诱导其表达增加。 gp96作为分子伴侣，可阻止蛋白质聚集，协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运，抑制错折叠蛋 白质的分泌。gp96分子具有结合多肽的能力，能结合5-25个氨基酸的多肽序列。
[0007] 热休克蛋白HSP78是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子 作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合。
[0008] 近年来的研究发现，HSP结合的短肽决定了 HSP复合物的抗原性。HSP将结合的短 肽呈递给MHC I类分子，激活特异性和记忆性T细胞，引发机体细胞免疫反应。gp96还可 以活化树突细胞（DC)促进MHC I类和MHC II类分子以及共刺激因子的表达，从而提高免 疫反应。因此gp96能够有效的递呈所结合的多肽，高效的激活肽特异性的CTL反应。这种 gp96-多肽的复合物和HSP78-多肽复合物可用于防治自体肿瘤和某些传染性疾病。
[0009]目前已证实gp96和HSP78分子能结合多种抗原多肽，包括泡状口炎病毒抗原区 肽、鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。 但目前为止未见从肺癌肿瘤组织中分离鉴定与HSP结合的抗原多肽。
[0010] 肺癌是目前最为严重的恶性肿瘤。尽管放化疗、靶向治疗取得很大的进展，1年生 存率提高到50%，但由于肿瘤的个性化，耐药性，肺癌的中位生存期在1年左右。肺癌从总体 上仍然不能治愈。已有的自体gp96复合物免疫治疗临床试验也表明肿瘤组织大小的要求 和疫苗制备的一次性是该方法推广的一个限制因素。
[0011]


【发明内容】

[0012] 因此，本发明要解决的技术问题是筛选肺癌特异性的肽段。克服肿瘤细胞免疫编 辑导致的低免疫原性，能够在健康个体及肺癌患者诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞 (又称杀伤性T细胞，CTL)杀伤肺癌细胞，对正常细胞及组织无破坏作用，产生很强的抗肺 癌效应。
[0013] 本发明的一个目的是提供一种与gp96和HSP78结合的肺癌抗原的复合物。所述 的肺癌抗原可以分别是肺癌肿瘤抗原頂P-3蛋白上第62-70位的氨基酸序列，其序列可以 是ELHGKPIEV，或其变异序列；肺癌肿瘤抗原MP-3蛋白上第357-365位的氨基酸序列，其 序列可以是SMNLQAHLI，或其变异序列；肺癌肿瘤抗原MP-3蛋白上第210-218位的氨基酸 序列，其序列可以是IIGKEGATI，或其变异序列；肺癌肿瘤抗原MP-3蛋白上第138-146位 的氨基酸序列，其序列可以是KLNGFQLEN，或其变异序列；肺癌肿瘤抗原MAGE-A3蛋白上第 15-23位的氨基酸序列，其序列可以是GLEARGEAL，或其变异序列；肺癌肿瘤抗原MAGE-A3蛋 白上第141-149位的氨基酸序列，其序列可以是GNWQYFFPV，或其变异序列。
[0014] 本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合，又包括热休克蛋白以 共价键与多肽结合。本发明提供了制备本发明的如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和 HSP78的复合物的方法。
[0015] 附图简要说明 图1以9肽和gp96-9肽复合物（0、1、3周）免疫小鼠BALB/c (HLA-A2+)后引发的特异 性CTL反应。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准51Cr释放测定，效 应细胞与靶细胞之比分别是1〇、25、50和100,图中裂解率为10只小鼠平均值。
[0016] 图2 PC-9细胞荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线。裸鼠皮下接种人肺癌细胞PC-9,荷瘤7 天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。肽段1组（n=20)的接受经过gp96-肽段1复合 物免疫的BALB/c (HLA-A2+)小鼠的脾脏淋巴细胞；无关肽组（n=20)接受经过gp96-无关肽 (HBcAg82_ 9CI)复合物免疫的BALB/c (HLA-A2+)小鼠的脾脏淋巴细胞。
[0017] 图3肺癌患者免疫自体肿瘤gp96复合物后9肽特异性T细胞的变化。以IFN- γ 的ELISP0T方法检测患者外周血中9肽特异性T细胞。无关肽HBcAg82_9(l肽为阴性对照。
[0018]

【具体实施方式】： 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0019] 实施例I.从肺组织中纯化gp96蛋白 将五份神肺癌组织和一份肺正常组织匀浆后离心，用30%/70%饱和度（NH4)2SO 3沉淀， 沉淀溶解后采用ConA Sepharose (GE公司）进行植物凝集素亲和纯化，用10%的α -甲基 葡萄糖苷洗脱结合的蛋白，糖苷洗脱液以Hitrap-Q阴离子交换柱（GE Healthcare Life Science)进行精细纯化，经过这三步纯化获得>95%纯度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/ grp94单克隆抗体（Santa Cruz公司）进行Western鉴定。其纯度用SDS-PAGE、银染和反 相HPLC鉴定。
[0020] 实施例2.从gp96蛋白释放非共价结合的多肽 将纯化的gp96蛋白加入三氟乙酸（TFA)使其终浓度达到0. 2% (pH约2. 0)，然后用超 滤法（截留分子量为30kDa，Millipore公司）分离多肽，将多肽混合物进行MALDI-T0F质 谱（ABI 4700)分析，多肽分子量大多在600-1100 Da之间。
[0021] 实施例3.反相HPLC分析多肽 多肽混合物冻干后溶于溶液A (0.065% TFA，2%乙腈)，上样于C18反相柱（S^hasil p印tide C18 ;5 um 粒度；4. 6 X 250 mm，GE 公司），从 0 至 65% 溶液 B (0· 05% TFA，100% 乙 腈）进行梯度洗脱，流速为I mL/min，用214nm波长检测。比较肿瘤组织和正常组织HPLC 图谱，发现一个五份肺癌肿瘤组织共有而正常组织中没有的肽峰。
[0022] 实施例4.多肽微量测序与序列分析 收集该特异肽峰，用MALDI-T0F质谱（PE公司Voyager-DE系统）鉴定其纯度，只发现 分子量为1021 Da的单一峰。对该肽微量测序（ABI，Pr〇ciSe 491蛋白测序仪），其氨基酸 序列为"ELHGKPIEV"，5份肿瘤组织得到的序列一致。将该序列在网上蛋白数据库（NCBI)查 询，发现它位于頂P-3蛋白的62-70位。
[0023] 实施例5. gp96蛋白与人工合成的多肽体外快速组装 人工合成9肽"ELHGKPIEV"（委托吉尔生化有限公司合成)，将gp96蛋白与多肽进行体 外组装，体外结合反应体系： 2.7 mmol/L KC1,1.47 mmol/L KH2PO4,8. I mmol/L Na2HPO4,138 mmol/L NaCl,l〇%(V/ V)甘油，3.0 mol/L 9肽，0.421 mmol/L gp96蛋白，60°C反应10分钟，超滤法（分子截留 30 KDa，Millipore公司）去除未结合的多肽。
[0024] 实施例6毕赤酵母系统中分泌表达肺癌肿瘤抗原肽1和热休克蛋白gp96的融合 蛋白 本实例提供了抗原肽I (ELHGKPIEV)与热休克蛋白gp96以共价键形成的融合蛋白的 方法。我们对对应于该肽的核酸序列做了针对毕赤酵母表达的优化，并人工合成了该序列（ GAA TTG CAT GGT AAA CCA ATT GAA GTT)，引入限制性酶切位点Bgl II将该9肽的核 酸序列与已针对毕赤酵母偏好密码子优化的人gp96基因5'端用T4连接酶连接，连接产物 的5'和3'端引入2个限制性酶切位点EcoR I和Xho I，连接到表达载体pPICZaA中在毕 赤酵母中分泌表达，表达产物是gp96与该9肽的融合蛋白。
[0025] 实施例7.免疫小鼠 选用生长8-10周的HLA-A2转基因的BALB/c小鼠（HLA-A2+)用于本实验。
[0026] 免疫方式采用将样品溶于100 UL的PBS中颈背皮下注射。皮下注射操作相对简 单，要求免疫剂量适中，故采用该种免疫方式。同时在每次免疫前1天腹腔注射0.4 mg的 环磷酰胺。低剂量环磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg细胞从而能增强免 疫效果。
[0027] gp96蛋白-9肽复合物的最适免疫剂量为0. I nmol。
[0028] 免疫时间为0、1、3周进行三次的强化免疫，优于免疫一次或二次的效果。
[0029] 因此采用皮下注射免疫，将9肽溶于缓冲液（90% PBS 10% DMSO 0. 1% TFA)， gp96-肽1复合物溶于PBS中，注射前剧烈振荡1分钟，每只小鼠免疫剂量肽段1分别为1 nmol和10 nmol，将肽与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠。gp96-肽段1复合物免疫剂量分别是 0.05 nmol，0. 10 nmol和0.50 nmol，采用颈背皮下注射，第一次免疫1周后进行第二次免 疫，2周后加强免疫，3天后进行细胞毒性分析。每一处理使用10只小鼠。
[0030] 实施例8.细胞毒性分析 小鼠加强免疫3天后，从每只小鼠收获得约3 X IO7脾细胞悬于含有10 mM HEPES缓冲 液，抗生素和10% (V/V) FCS培养液中，于培养瓶中与经幅射（4500 Rad)的T2细胞（3:1)和 I ug/mL肽在完全培养基中37°C培养。6天后收集脾细胞进行4小时标准51Cr释放实验（具 体方法见Kuhrober, A, et al. 1997. International Immunology, 9 (8) :1203-1212)测 定细胞毒性活性。简而言之，靶细胞用10ug/mL肽于37°C致敏30分钟后加入不同数量的 效应细胞，反应体系为100 uL的完全培养基。37°C共培养4小时后收集上清测定特异裂解 率。
[0031] 从51Cr释放实验可以看出gp96-肽1复合物和单独的肽段1均可刺激小鼠产生特 异性细胞毒性T细胞，但gp96复合物的免疫效果使单独9肽的100倍以上。每只小鼠免疫 0. I nmol (约IOug)的gp96-肽1复合物即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒 性测定靶细胞的裂解率在60%以上，且环磷酰胺的预处理可以进一步增强这种细胞毒效应 (图1)。实验结果表明gp96-肽1复合物可开发成为一种新型肺癌的治疗药物。
[0032] 实施例9.细胞转输体内抑瘤实验 用HLA-A2阳性人肺癌细胞PC-9皮下注射裸鼠。7天后转输从gp96-肺癌抗原9肽1 复合物免疫HLA-A2转基因小鼠获得的脾脏淋巴细胞（n=20)、gp96-无关肽复合物免疫小鼠 淋巴细胞（n=20)，每周转输一次，共3周。检测肿瘤大小可以发现只有转输gp96-肺癌抗原 9肽1复合物免疫小鼠的淋巴细胞可明显抑制肺癌细胞的生长（图2)。
[0033] 实施例10.肺癌患者免疫自体gp96复合物治疗肿瘤 肺癌患者术后接受gp96治疗及医生常规治疗(放化疗)。
[0034] 操作流程 选取计划行手术的II、III A期肺癌患者； 获得患者自愿签署的"知情同意书"以及"手术同意书"； 行术前全面检查以明确根治性手术可行性； 手术切取肿瘤组织； a) 将组织存放于无菌管中； b) 存有肿瘤组织的无菌管在〇°C条件下于2个小时内送至GMP制备车间。
[0035] 鉴定肿瘤组织质量，确认可以提取足量的热休克蛋白gp96_多肽复合物； 热休克蛋白gp96-多肽复合物提取及检测； gp96治疗及常规治疗； 热休克蛋白gp96-多肽复合物皮下注射流程： a)第1次注射前3天内需检查血常规、血生化及心电图。
[0036] b)注射预处理：每次gp96注射前1-3天给患者静脉注射环磷酰胺。
[0037] c)由研究护士进行gp96蛋白注射，根据既往国外研究资料制定剂量，加入生理盐 水进行稀释，混匀后上臂及大腿左右皮下注射，每周1次。
[0038] d)第1、2次免疫蛋白注射后，需留院观察24小时，后几次注射后需观察1小时，无 不良反应后方可离开。
[0039] e)第2次及第8次注射后3天内需检查血常规、血生化及心电图。
[0040] f)免疫治疗前及免疫结束后,采集IOml患者血液,进行免疫学指标的测定。
[0041] 1若患者治疗期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊 疗规范给予相应治疗； 随访； 术后2年内每3月访视1次，2年后每6月访视1次，直至患者疾病复发或死亡，具体访 视内容如下： ①2年内每3个月复查1次： a)第3、9、15、21月复查内容： 肿瘤标志物（CA19-9、CEA、CA125); 胸部CT、腹部B超。
[0042] b)第 6、12、18、24 月复查内容： 肿瘤标志物（CA19-9、CEA、CA125); 胸部CT、腹部B超； 头颅CT、骨扫描（ECT)。
[0043] ②2年后每6个月复查1次，复查内容： 肿瘤标志物（CA19-9、CEA、CA125); 胸部CT、腹部B超； 头颅CT、骨扫描（ECT)。
[0044] 若患者随访期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊 疗规范(如NCCN指南等）给予相应治疗。
[0045] 实施例11. ELISP0T法检测特异性T细胞 ELISP0T检测肺癌患者PBMC中表位特异性CTL。按照ELISP0T试剂盒的说明书操作。 先用含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基封闭ELISP0T预包被板一小时，临用前倒掉封闭 液，加入IOOuL含I X IO5的人的PBMC (直接用新鲜的PBMC或者将PBMC体外扩增培养7 天)。实验组中加入10ug/mL的9肽1、阳性对照加入4ug/mL的PHA进行刺激，阴性对照加 入无关肽（HBcAg 82_9CI)。在细胞培养箱内培养18小时后，检测特异性斑点的形成，并进行统 计分析。我们选取HLA-A2阳性的肺癌患者作为研究组，通过ELISP0T方法检测患者新鲜血 液中表位特异性CTL，特异性CTL的频率通过计数斑点数量来确定。在4例经自体gp96复 合物免疫的HLA-A2阳性肺癌患者中均检测到高频率的ELHGKPIEV特异性CTL，且比免疫前 有显著的提高，同时并没有检测到无关肽HBcAg 82_9(l(阴性对照)特异性T细胞，说明ELISP0T 结果是表位特异的（图3)。
[0046] 实施例12.其它gp96-多肽复合物的免疫活性测定 除上述抗原9肽1之外，我们又选取其它5个肺癌抗原多肽与gp96体外组装并测 定其免疫活性，这5个抗原多肽分别是DSMNLQAHLI，2) IIGKEGATI，3) KLNGFQLEN，4) GLEARGEAL，5) GNWQYFFPV。
[0047] 分别人工合成这5种多肽，采用实施例7中所述的反应体系在体外与gp96结合， 这5种多肽与gp96均有较高的亲和力，通过测定结合反应平衡常数K，5种肽与gp96结合 反应中K值均在4. 5以上。采用实施例5中所述的方法用上述5种肺癌抗原多肽与gp96 形成的复合物，和上述gp96与5种肺癌抗原多肽的融合蛋白分别免疫小鼠，并采用实施例 7中所述的方法分别对这5种复合物进行CTL分析，从 51Cr释放实验可以看出这5种肺癌 抗原多肽与gp96形成的复合物均可刺激HLA-A2转基因小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，5 种多肽与gp96形成的复合物的免疫活性比单独多肽高120-200倍。每只小鼠免疫剂量为 0. I nmol (约IOug)时即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，通过对这5种多肽与gp96 形成的复合物的细胞毒性测定发现靶细胞的裂解率在50%-65%之间。
[0048] 以上实验结果表明gp96与肺癌抗原多肽体外组装合成的复合物可开发成为一种 新型肺癌的治疗药物。由于实验条件所限本发明专利不可能做到对每一种肺癌相关多肽进 行活性测定，但我们通过选取6种有代表性的肺癌抗原肽作研究对象，在体外与gp96结合 并进行免疫活性测定，大量实验表明gp96与这些抗原多肽形成的复合物均能刺激小鼠产 生强烈的免疫反应，gp96作为抗原多肽的新型良好佐剂，可开发成为一种新型治疗疫苗。因 此，除上述6种抗原多肽之外，其它任何肺癌抗原多肽与gp96结合作为新型疫苗也应当在 本发明的保护范围之内。
[0049] 实施例13. HSP78-多肽免疫原性测定 将HSP78与6种多肽体外组装形成的复合物，反应体系同gp96 (见实施例5)，将体外合 成的复合物和HSP78与6种多肽的融合蛋白（实施例6)免疫小鼠。小鼠免疫方式、免疫剂量 以及免疫程序同gp96 (见实施例7)细胞毒性（CTL)分析方法同gp96(见实施例8)。从51Cr 释放实验可以看出HSP78-肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，HSP78-肽复合 物的免疫原性为单独抗原肽的100倍以上，每只小鼠免疫0.1 nmol (约IOug)即能诱发机 体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在50%以上。实验表明HSP78-9 肽复合物可开发成为一种新型肺癌的治疗药物。
【权利要求】
1. 一种与热休克蛋白结合的表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。
2. -种与热休克蛋白结合的表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。
3. -种与热休克蛋白结合的表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。
4. 一种与热休克蛋白结合的表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示。
5. -种与热休克蛋白结合的表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 5所示。
6. -种与热休克蛋白结合的表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
7. 如权利要求1-6任一项所述的表位肽与gp96或HSP78的共价或非共价连接的复合 物。
8. 如权利要求1-6任一项所述的表位肽在体外单独或与热休克蛋白形成如权利要求7 所述的复合物单独或共同免疫人体诱导生成杀伤性T细胞中用途。
9. 如权利要8所述的免疫诱导杀伤性T细胞在预防或治疗肺癌中的用途。
【文档编号】A61P37/04GK104211771SQ201310693122
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】黄锡坚, 张小俊 申请人:深圳市康尔诺生物技术有限公司