一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法

一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法。本发明公开的具有交叉保护作用的流感病毒疫苗，由普通流感疫苗与热休克蛋白gp96组成。本发明公开的以gp96作为天然佐剂的流感病毒通用疫苗具有以下功能特征和效果：1、流感病毒通用疫苗可有效激活流感病毒特异性CTL和Th1型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。2、流感病毒通用疫苗引发抗病毒的T细胞免疫应答对异型流感病毒具有交叉保护作用。
【专利说明】一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]流感病毒的抗原性易发生变异并且可跨种间传播，其中以甲型流感病毒最为重要。由于病毒毒株变异快，一旦有新的流感病毒亚型出现，人群普遍对其缺乏免疫力，容易引起大流行。流感引起的大流行发病率和死亡率很高，尤其是对儿童和老年人。目前唯一可行的预防措施是疫苗接种，市场上应用的疫苗主要是全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗，这些疫苗主要针对血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminic acid, NA)产生特异性抗体。但是流感病毒血清型众多，现有疫苗在各个血清型之间的交叉保护能力较差，致使流感疫苗缺乏对新型流感疫苗的交叉保护功能，新型流感病毒的出现容易引起大面积的人群感染甚至社会恐慌，因此每年人群都需要接种流感疫苗。
[0003]甲型HlNl流感病毒裂解疫苗为全病毒裂解苗，其T细胞免疫活性很低，因此开发具有交叉保护能力的流感病毒通用疫苗具有重要的科学价值和社会意义。
[0004]热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)存在于细胞衆和内质网膜内，由HSP60,HSP70, HSP90和gp96等多个成员组成。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种具有广谱交叉保护能力的流感通用疫苗及其制备方法。
[0006]本发明所提供的一种具有交叉保护作用的流感疫苗，由普通流感疫苗与热休克蛋白gp96组成。
[0007]所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为1:4一1:400。
[0008]所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为3:400。
[0009]所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗为用流感病毒制成的疫苗。
[0010]所述流感疫苗中，所述用流感病毒制成的疫苗为流感病毒的裂解疫苗或流感病毒的全病毒灭活疫苗。
[0011]所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗为未含有热休克蛋白gp96的流感疫苗。
[0012]所述流感疫苗中，所述流感病毒为甲型HlNl流感病毒。
[0013]所述流感疫苗中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
[0014]所述流感疫苗中，所述普通流感疫苗为猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗、甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933 (HlNl)的全病毒灭活疫苗或甲型HlNl人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(HlNl)的全病毒灭活疫苗。
[0015]所述流感疫苗中，所述交叉保护作用是指该疫苗既能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，还能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。[0016]所述流感疫苗中，所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种:人、猪和禽。
[0017]本发明所提供的制备具有交叉保护作用的流感疫苗的方法，包括如下步骤:将普通流感疫苗和热休克蛋白gp96混合，得到具有交叉保护作用的流感疫苗。
[0018]所述制备方法中，所述的交叉保护作用是指疫苗既能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，又能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
[0019]所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种:人、猪和禽。
[0020]所述制备方法中，普通流感疫苗与热休克蛋白gp96的质量比为1:4一 1:400，具体可为3:400。
[0021]所述制备方法中，所述普通流感疫苗为用流感病毒制成的疫苗。
[0022]所述制备方法中，所述用流感病毒制成的疫苗为流感病毒的裂解疫苗或流感病毒的全病毒灭活疫苗。
[0023]所述制备方法中，所述普通流感疫苗为未含有热休克蛋白gp96的流感疫苗。
[0024]所述制备方法中，所述流感病毒为甲型HlNl流感病毒。
[0025]所述制备方法中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
[0026]所述制备方法中，所述普通流感疫苗为猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗、甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933 (HlNl)的全病毒灭活疫苗或甲型HlNl人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(HlNl)的全病毒灭活疫苗。
[0027]所述的流感疫苗在制备具有交叉保护作用的预防和/或治疗流感的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0028]上述应用中，所述交叉保护作用是指该产品既能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，又能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
[0029]上述应用中，所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种:人、猪和禽。
[0030]上述应用中，所述流感是由流感病毒引起的。
[0031]上述应用中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
[0032]上述应用中，所述人流感病毒为甲型HlNl人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl)，所述猪流感病毒为甲型HlNl猪流感病毒A/California/7/2009 (HlNl),所述禽流感病毒为甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933(HlNl)。
[0033]热休克蛋白gp96在制备提高流感疫苗的交叉保护性能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0034]上述应用中，所述提高流感疫苗的交叉保护性能是指使流感疫苗不但能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，还能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
[0035]上述应用中，所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种:人、猪和禽。
[0036]上述应用中，所述流感疫苗是用流感病毒制成的疫`苗。
[0037]上述应用中，所述用流感病毒制成的疫苗为流感病毒的裂解疫苗或流感病毒的全病毒灭活疫苗。[0038]上述应用中，所述流感病毒为甲型HlNl流感病毒。
[0039]上述应用中，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
[0040]上述任一所述技术方案中，热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0041]上述热休克蛋白gp96在实施例中为带有His标签的gp96蛋白，His标签不影响
疫苗活性。
[0042]本发明所提供的以gp96作为天然佐剂的流感病毒通用疫苗具有以下功能特征和效果:
[0043]1、流感病毒通用疫苗可有效激活流感病毒特异性CTL和Thl型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。
[0044]2、流感病毒通用疫苗引发抗病毒的T细胞免疫应答对异型流感病毒具有交叉保护作用。
【专利附图】

【附图说明】
[0045]图1为人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE和western blot鉴定结果。
[0046]图2为基因工程制备的gp96蛋白的SDS-PAGE和western blot鉴定结果。
[0047]图3为流式细胞术检测T淋巴细胞早期活化水平结果。
[0048]图4为免疫后小鼠T淋巴细胞分泌细胞因子检测结果。
[0049]图5为免疫后小鼠血清血凝抑制抗体水平检测结果。
[0050]图6为免疫后小鼠血清中和抗体水平检测结果。
[0051]图7为免疫后小鼠血清抗体水平检测结果。[0052]图8为通用疫苗交叉保护结果。
[0053]图9为攻毒后小鼠肺脏内病毒滴度。
[0054]图10为通用疫苗诱导小鼠产生针对流感病毒保守序列特异性T细胞结果。【具体实施方式】
[0055]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0056]以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0057]实施例中所用的PBS溶液(pH为7.4)配方如下:称取NaC18g，KC10.2g，Na2HPO4.12H203.63g, KH2PO40.24g，溶于 900ml 双蒸水中，用盐酸调 pH 值至 ?.4，加 ddH20 定容至1L，常温保存备用。
[0058]下述实施例中使用的实验材料及其来源如下:
[0059]一、热休克蛋白gp96，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0060]该热休克蛋白gp96可以按照如下两种方法进行制备:
[0061](一)天然纯化方法
[0062]1、组织匀浆[0063]匀浆缓冲液配方:在pH7.0的碳酸氢钠缓冲液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式为C7H7FO2S)至终浓度ImM (置于冰上的烧杯中配制:PMSF在水溶液中数小时内分解，该溶液不可过夜)。[0064]取烧杯至于冰上，将小鼠肝脏组织在烧杯中迅速用剪刀剪成直径约1-2毫米的碎块，然后加入组织8倍重量的匀浆缓冲液。将组织碎块搅匀倒入玻璃匀浆器，匀浆至底部组织块消失后再上下匀浆15次以上。匀浆液倒入离心管，50，OOOg离心60min，取上清加入1/10 体积的 10XPBS(pH7.5,200mM NaCl)，用于步骤 2 的 ConA-Sepharose 层析。
[0065]2、ConA-Sepharose 亲和层析
[0066]载体为ConA-S^harose (购自GE公司，产品号为17-0440-01 )，按“ Iml载体/4g
[0067]组织”计算使用量。层析柱的内径和柱长是1.6X2.5cm。
[0068]将步骤I得到的上清用蠕动泵上样，0.25ml/min。在PBS(pH7.5,200mM NaCl)中加PMSF至终浓度ImM，作为洗脱液甲，用蠕动泵将10倍柱体积的洗脱液甲过层析柱(0.5ml/min)，以去除未结合蛋白。在PBS (pH7.5,200mM NaCl)中加a-D-吡喃葡萄糖至终浓度10%( 10mg/ml )，加PMSF至终浓度1禮，作为洗脱液乙，用蠕动泵将3倍柱体积的洗脱液乙过柱层析(0.25ml/min),收集洗脱液。
[0069]3、HiTrap-Q Sepharose 离子交换层析
[0070]载体为HiTrap-Q Sepharose (层析柱为HiTrap Q HP,购自GE公司，产品号为17-1153-01)。层析柱的内径和柱长是0.7X2.5cm。
[0071]将载体装柱后，先用5ml PBS (pH7.5,200mM NaCl)清洗(lml/min)。将步骤2得到的洗脱液上样(lml/min)，然后将5ml PBS (pH7.5,200mM NaCl)过层析柱(lml/min)，以去除未结合蛋白。然后将IOml PBS (pH7.5,300mM NaCl)过层析柱(lml/min)，以去除未结合蛋白。然后将3ml PBS(pH7.5,600mM NaCl)过层析柱(lml/min)，收集洗脱液，即为gp96提取物。
[0072]将gp96提取物进行10%SDS_PAGE，然后考马斯亮蓝染色。
[0073]将gp96提取物进行western blot, 一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz,产品号为sc-56339)，二抗为HRP标记山羊抗大鼠IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录号为ZB-2307)。
[0074]除了小鼠肝脏，也可用如下组织制备gp96提取物:小鼠黑色素瘤(B16)、猪肝脏、人肝癌细胞系H印G2培养细胞、临床手术切除的人肿瘤组织(乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌、肠癌、肝癌、胃癌)和人胎盘，提取方法参照小鼠肝脏的提取。
[0075]用人胎盘组织制备的gp96提取物鉴定结果见图1。
[0076]图1中，1:分子量标准；2:用人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE电泳图；3:western blot 鉴定图。
[0077](二)基因工程方法
[0078]1、重组质粒 pHFMDZ-RlL2GAmy_gp96 的构建
[0079]①提取人肝癌细胞IfepG2的mRNA，反转录合成cDNA。
[0080]②以步骤①的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0081]PCR引物如下:
[0082]Fp:5’-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3’ ；[0083]Rp:5’-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3'。[0084](下划线所示序列为酶切识别位点)
[0085]③用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0086]④用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-RlA (购自Invitrogen公司，产品号为V20520)，回收载体骨架。
[0087]⑤将步骤③的酶切产物和步骤④的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-Rl_gp96并测序。测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-Rl-gp96的骨架载体为pHFMDZ-RlA，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了 gp96蛋白的编码序列。
[0088]⑥在重组质粒pHFMDZ-Rl-gp96的BglII酶切位点插入LEU2片段，LEU2的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。BamHI酶切位点插入α -淀粉酶报告系统，该系统的序列如SEQID N0.4 所示，得到重组质粒 pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96。
[0089]2、gp96蛋白的表达
[0090]①采用电转化法将步骤I得到的重组质粒pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号为MYA-335)细胞，得到重组菌。
[0091]②将重组菌接种于5mL SD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12117.7)，37°C培养48h，然后转接到IOOmL SYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12116.1)，30°C培养48h，得到种子培养液。
[0092]③将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30°C培养。使用氨水控制pH维持在5.5，每4h检测I次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5%左右，同时控制溶氧在20%以上。根据菌体的生成情况检测菌体湿重,等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组gp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8%左右)，诱导开始72小时后停止发酵，得到发酵液。
[0093]3、gp96蛋白的分离纯化
[0094]将步骤2得到的发酵液离心，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞，破碎后的细胞12000rpm/min离心20min,收集上清液。上清液用0.45 μ m滤膜进行过滤,得到滤液。将滤液进行浓缩，得到浓缩液。
[0095]将滤液进行亲和层析，具体步骤如下:采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的N1-NTA Purification System进行亲和层析,主要步骤为:先用PBS平衡柱子2h,然后用PBS (含20mM咪唑)平衡柱子2h。将浓缩液用PBS (含20mM咪唑)稀释后上样，用PBS (含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值〈0.01，用PBS (含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液。所有操作均在4°C下进行,流速为0.5mL/min。
[0096]每升步骤2得到的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90%以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液再进行离子交换层析，主要步骤为:200mM NaCl的PBS液平衡柱子，上样，300mM NaCl的PBS液洗杂质，800mM NaCl的PBS液洗脱目的蛋白。
[0097]将步骤2的发酵液、亲和层析后的洗脱液和离子交换层析后的洗脱液进行10%SDS-PAGE,然后考马斯亮蓝染色。将gp96蛋白进行western blot,—抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz,产品号为sc_56399), 二抗为HRP标记山羊抗大鼠IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录号为ZB-2307)。结果见图2。
[0098]图2中，1:分子量标准；2:步骤2的发酵液；3:亲和层析后的洗脱液；4:离子交换层析后的洗脱液；5:western blot鉴定图。
[0099]图2显示，离子交换层析后的洗脱液中的gp96蛋白纯度很高。
[0100]该gp96蛋白带有His标签蛋白，该标签蛋白不影响疫苗活性。
[0101]以下实施例中用到的gp96蛋白为基因工程方法制备的gp96蛋白。
[0102]抗CD4的抗体购自BioLegend，产品目录号为100407。
[0103]抗CD8的抗体购自BioLegend，产品目录号为100705。
[0104]TMB显色液购自江苏碧云天公司，产品号为P0209。
[0105]HRP标记山羊抗小鼠的IgG抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgGl抗体、HRP标记的山羊抗小鼠的IgG2a抗体均购自SER0TEC公司，产品号分别为STAR117P，STAR132P，STAR133P。
[0106]BABL/c小鼠和鸡胚购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
[0107]IL-4的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7044。
[0108]TNF-α的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7324。
[0109]IL-6的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7064。
[0110]IFN-Y的ELISA检测试剂盒购自eBioscience，产品目录号88-7314。
[0111]二、猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗
[0112]猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗购自北京科兴生物制品股份有限公司，商品名为盼尔来福.1(PANFLU.1)，批准文号:国药准字S20090012、国药准字S20090013、国药准字S20090014。甲型HlNl流感病毒裂解疫苗本身不含有任何佐剂。
[0113]三、甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933(H1N1)的全病毒灭活疫苗
[0114]甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933 (HlNl)的全病毒灭活疫苗的制备方法如下:
[0115](一)病毒增殖
[0116]取9日龄的SPF鸡胚，用照蛋器照蛋，除掉无精蛋、碎蛋和终止蛋。将气室端朝上放在蛋盘里，在照蛋器下面画出其气室和胚胎位置，在气室边缘上端3-5mm处做一标记作为接种部位。用70%酒精消毒鸡胚，在气室上方打孔，用Iml注射器将处理后的A/WSN/1/1933 (HlNl)病毒标本沿小孔(避开鸡胚)在尿囊腔内注射0.1ml。将注射器放入安全地方，用蜡封孔。37°C培养72小时后收获。鸡胚放在4 °C条件下冷却4h或过夜，用70%酒精消毒鸡胚，用灭菌的镊子击碎气室上方的蛋壳，另外用一把灭菌的镊子压住尿囊膜。用IOml吸管吸取尿囊液并放在标记好的塑料管内。挑破尿囊膜，尽可能的收取更多的尿囊液。在3000rpm/min，离心5min收获的液体，以除去血和细胞。收获的尿囊液用血凝试验检测有无病毒，并做无菌检测后贮存在-80°C条件下。
[0117](二)病毒灭活疫苗的制备
[0118]在病毒中加入终浓度不高于0.2mg/ml的甲醛，置2-8°C将病毒灭活7-10天。病毒灭活到期后，取样进行病毒灭活验证试验，并进行细菌内毒素含量测定。超滤浓缩灭活的单价病毒合并液，浓缩后的病毒液血凝效价应不低于1:10240。超滤浓缩后的病毒液采用蔗糖密度区带离心法进行纯化，由高到低依次加入30%、45%和60%的蔗糖溶液。缓慢加入待纯化的病毒液，1.1 X IO5g,超速离心2.5小时。取30%和45%蔗糖溶液之间的病毒溶液，
1.1XlO5g,超速离心3小时后取沉淀，溶解在PBS溶液中。纯化后的病毒液经除菌过滤，即为单价原液，可作为免疫用疫苗。实施例中简称为WSN全病毒灭活苗。
[0119]四、甲型HlNl人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl)的全病毒灭活疫苗
[0120]甲型HlNl人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl)的全病毒灭活疫苗制备方法与上述甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933 (HlNl)的全病毒灭活疫苗的制备方法相同，实验中将甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933 (HlNl)替换为甲型HlNl人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(HlNl)。实施例中简称为PR8全病毒灭活苗。
[0121]五、实施例中的攻毒实验使用的病毒株
[0122]1、人流感病毒 PR8:甲型 HlNl 人流感病毒 A/Puerto Rico/8/1934 (HlNl)；
[0123]2、禽流感病毒WSN:甲型HlNl禽流感病毒A/WSN/1/1933 (HlNl)；
[0124]3、猪流感病毒:甲型 HlNl 猪流感病毒 A/California/7/2009 (HlNl)。
[0125]以上三种病毒均购自ATCC。
[0126]实施例1、猪流感病毒通用疫苗及其功能验证
[0127]一、猪流感病毒通用疫苗的组成
[0128]由猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗和热休克蛋白gp96组成，猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗和热休克蛋白gp96的质量比为0.15微克:20微克。
[0129]二、猪流感病毒通用疫苗 的功能验证
[0130](一)免疫方法
[0131]6周龄的雌性BALB/c (H_2d)小鼠分成3组，每组15只，每组免疫两次，间隔14天分别进行免疫，免疫方式为腹腔注射。
[0132]第一组(gp96 + PANFLU.1):每只小鼠每次免疫0.15微克PANFLU.1和20微克gp96 (用PBS稀释至500微升)。
[0133]第二组(PANFLU.1):每只小鼠每次免疫0.15微克PANFLU.1 (用PBS稀释至500微升)。
[0134]第三组(PBS，空白对照):每只小鼠每次免疫500微升PBS。
[0135](二)结果
[0136]1、细胞免疫
[0137]最后一次免疫后一周处死小鼠并在无菌条件下分离脾细胞，计数后稀释至所需浓度待用。
[0138]T细胞活化因子⑶69比例分析:分离小鼠脾脏的T细胞，流式细胞术(FACS)检测T细胞活化因子⑶69的表达水平。小鼠T细胞活化因子⑶69检测试剂盒购自eBioscience公司，货号为12-0691-81，实验按照说明书操作。⑶69是T淋巴细胞早期活化的标志，⑶69流式检测数据分析结果见图3。
[0139]图3中，A:⑶69+的⑶4+T细胞占⑶4+T细胞的比例；B:⑶69+的⑶8+T细胞占⑶8+T细胞的比例。
[0140]图3A 显示，第一组(gp96 佐剂组:gp96 + PANFLU.1):CD69+的 CD4+T 细胞占 CD4+T细胞数的比例为9.31 ±0.33% ;第二组(疫苗组=PANFLU.1)⑶69+的CD4+T细胞占CD4+T细胞数的比例为6.07 ±0.51%，第一组比第二组⑶69活化升高50%。
[0141]图3B 显示，第一组(gp96 佐剂组:gp96 + PANFLU.1)CD69+ 的 CD8+T 细胞占 CD8+T细胞数的比例为5.06±0.86% ;第二组(疫苗组=PANFLU.1)⑶69+的CD8+T细胞占CD8+T细胞数的比例为4.66±0.24，第一组比第二组⑶69活化升高8.5%。
[0142]免疫后小鼠T淋巴细胞分泌细胞因子的检测结果见图4。
[0143]图4中，A:IL-6水平的检测；B:1L_4水平的检测；C:TNF- α水平的检测；D:IFN-y水平的检测。
[0144]图4显示，与第二组(疫苗组:PANFLU.1)相比，第一组(gp96佐剂组:gp96 +PANFLU.1)的TNF-α、IL_6、IFN-y水平分别升高到第二组的1.3倍、1.5倍和2倍，说明gp96可以激活Thl型细胞，并刺激细胞分泌细胞因子。
[0145]上述实验数据表明，科兴公司生产的甲型HlNl流感病毒裂解疫苗T细胞免疫活性很低。gp96作为天然佐剂能有效激活流感病毒特异性CTL和Thl型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。
[0146]2、体液免疫
[0147]第一次免疫2周后以及第二次免疫2周后,在小鼠尾部取血,于4°C静置3-4小时，1000g离心3min后取上清，用于抗体水平检测。
[0148]取小鼠血清进行血凝抑制试验，操作如下:取一干净的塑料板，标明测定血清标本。每孔加入25ul生理盐水。于第一孔和最后一孔中各加入25ul经RDE处理过的血清，从第一孔起作倍比稀释至倒数第二孔，弃掉25ul。将最后一孔轻轻吹打后，亦弃掉25ul。于最后一孔加入25ul生理盐水，其余各孔一律加入25ul四个凝集单位抗原，轻轻摇匀，置室温60min。各孔加入25ull%的红细胞悬液，摇匀置室温30-60min后观察结果。以能完全抑制红细胞凝集(简称血抑)的最高血清稀释度的倒数为血清抗体效价即终点，该孔稀释度即为HI试验的效价。结果见图5。
[0149]图5显示，免疫小鼠14天后，与第二组(疫苗组:PANFLU.1)相比，第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)可提高血凝抑制抗体水平到第二组的1.9倍。
[0150]取小鼠血清进行中和抗体检测，采用空斑减少法，操作如下:100PFU的病毒与倍比稀释的血清等量混合，于37°C放置I小时，每瓶细胞接种0.2ml，每个稀释度接种3个形成单层MDCK细胞的细胞瓶，37°C吸附I小时后，加入44°C预热的营养琼脂，平放I小时，凝固后放入CO2培养箱，孵育7天，检查细胞培养物的血细胞吸附作用，使空斑减少50%的血清稀释度就是该血清的中和价。结果见图6。
[0151]图6显示，免疫小鼠14天后，与第二组(疫苗组:PANFLU.1)相比，第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)可提高中和抗体水平到第一组的2.5倍。免疫小鼠28天后，与第二组(疫苗组=PANFLU.1)相比，第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)可提高中和抗体水平到第一组的2倍。
[0152]取小鼠血清进行ELISA检测,操作如下:每孔包被IOug HA, 4°C孵育过夜,然后再以PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。将血清稀释，每孔加入IOOul，共加3孔，分别检测IgG、IgGl、IgG2a。37°C孵育2h,再以PBS-T清洗3遍,每遍清洗5min。分别加入HRP标记的IgG抗体、HRP标记的IgGl抗体、HRP标记的IgG2a抗体，37°C孵育lh。再以PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。每孔加入lOOulTMB显色液，37°C放置15min后加入50ul2M硫酸终止反应，在酶标仪上以波长490nm检测。结果见图7。
[0153]图7 中，A:1gG 的检测；B:IgG2a 的检测；C =IgGl 的检测；D:1gG2a/IgGl。`
[0154]一般用IgG2a/IgGl来评价疫苗诱导的免疫应答是偏向于Thl还是Th2型(因为Th细胞的两个分化方向，Thl可以分泌多种细胞因子如干扰素促进CTL反应即所谓的细胞免疫倾向，而Th2则可以分泌细胞因子IL-4促进抗体产生即所谓的体液免疫倾向)在小鼠体内，Thl型会产生IgG2a型抗体，Th2型则会产生IgGl型抗体。
[0155]图7D显示，与第二组(疫苗组:PANFLU.1)相比，第一组(gp96佐剂组:gp96 +PANFLU.1) IgG2a的表达量显著升高，说明gp96诱导T细胞应答偏向于激活细胞免疫。
[0156]3、交叉保护实验
[0157](I)最后一针免疫10天后的小鼠用人流感病毒PR8以及禽流感病毒WSN分别感染:乙醚麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态，从鼻腔滴注IO7PFU的流感病毒，每天监测小鼠存活状况，监测期为14天。结果见图8，图中的Gp96组代表第一组。
[0158]图8中，A:免疫后的小鼠用人流感病毒PR8感染后的存活率；B:免疫后的小鼠用禽流感病毒WSN感染后的存活率。
[0159]图8A显示,第14天时,第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)免疫小鼠能抵抗人流感病毒PR8的攻击，保护率均为100%。而第二组(疫苗组:PANFLU.1)小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第6天小鼠出现死亡，14天后全部死亡。第三组(空白对照组)小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第4天小鼠出现死亡，14天后全部死亡。
[0160]图8B显示，第14天时，第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)免疫小鼠能抵抗禽流感病毒WSN的攻击，保护率均为100%。而第二组(疫苗组:PANFLU.1)小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第6天小鼠出现死亡，14天后存活率为20%。第三组(空白对照组)小鼠皮毛竖起、弓背和体重减轻等疾病症状很明显，感染后第6天后小鼠出现死亡，14天后全部死亡。
[0161](2)最后一针免疫10天后的小鼠用人流感病毒PR8以及禽流感病毒WSN分别感染，四天后取小鼠肺脏进行病毒滴度测定。攻毒4天后小鼠拉颈处死后，在无菌状态下取出肺脏，称重后在研磨钵中研磨，按照Ig肺脏组织:10ml PBS的比例制备肺组织匀浆，取出置于1.5ml Ep管中，2000g离心10分钟，取上清，测PFU。结果见图9。
[0162]图9中，A:免疫后的小鼠用人流感病毒PR8感染后肺脏病毒滴度测定；B:免疫后的小鼠用禽流感病毒WSN感染后肺脏病毒滴度测定。
[0163]图9A显示，第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)和第二组(疫苗组:PANFLU.1)小鼠感染人流感病毒PR84天后肺部病毒的平均滴度是3.lxl04PFU/ml和
1.4xl06PFU/ml，第三组(空白对照组)肺部病毒的平均滴度是3.lxl06PFU/ml。
[0164]图9B显示，第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)和第二组(疫苗组:PANFLU.1)小鼠感染禽流感病毒WSN4天后肺部病毒的平均滴度是4.6xl03PFU/ml和
8.7xl05PFU/ml，第三组(空白对照组)肺部病毒的平均滴度是1.lxl06PFU/ml。
[0165]以上数据表明，与单独用流感病毒疫苗免疫相比，用流感病毒疫苗联合gp96免疫后再给于高剂量的病毒感染小鼠，小鼠肺部病毒滴度明显降低。
[0166]4、T细胞免疫应答对流感病毒感染的交叉保护作用
[0167]NP是保守蛋白，是甲型流感病毒CTL识别的主要抗原之一，甲流感NP可以诱发针对异型流感病毒的CTL反应，因此本实施例中应用ELISP0T方法，选用核心蛋白(NP) H_2d限制性CTL表位(NP147_155)用于刺激免疫的BALB/c(H-2d)小鼠T细胞，用含有浓度为10 μ g/mLHA的疫苗液(猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗)刺激免疫的BALB/c (H_2d)小鼠T细胞，同时选用PR8全病毒灭活苗刺激免疫的BALB/c (H-2d)小鼠T细胞，检测gp96作为佐剂的流感疫苗对异型流感病毒的交叉反应。结果见图10。[0168]图10显示，NP147_155可以明显的刺激第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)的T细胞分泌IFN- Y，猪甲型HlNl流感病毒裂解疫苗和PR8全病毒灭活苗同样能刺激第一组(gp96佐剂组:gp96 + PANFLU.1)的T细胞分泌IFN- Y。这三种刺激源均不能刺激第二组(疫苗组=PANFLU.1)的T淋巴细胞分泌IFN- Y。这说明gp96作为佐剂的流感疫苗之所以能产生对异型流感病毒产生交叉保护作用是由于其能诱发流感病毒内部保守蛋白特异性的 CTL。
[0169]科兴公司生产的甲型HlNl流感疫苗为全病毒裂解疫苗，T细胞免疫活性很低，实验结果显示gp96作为天然佐剂能有效激活流感病毒特异性CTL和Thl型细胞，引发抗病毒的T细胞免疫应答。用甲型HlNl流感病毒裂解疫苗与gp96联合免疫小鼠可以对甲流感病毒不同毒株产生很好的交叉保护能力。
[0170]当本发明疫苗中新型HlNl猪流感病毒的裂解苗和热休克蛋白gp96的质量比为1:4,1:40或1:400时，本发明疫苗的实验效果与上述结果无显著差异。
[0171]实施例2、人流感病毒通用疫苗及其功能验证
[0172]一、人流感病毒通用疫苗的组成
[0173]人流感病毒通用疫苗由甲型HlNl人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)的全病毒灭活疫苗和热休克蛋白gp96组成，甲型HlNl人流感病毒A/PuertoRico/8/1934(HlNl)和热休克蛋白gp96的配比为0.15微克:20微克。
[0174]二、人流感病毒通用疫苗的功能验证
[0175](—)免疫方法
[0176]6周龄的雌性BALB/c (H_2d)小鼠分成3组，每组10只，每组免疫两次，间隔14天分别进行免疫，免疫方式为腹腔注射。
[0177]第一组(gp96 + PR8全病毒灭活苗):每只小鼠每次免疫0.15微克PR8全病毒灭活苗和20微克gp96 (用PBS稀释至500微升)；
[0178]第二组(PR8全病毒灭活苗):每只小鼠每次免疫0.15微克PR8全病毒灭活苗(用PBS稀释至500微升)；
[0179]第三组(PBS，空白对照):每只小鼠每次免疫500微升PBS。
[0180](二)交叉保护实验
[0181]1、最后一针免疫10天后的小鼠用禽流感病毒WSN以及猪流感病毒分别感染，乙醚麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态，从鼻腔滴注IO7PFU的流感病毒,每天监测小鼠的存活状况，监测期为14天。结果见表1。
[0182]2、最后一针免疫10天后的小鼠用禽流感病毒WSN以及猪流感病毒分别感染，四天后取小鼠肺脏进行病毒滴度测定。攻毒4天后小鼠拉颈处死后，无菌状态下取出肺脏，称重后与研磨钵中研磨，按照Ig肺脏组织:10ml PBS的比例制备肺组织匀浆，取出置于1.5mlEp管中，2000g离心10分钟，取上清，测PFU。结果见表1。
[0183]表1攻毒后疫苗对小鼠保护情况以及攻毒4天后小鼠肺脏病毒滴度
[0184]
【权利要求】
1.一种具有交叉保护作用的流感疫苗，由普通流感疫苗与热休克蛋白gp96组成。
2.根据权利要求1所述的流感疫苗，其特征在于:所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为1:4—1:400。
3.根据权利要求1或2所述的流感疫苗，其特征在于:所述普通流感疫苗与所述热休克蛋白gp96的质量比为3:400。
4.根据权利要求1-3中任一所述的流感疫苗，其特征在于:所述普通流感疫苗为用流感病毒制成的疫苗。
5.根据权利要求1-4中任一所述的流感疫苗，其特征在于:所述流感病毒为甲型HlNl流感病毒； 和/或，所述流感病毒为来源于人的流感病毒、来源于猪的流感病毒或来源于禽的流感病毒。
6.一种制备权利要求1-5中任一所述的流感疫苗的方法，包括如下步骤:将所述普通流感疫苗和所述热休克蛋白gp96混合，得到具有交叉保护作用的流感疫苗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述交叉保护作用是指疫苗既能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，又能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
8.权利要求1-5任一所述的流感疫苗在制备具有交叉保护作用的预防和/或治疗流感的产品中的应用。
9.热休克蛋白gp96在制备提闻流感疫苗的交叉保护性能的广品中的应用； 所述提高流感疫苗的交叉保护性能是指使流感疫苗不但能保护来源于物种A的流感病毒的攻击，还能保护来源于物种B的流感病毒的攻击，物种A和物种B为不同的物种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述物种A和物种B均选自如下中的至少一种:人、猪和禽。
【文档编号】A61K39/39GK103505725SQ201310460890
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】孟颂东, 鞠莹, 胡俊, 陈立钊, 李长菲, 赵报 申请人:中科微生物免疫制剂工程中心南通有限公司