一种高效的肿瘤个体化免疫治疗方法及其应用的制作方法

一种高效的肿瘤个体化免疫治疗方法及其应用的制作方法【专利摘要】本发明提供了一种高效的肿瘤临床治疗方法。本发明提供了一种患者自体热休克蛋白gp96-抗原复合物在临床肿瘤个体化免疫治疗中的应用；本发明提供了在自体gp96-抗原复合物临床应用中增强效果的方法。本发明所述增强效果的方法为在免疫自体gp96-抗原复合物的同时联合应用低剂量环磷酰胺。本发明对于胃癌、肝癌等具有显著的治疗效果。【专利说明】一种高效的肿瘤个体化免疫治疗方法及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种促进临床应用自体gp96蛋白个体化治疗肿瘤疗效的方法及其应用。【
背景技术：
】[0002]恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的常见病，已成为全球一个主要死亡原因，在2012年造成820万人死亡，全球癌症带来的经济损失高达8950亿美元。由于癌症的发生是一个逐步积累的过程，发病率与死亡率随着年龄的增大呈现指数上升的趋势。而我国随着国民经济的发展、医疗卫生的进步和预期寿命的延长，人口分布已进入老龄化阶段，且主要人口年龄分布仍在逐年增大，老龄化日趋严重。同时环境污染依然严重。我国肿瘤发病率呈一个快速增大的态势。恶性肿瘤已成为我国疾病死亡的第一杀手。近几年来国内每年新增肿瘤病人220万人，死亡约160万人，目前全国肿瘤患者总数估计在450万人左右。我国居民每死亡的5人中，即有I人死于癌症。肿瘤病因复杂，治疗费用高昂，我国每年用于恶性肿瘤的医疗费用高达1200多亿元。由于治疗缺乏有效性，我国肿瘤患者5年生存率不足25%，京津沪这样的大城市也仅为40%。[0003]应用自体肿瘤组织提取的gp96多肽复合物作为个体化治疗性疫苗免疫治疗肿瘤，充分考虑到个体间的差异，可以达到最佳治疗效果，是当今医学及药物学发展的重要方向之一。[0004]gp96蛋白存在于细胞内质网膜内，是热休克蛋白家族成员之一。gp96作为分子伴侣在蛋白折叠与运输过程中发挥重要作用；同时它能结合细胞中5-25个氨基酸的抗原多肽，从肿瘤组织纯化的gp96_多肽复合物是最能代表肿瘤组织的抗原肽库。皮下免疫gp96-多肽复合物后，gp96复合物通过抗原呈递细胞(APC)表面受体分子进入细胞并将结合的抗原表位呈递给MHCI类和II类分子，从而启动患者肿瘤特异性T细胞免疫应答。[0005]研究表明肿瘤具有个体特异性，肿瘤的特异性不仅表现在肿瘤类型之间，还表现在不同个体之间。即使是同种类型肿瘤，不同个体的肿瘤生物学和免疫学特性也存在显著差别。这使得针对已知肿瘤抗原而设计的肿瘤疫苗不能有效激发针对肿瘤细胞的免疫反应。而肿瘤自体gp96抗原复合物携带了完整的肿瘤个体信息，应用该复合物免疫治疗充分考虑了个体间的差异，并利用gp96天然T细胞佐剂的特性，可以达到最佳治疗效果。[0006]临床试验已经证明，自体热休克蛋白gp96复合物能够激活肿瘤特异性T细胞，对术后残留的肿瘤细胞，包括休眠肿瘤细胞和肿瘤干细胞进行有效杀伤和清除，可以达到延缓肿瘤复发和延长患者生命的效果。应用热休克蛋白gp96自体疫苗激活肿瘤特异性T细胞，对于治疗肾癌、黑色素瘤及脑胶质瘤等安全有效，显著延长患者生存期。接受自体gp96治疗的黑色素瘤MIa和Mlb期患者平均存活期比对照治疗延长18.4个月(31.2vs12.8月，产=0.03，危险比HR=0.45)。接受gp96自体疫苗治疗的未转移中等风险肾癌患者(包括I/II期，III期的T1/2/3)，复发时间延长45%(/X0.01，危险比HR=0.55)，与对照相比复发时间延长约1.8年，同时接受治疗的患者存活期延长。接受治疗的复发性胶质母细胞瘤患者中位生存期延长83%(47.6周比26周)。因此该治疗方法已经于2008年在俄罗斯批准上市治疗肾癌，并被美国FDA和欧盟EMA批准作为治疗黑色素瘤、脑胶质母细胞瘤、肾癌的孤儿药。[0007]调节性T细胞(Treg)是一群具有抑制功能的T细胞亚群，能够在获得性免疫、天然免疫过程中发回抑制作用，主要特征是表达⑶4阳性、⑶25高表达和Foxp3阳性。有证据表明Treg细胞比例增高或数量增多是肿瘤患者免疫耐受的一个重要机制。有证据表明，去除或者减少Treg细胞能增强机体针对病毒、肿瘤等疾病的免疫反应,或者增加自身免疫病的发生危险。【
发明内容】[0008]本发明要解决的技术问题是如何在临床水平有效的个体化免疫治疗恶性肿瘤。[0009]本发明的一个目的是提供一种肿瘤个体化免疫治疗的方法。该方法的一个要点是从患者手术切除的肿瘤组织制备自体gp96-抗原复合物作为个体化疫苗。该方法的另一个要点是在患者免疫时有效抑制调节性T细胞增强个体化疫苗的免疫效果。[0010]上述的gp96-抗原复合物是将手术切除的肿瘤组织充分研磨破碎，离心获得的上清匀浆液依次进行ConA亲和层析和强阴离子交换层析得到的；上述手术切除的肿瘤组织包括但不限于食管癌组织、肺癌组织、胰腺癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、肾癌组织、胃癌组织等；上述纯化步骤包括如下步骤:1、将组织裂解液的酸碱度调节到pH7.5;以0.15cm/min的径流速缓慢上样到ConA亲和层析柱；以0.15cm/min的径流速冲洗ConA层析柱，体积30倍层析柱柱体积，溶液为200mMPBS溶液；以0.15cm/min的径流速洗脱ConA层析柱亲和组分，洗脱缓冲液为浓度100g/L的a-D-吡喃葡萄糖200mMPBS溶液，洗脱体积为3倍层析柱柱体积，洗脱过程为洗脱液洗脱2体积、停滞40分钟、洗脱液洗脱I体积、200mMPBS溶液洗脱I体积。[0011]2、将步骤1、中的4体积洗脱液以1.2cm/分钟的径流速上样到强阴离子层析柱；以1.2cm/分钟的径流速冲洗杂蛋白，缓冲液依次分别是PB2个层析柱柱体积、200mMPBS10个层析柱柱体积、300mMPBS30个层析柱柱体积；以1.2cm/分钟的径流速洗脱目标组分，缓冲液为600mMPBS，洗脱4个层析柱柱体积，得到的洗脱液浓缩换液后即是治疗所用的自体gp96-抗原复合物疫苗。[0012]上述的个体化免疫治疗过程中治疗方案为自体gp96_抗原复合物免疫联合免疫增强预处理:患者手术后8周内开始皮下注射该自体gp96-抗原复合物，每7天注射I次，注射6-10次，至少注射6次。患者每一次注射疫苗时进行调节性T细胞抑制预处理已增强免疫反应。患者第一次免疫前3天内肿瘤特异性T细胞反应和最后一次免疫后3-7天的T肿瘤特异性T细胞反应的差异可以反映患者对免疫治疗的反应性。[0013]上述的调节性T细胞抑制预处理的临床方案为在每一次注射疫苗前1-3天内给患者静脉注射400mg环磷酰胺，从而有效的特异性抑制调节性T细胞的功能，增强每一次免疫的T细胞反应。[0014]附图简要说明图1.免疫肿瘤自体gp96-抗原复合物过程中联合低剂量环磷酰胺预处理可以加强的小鼠脾脏淋巴细胞对自体胃癌细胞的裂解作用。肿瘤自体gp96抗原复合物单独或联合低剂量环磷酰胺预处理，按O、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测特异性细胞裂解率。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准51Cr释放法测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10、25、50和100，图中裂解率为10只小鼠平均值。[0015]图2.免疫肿瘤自体gp96_抗原复合物过程中联合低剂量环磷酰胺预处理可以加强的小鼠脾脏淋巴细胞对自体食管癌细胞的裂解作用。肿瘤自体gp96抗原复合物单独或联合低剂量环磷酰胺预处理，按O、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测特异性细胞裂解率。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准51Cr释放法测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10、25、50和100，图中裂解率为10只小鼠平均值。[0016]图3.免疫肿瘤自体gp96_抗原复合物过程中联合低剂量环磷酰胺预处理可以加强的小鼠脾脏淋巴细胞自体肺癌细胞的裂解作用。肿瘤自体gp96抗原复合物单独或联合低剂量环磷酰胺预处理，按O、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测特异性细胞裂解率。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准51Cr释放法测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10、25、50和100，图中裂解率为10只小鼠平均值。[0017]图4.免疫肿瘤自体gp96_抗原复合物过程中联合低剂量环磷酰胺预处理可以加强的小鼠脾脏淋巴细胞对裸鼠皮下接种的胃癌细胞生长的抑制作用。裸鼠皮下接种人胃癌细胞KATO-1II，荷瘤7天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。实验组(n=20)的接受低剂量环磷酰胺预处理+自体gp96-抗原复合物免疫的BALB/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞；对照组(n=20)接受经过单独自体gp96-抗原复合物免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞；阴性对照(n=20)接受经过单独小鼠肝脏来源的gp96蛋白免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞。[0018]图5.免疫肿瘤自体gp96_抗原复合物过程中联合低剂量环磷酰胺预处理可以加强的小鼠脾脏淋巴细胞对裸鼠皮下接种的食管癌细胞生长的抑制作用。裸鼠皮下接种人食管癌细胞TE-1，荷瘤7天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。实验组(n=20)的接受低剂量环磷酰胺预处理+自体gp96-抗原复合物免疫的BALB/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞；对照组(n=20)接受经过单独自体gp96-抗原复合物免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞；阴性对照(n=20)接受经过单独小鼠肝脏来源的gp96蛋白免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞。[0019]图6.免疫肿瘤自体gp96_抗原复合物过程中联合低剂量环磷酰胺预处理可以加强的小鼠脾脏淋巴细胞对裸鼠皮下接种的肺癌细胞生长的抑制作用。裸鼠皮下接种人肺癌细胞PC-9，荷瘤14天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。实验组(n=20)的接受低剂量环磷酰胺预处理+自体gp96-抗原复合物免疫的BALB/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞；对照组(n=20)接受经过单独自体gp96-抗原复合物免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞；阴性对照(n=20)接受经过单独小鼠肝脏来源的gp96蛋白免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾脏淋巴细胞。[0020]图7.从一例胃癌患者肿瘤组织中纯化的gp96_抗原复合物的SDS-PAGE电泳结果O[0021]图8.从25例胃癌患者肿瘤组织中纯化的gp96_抗原复合物内毒素检测结果。[0022]图9.胃癌患者免疫自体肿瘤gp96复合物后肿瘤异性T细胞的变化。以IFN-g的ELISP0T方法检测患者外周血中肿瘤抗原特异性T细胞。癌旁组织裂解液为阴性对照。[0023]【具体实施方式】:下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0024]实施例1.从胃癌组织中纯化gp96蛋白将胃癌组织充分匀浆；高速离心(22000gX30min)3次(粘液腺癌或印戒细胞癌)或者2次(非粘液腺癌或印戒细胞癌)去除细胞碎片；上清采用ConASepharose(GE公司)进行亲和层析，用10%(m/V)的a-甲基葡萄糖苷洗脱结合的蛋白；糖苷洗脱液以Hitrap-Q(GE公司层析系统)进行阴离子层析；浓缩、除菌；经过这三步纯化获得>95%纯度的gp96蛋白。其纯度用SDS-PAGE、Westenblot鉴定，微生物指标、内毒素指标委托有资质第三方检测(图7、图8)。所有指标均符合国家药典中对疫苗类无菌药物的要求。[0025]实施例2.从食管癌组织中纯化gp96_抗原复合物蛋白将食管癌组织匀浆后离心，离心上清采用ConASepharose(GE公司)进行亲和层析，用10%的a-甲基葡萄糖苷洗脱结合的蛋白，糖苷洗脱液以Hitrap-Q(GE公司层析系统)进行阴离子层析，600mMPBS洗脱的组分经浓缩、除菌。以上步骤均在无菌条件背景B级局部A级的GMP车间内完成，4V条件下进行。经过这四步纯化获得>95%纯度的无菌自体gp96-抗原复合物疫苗。其纯度用SDS-PAGE、Westenblot鉴定，微生物指标、内毒素指标委托有资质第三方检测。所有指标均符合国家药典中对疫苗类无菌药物的要求。[0026]实施例3.从肺癌组织中纯化gp96_抗原复合物蛋白将肺癌组织以Dounce匀浆器两轮充分匀浆破坏内质网，高速离心3次(22000gX30min)去除细胞碎片；上清组织裂解液上样至ConASepharose(GE公司)亲和层柱,200mMPBS冲洗杂蛋白，用10%的a-甲基葡萄糖苷洗脱结合的蛋白；糖苷洗脱液以Hitrap-Q(GE公司层析系统)进行阴离子层析，350mMPBS冲洗20个柱体积去除杂蛋白，600mMPBS洗脱目标蛋白；再以截留分子量50kD的超滤管浓缩，0.22uM孔径的滤器除菌。以上步骤均在无菌条件背景B级局部A级的GMP车间内完成，4°C条件下进行。经过这四步纯化获得>95%纯度的gp96蛋白。其纯度用SDS-PAGE、Westenblot鉴定，微生物指标、内毒素指标委托有资质第三方检测。所有指标均符合国家药典中对疫苗类无菌药物的要求。[0027]实施例4.免疫小鼠选用生长8-10周的HLA-A2转基因的BALB/c小鼠(HLA-A2+)用于本实验。[0028]免疫方式采用将样品溶于10uL的PBS中颈背皮下注射。皮下注射操作相对简单，要求免疫剂量适中，故采用该种免疫方式。同时在每次免疫前I天可腹腔注射0.4mg的环磷酰胺。低剂量环磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg细胞从而能增强免疫效果。[0029]自体gp96_抗原复合物的最适免疫剂量为25ug。[0030]免疫时间为0、1、3周进行三次的强化免疫，优于免疫一次或二次的效果。[0031]因此采用皮下注射免疫，将gp96_抗原复合物溶于PBS中，注射前剧烈振荡I分钟，每只小鼠免疫gp96-抗原复合物剂量为25ug/只，采用颈背皮下注射，第一次免疫I周后进行第二次免疫，2周后加强免疫，3天后进行细胞毒性分析。每一处理使用10只小鼠。[0032]实施例5.细胞毒性(CTL)分析小鼠加强免疫3天后，从每只小鼠收获得约3X17脾细胞悬于含有10mMHEPES缓冲液、5X10_5M琉基乙醇，抗生素和10%(V/V)FCS培养液中，于培养瓶中与经幅射(4500Rad)的T2细胞(3:1)和lmg/mL肽在完全培养基中37°C培养。6天后收集脾细胞进行4小时标准51Cr释放实验(具体方法见Kuhrober,A,etal.1997.1nternat1nalImmunology,9(8):1203-1212)测定细胞毒性活性。简而言之，肿瘤gp96来源的肿瘤细胞系作为靶细胞，加入不同数量的效应细胞，反应体系为100μL的完全培养基。37°C共培养4小时后收集上清测定特异裂解率。[0033]从51Cr释放实验可以看出gp96_抗原复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，每只小鼠免疫25ug复合物即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在50%以上，通过注射环磷酰胺的预处理可以明显的提高gp96-抗原复合物的免疫效果，且环磷酰胺的作用是依赖于自体gp96疫苗的(图1、图2、图3)。[0034]实施例6.胃癌体内抑瘤实验体外培养胃癌细胞系KATO-1II细胞，从中提取胃癌特异的gp96-抗原复合物。以该gp96-胃癌抗原复合物单独免疫(对照组■)或者联合低剂量环磷酰胺预处理(实验组▲)或者小鼠肝脏来源gp96复合物(阴性对照?)免疫人HLA转基因小鼠(Balb/cHU2+小鼠)获得胃癌特异的脾脏淋巴细胞。将获得的淋巴细胞分别转输KATO-1II皮下接种荷瘤7天的裸鼠作为实验组、对照组、阴性对照组(n=20)，每周转输一次，共3周。检测肿瘤大小，如图所示低剂量环磷酰胺预处理明显的加强了小鼠对胃癌的特异性免疫反应(图4)。[0035]实施例7.食管癌体内抑瘤实验体外培养食管癌细胞系TE-1细胞，从中提取食管癌特异的gp96-抗原复合物。以该gp96-食管癌抗原复合物单独免疫(对照组▲)或者联合低剂量环磷酰胺预处理(实验组?)或者小鼠肝脏来源gp96复合物(阴性对照■)免疫人HLA转基因小鼠(Balb/cHU2+小鼠)获得食管癌特异的脾脏淋巴细胞。将获得的淋巴细胞分别转输TE-1皮下接种荷瘤7天的裸鼠作为实验组、对照组、阴性对照组(n=20)，每周转输一次，共3周。检测肿瘤大小，如图所示低剂量环磷酰胺预处理明显的加强了小鼠对食管癌的特异性免疫反应(图5)。[0036]实施例8.肺癌体内抑瘤实验体外培养HLA-A2阳性人肺癌细胞系PC-9细胞，从中提取肺癌特异的gp96_抗原复合物。以该gp96-肺癌抗原复合物单独免疫(对照组▲)或者联合低剂量环磷酰胺预处理(实验组?)或者小鼠肝脏来源gp96复合物(阴性对照■)免疫人HLA转基因小鼠(Balb/cHU2+小鼠)获得肺癌特异的脾脏淋巴细胞。将获得的淋巴细胞分别转输PC-9细胞皮下接种荷瘤14天的裸鼠作为实验组、对照组、阴性对照组(n=20)，每周转输一次，共3周。检测肿瘤大小，如图所示低剂量环磷酰胺预处理明显的加强了小鼠对肺癌的特异性免疫反应(图6)。[0037]实施例9.改进的胃癌患者免疫自体gp96_抗原复合物治疗肿瘤该研究中入组的gp96免疫治疗的胃癌患者的治疗为一周一个疗程,每个疗程注射一次。试验组在术后8周内在常规治疗的基础上开始自体gp96免疫治疗。[0038]操作流程i患者入选:初发III期或IV期的胃癌患者，可进行根治性手术。[0039]ii肿瘤组织中gp96_肿瘤抗原复合物的纯化按照孟颂东等发表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化。首先通过ConA柱亲和层析,再通过HitrapQ柱离子交换洗脱，得到纯度95%以上gp96蛋白。[0040]考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，每份样本的蛋白提取量应能满足10个疗程的治疗需要。[0041]蛋白应满足疫苗的微生物要求(检测方法参照生物制品规程)。[0042]蛋白的内毒素含量需满足疫苗制剂的要求(鲎试剂法检测)。[0043]iiigp96_肿瘤抗原复合物的使用患者在手术后8周内接受第一次免疫治疗。每次免疫前I天，静脉注射环磷酰胺，然后三角肌部位皮下或腹部皮下注射自体gp96复合物，每周I次。[0044]IV免疫学指标检查以自体肿瘤裂解液及自体gp96复合物抗原为刺激物检测自体肿瘤特异性T细胞活性。比较胃癌患者免疫前后特异性T细胞活性，发现自体gp96复合物免疫显著激活了患者特异性T细胞，预示了良好的预后。[0045]V随访注射完成后，于3个月、6个月、I年、I年半、2年时各访视I次；之后每半年访视I次，直至患者复发或死亡。[0046]①2年内每3个月复查I次:a)第3、9、15、21月复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CA-724、CA-125、CEA)；腹、盆腔B超；胸部X线。[0047]b)第6、12、18、24月复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CA-724、CA-125,CEA)；胸、腹、盆腔增强CT;胃镜。[0048]②2年后每6个月复查I次，复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CA-724、CA-125,CEA)；胸、腹、盆腔增强CT;胃镜。[0049]患者随访期间疾病复发，达到研究终点，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范(如NCCN指南等)给予其他治疗。[0050]实施例10.改进的食管癌患者免疫自体gp96_抗原复合物治疗肿瘤该研究中入组的gp96免疫治疗的食管癌患者需完成8个疗程的治疗。一周为一个疗程,每个疗程注射一次。试验组在术后8周内开始自体gp96免疫治疗。[0051]操作流程选取计划行手术的I1、III期食管癌患者或I1、IIIA期肺癌患者；获得患者自愿签署的“知情同意书”以及“手术同意书”;行术前全面检查以明确根治性手术可行性；手术切取肿瘤组织:a)将组织存放于无菌管中；b)存有肿瘤组织的无菌管在0°C条件下于2个小时内送至GMP制备车间。[0052]鉴定肿瘤组织质量，确认可以提取足量的热休克蛋白gp96_多肽复合物；热休克蛋白gp96-多肽复合物提取及检测；改进的gp96治疗及常规治疗；改进的热休克蛋白gp96-多肽复合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0053]b)免疫增强预处理:每次gp96注射前1-3天给患者静脉注射低剂量环磷酰胺以抑制Treg细胞功能。[0054]c)由研究护士进行gp96蛋白注射，根据既往国外研究资料制定剂量，加入生理盐水混匀后上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0055]d)第1、2次免疫蛋白注射后，需留院观察24小时，后几次注射后需观察I小时，无不良反应后方可离开。[0056]e)第2次及最后一次注射后3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0057]f)免疫治疗前及免疫结束后,采集1ml患者血液,进行免疫学指标的测定。[0058]若患者治疗期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范给予相应治疗；随访:术后2年内每3月访视I次，2年后每6月访视I次，直至患者疾病复发或死亡，具体访视内容如下:①2年内每3个月复查I次:a)第3、9、15、21月复查内容:肿瘤标志物(CA19-9、CEA、P53、SCG)；食道X线钡透；胸部X线正侧位片；腹部B超。[0059]b)第6、12、18、24月复查内容:肿瘤标志物(CA19-9、CEA、P53、SCG)；胸、腹部CT；胃镜。[0060]②2年后每6个月复查I次，复查内容:肿瘤标志物(CA19-9、CEA、P53、SCG)；胸、腹部CT；胃镜。[0061]若患者随访期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范(如NCCN指南等)给予相应治疗。[0062]实施例11.改进的肺癌患者免疫自体gp96_抗原复合物治疗肿瘤肺癌患者术后接受gp96治疗及医生常规治疗(放化疗)。该研究中入组的gp96免疫治疗为一周一个疗程，每个疗程皮下注射一次自体gp96复合物。[0063]操作流程选取计划行手术的I1、IIIA期肺癌患者；获得患者自愿签署的“知情同意书”以及“手术同意书”;行术前全面检查以明确根治性手术可行性；手术切取肿瘤组织；a)将组织存放于无菌管中；b)存有肿瘤组织的无菌管在0°C条件下于2个小时内送至GMP制备车间。[0064]鉴定肿瘤组织质量，确认可以提取足量的热休克蛋白gp96_多肽复合物；热休克蛋白gp96-多肽复合物提取及检测；改进的gp96治疗及常规治疗；改进的热休克蛋白gp96-多肽复合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0065]b)免疫增强预处理:每次gp96注射前1-3天给患者静脉注射低剂量环磷酰胺。[0066]c)由研究护士进行gp96蛋白注射，根据既往国外研究资料制定剂量，加入生理盐水进行稀释，混匀后上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0067]d)第1、2次免疫蛋白注射后，需留院观察24小时，后几次注射后需观察I小时，无不良反应后方可离开。[0068]e)第2次及最后一次注射后3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0069]f)免疫治疗如及免疫结束后，米集1ml患者血液,进打免疫学指标的测定。[0070]若患者治疗期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范给予相应治疗；随访；术后2年内每3月访视I次，2年后每6月访视I次，直至患者疾病复发或死亡，具体访视内容如下:①2年内每3个月复查I次:a)第3、9、15、21月复查内容:肿瘤标志物(CA19-9、CEA、CA125);胸部CT、腹部B超。[0071]b)第6、12、18、24月复查内容:肿瘤标志物(CA19-9、CEA、CA125);胸部CT、腹部B超；头颅CT、骨扫描(ECT)。[0072]②2年后每6个月复查I次，复查内容:肿瘤标志物(CA19-9、CEA、CA125);胸部CT、腹部B超；头颅CT、骨扫描(ECT)。[0073]若患者随访期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范(如NCCN指南等)给予相应治疗。[0074]实施例12.改进的神经胶质瘤患者免疫自体gp96_抗原复合物治疗肿瘤该研究中入组的gp96免疫治疗的神经胶质瘤患者完成6个疗程的治疗。一周为一个疗程，每个疗程注射一次。试验组在术后12周后进行常规治疗及gp96自体免疫治疗。[0075]操作流程i患者入选:初发幕上神经胶质瘤，接受根治手术，切除率大于80%。[0076]ii肿瘤组织中gp96_肿瘤抗原复合物的纯化按照孟颂东等发表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化,通过ConA柱亲和层析、HitrapQ柱离子交换纯化得到纯度95%以上gp96蛋白。[0077]考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，蛋白提取量应足够完成6个疗程。[0078]样品应满足疫苗应用的微生物要求。[0079]样品应满足疫苗应用的内毒素含量要求。[0080]gp96样品应具有生物活性。[0081]iii改进的gp96_肿瘤抗原复合物的使用流程患者在手术后应接受I个月的冋步放化疗治疗，在冋步放化疗结束之后、术后12周之前开始接受第一次免疫治疗。免疫治疗每7天I次,至少注射6次。[0082]每次疫苗注射前I天，患者接受静脉注射低剂量环磷酰胺以抑制Treg细胞功能。[0083]三角肌部位皮下或腹部皮下注射自体gp96_抗原复合物。[0084]IV免疫学指标检查以自体肿瘤裂解液及自体gp96复合物抗原为刺激物检测自体肿瘤特异性T细胞活性。比较神经胶质瘤患者免疫前后特异性T细胞活性，发现自体gp96复合物免疫显著激活了患者特异性T细胞，预示了良好的预后。[0085]V随访注射完成后，于3个月、6个月、I年、I年半、2年时各访视I次；之后每半年访视I次，直至患者复发或死亡。[0086]复查内容:①影像学检查:头颅核磁共振(MRI)及头颅强化MRI；②临床神经功能检测:感觉、运动、视觉、KPS评分；③注射部位过敏反应检测:观察注射部位皮肽情况；④自身免疫性甲状腺炎检测:当患者出现自身免疫性甲状腺炎的临床症状时，进行甲状腺检测。[0087]实施例13.改进的结直肠癌患者免疫自体gp96_抗原复合物治疗肿瘤该研究中入组的gp96免疫治疗的II1、IV期结直肠癌患者术后接受gp96治疗及医生常规治疗(放化疗)。一周为一个疗程，每个疗程注射一次。试验组在术后8周内在常规治疗的基础上开始自体gp96免疫治疗。[0088]操作流程选取计划行手术的II1、IV期的结直肠癌患者；获得患者自愿签署的“知情同意书”以及“手术同意书”;行术前全面检查以明确根治性手术可行性；手术切取肿瘤组织:a)将组织存放于无菌管中；b)存有肿瘤组织的无菌管在0°C条件下于2个小时内送至GMP制备车间。[0089]鉴定肿瘤组织质量，确认可以提取足量的热休克蛋白gp96_多肽复合物；热休克蛋白gp96-多肽复合物提取及检测；改进的gp96治疗及常规治疗；热休克蛋白gp96-多肽复合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0090]b)免疫增强预处理:每次gp96注射前1-3天给患者静脉注射环磷酰胺。[0091]c)由研究护士进行gp96蛋白注射，根据既往国外研究资料制定剂量，加入生理盐水混匀后上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0092]d)第1、2次免疫蛋白注射后，需留院观察24小时，后几次注射后需观察I小时，无不良反应后方可离开。[0093]e)第2次及最后一次注射后3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0094]f)免疫治疗如及免疫结束后，米集1ml患者血液，进彳了免疫学指标的测定。[0095]若患者治疗期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范给予相应治疗；随访；术后2年内每3月访视I次，2年后每6月访视I次，直至患者疾病复发或死亡，具体访视内容如下:①2年内每3个月复查I次:a)第3、9、15、21月复查内容:肿瘤标志物(CEA、CA19-9、AFP)；腹、盆腔B超；胸部X线。[0096]b)第6、12、18、24月复查内容:肿瘤标志物(CEA、CA19-9、AFP)；胸、腹、盆腔增强CT;结肠镜。[0097]②2年后每6个月复查I次，复查内容:肿瘤标志物(CEA、CA19-9、AFP)；胸、腹、盆腔增强CT;结肠镜。[0098]若患者随访期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范(如NCCN指南等)给予相应治疗。[0099]实施例14.改进的肝癌患者免疫自体gp96_抗原复合物治疗肿瘤该研究中入组的gp96免疫治疗的肝癌患者进行的gp96治疗为一周一个疗程,每个疗程皮下注射一次自体gp96复合物。试验组在术后8周内开始自体gp96免疫治疗。[0100]1.选取计划行手术肝癌患者；2.获得患者自愿签署的“知情同意书”以及“手术同意书”;3.行术前全面检查以明确根治性手术可行性；4.手术切取肿瘤组织，将组织存放于无菌管中，存有肿瘤组织的无菌管在(TC条件下于2个小时内送至GMP制备车间。[0101]5.鉴定肿瘤组织质量，确认可以提取足量的热休克蛋白gp96-多肽复合物；6.热休克蛋白gp96_多肽复合物提取及检测:按照孟颂东等发表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化,通过ConA柱亲和层析结合HitrapQ柱离子交换方法纯化得到纯度95%以上gp96蛋白。[0102]考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，每份样本的蛋白提取量应能满足6个疗治的治疗需要。[0103]微生物检测，应满足对蛋白疫苗制品的要求(参照生物制品规程)。[0104]内毒素检测，应满足对蛋白疫苗制品的内毒素含量要求(鲎试剂法)。[0105]7.改进的gp96治疗及常规治疗:热休克蛋白gp96-多肽复合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0106]b)免疫增强预处理:每次gp96注射前1-3天给患者静脉注射环磷酰胺。[0107]c)由研究护士进行gp96蛋白注射，根据既往国外研究资料制定剂量，加入生理盐水混匀后上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0108]d)第1、2次免疫蛋白注射后，需留院观察24小时，后几次注射后需观察I小时，无不良反应后方可离开。[0109]e)第2次及最后一次注射后3天内需检查血常规、血生化及心电图。[0110]f)免疫治疗如及免疫结束后，米集1ml患者血液，进彳丁免疫学指标的测定:以自体肿瘤裂解液、自体gp96复合物抗原以及乙肝抗原肽、gp96-乙肝抗原肽复合物为刺激物检测自体肿瘤特异性T细胞活性。比较患者免疫前后特异性T细胞活性，发现自体gp96复合物免疫显著激活了患者特异性T细胞，预示了良好的预后。[0111]患者治疗期间疾病复发，则需终止治疗，退出研究。由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范(如NCCN指南等)给予其他治疗。[0112]8.随访:随访至患者疾病复发或死亡，最长随访期为2年，2年后患者正常随访。术后2年内，每3月访视I次，具体访视内容如下:a)第3、9、15、21月复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CEA、AFP)；腹、盆腔B超；胸部X线；b)第6、12、18、24月复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CEA、AFP)；胸、腹、盆腔增强CT;患者随访期间疾病复发，由研究者详实记录患者疾病复发情况，并按照临床诊疗规范(如NCCN指南等)给予其他治疗。[0113]实施例15.改进的胰腺癌患者免疫自体gp96_抗原复合物治疗肿瘤该研究中入组的gp96免疫治疗的胰腺癌患者进行的gp96治疗为一周皮下注射一次自体gp96复合物。试验组在术后8周内开始自体gp96免疫治疗。[0114]操作流程:i患者入选:初发可根治性切除的胰腺癌患者。[0115]ii肿瘤组织中gp96_肿瘤抗原复合物的纯化按照孟颂东等发表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化,通过ConA柱亲和层析结合HitrapQ柱离子交换方法纯化得到纯度95%以上gp96蛋白。[0116]考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，每份样本的蛋白提取量应能满足6个疗治的治疗需要。[0117]微生物检测，应满足对蛋白疫苗制品的要求(参照生物制品规程)。[0118]内毒素检测，应满足对蛋白疫苗制品的内毒素含量要求(鲎试剂法)。[0119]iii优化的gp96_肿瘤抗原复合物的使用患者在手术后8周内接受第一次免疫治疗。每次免疫前I天，静脉注射环磷酰胺，然后三角肌部位皮下或腹部皮下注射自体gp96复合物。每周I次。[0120]IV免疫学指标检查以自体肿瘤裂解液、自体gp96复合物抗原为刺激物检测自体肿瘤特异性T细胞活性。比较胰腺癌患者免疫前后特异性T细胞活性，发现自体gp96复合物免疫显著激活了患者特异性T细胞，预示了良好的预后。[0121]V随访注射完成后，于3个月、6个月、I年、I年半、2年时各访视I次；之后每半年访视I次，直至患者复发或死亡。[0122]①2年内每3个月复查I次:a)第3、9、15、21月复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CEA、AFP)；腹、盆腔B超；胸部X线；b)第6、12、18、24月复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CEA、AFP)；胸、腹、盆腔增强CT;②2年后每6个月复查I次，复查内容:肿瘤标志物(CA-199、CEA、AFP)；胸、腹、盆腔增强CT。[0123]实施例16.ELISP0T法检测特异性T细胞ELISP0T检测肿瘤患者PBMC中肿瘤特异性CTL。按照ELISP0T试剂盒的说明书操作。先用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基封闭ELISP0T预包被板一小时，临用前倒掉封闭液，加入10uL含3X15的人的PBMC(直接用新鲜的PBMC或者将PBMC体外扩增培养7天)。实验组中加入20mg/mL的肿瘤裂解液离心上清、阳性对照加入4mg/mL的PHA进行刺激，阴性对照加入癌旁组织裂解液(20mg/mL)。在细胞培养箱内培养18小时后，检测特异性斑点的形成，并进行统计分析。通过ELISP0T方法可以检测患者新鲜血液中肿瘤抗原特异性CTL，特异性CTL的频率通过计数斑点数量来确定。在20例经自体gp96复合物免疫的胃癌患者中均检测到高频率肿瘤抗原特异性CTL，且比免疫前有显著的提高；同时免疫后针对癌旁组织抗原的T细胞仍然很弱，和免疫前相当。结果说明自体gp96复合物免疫有良好的有效性和安全性(图9)。【权利要求】1.在肿瘤临床个体化免疫治疗方案中使用调节性T细胞抑制药物提高临床治疗效果的方法。2.权利要求1中所述调节性T细胞抑制药物为环磷酰胺。3.权利要求1中所述肿瘤临床个体化治疗方案为:从肿瘤患者手术切除的肿瘤组织中纯化自体gp96-肿瘤抗原复合物；肿瘤患者手术后8周内开始皮下注射该自体复合物,每7天注射I次，至少注射6次。4.权利要求1中所述调节性T细胞抑制药物使用方法为每次注射抗原复合物前1-3天内静脉注射400mg环磷酰胺。5.权利要求3所述肿瘤患者种类为食管癌患者、肺癌患者、胰腺癌患者、结肠癌患者、直肠癌患者、肝癌患者、肾癌患者、胃癌患者、神经胶质瘤患者等。6.权利要求3种所述抗原复合物纯化过程为:a)将权利5中所述组织在NaHC03中机械研磨破碎、高速离心制备组织裂解液b)将步骤a)中组织裂解液pH调节到7.5;以0.15cm/min的径流速上样到ConA亲和层析柱；以0.15cm/min的径流速冲洗ConA层析柱30倍层析柱柱体积200mMPBS溶液；以.0.15cm/min的径流速洗脱ConA层析柱亲和组分，洗脱缓冲液为浓度100g/L的α-甲基葡萄糖苷200mMPBS溶液，洗脱体积为3倍层析柱柱体积，洗脱过程为洗脱液洗脱2体积、停滞40分钟、洗脱液洗脱I体积、200mMPBS溶液洗脱I体积c)将b)中的4体积洗脱液以1.2cm/分钟的径流速上样到HitrapQ强阴离子层析柱；以1.2cm/分钟的径流速冲洗杂蛋白，缓冲液依次分别是PB2个层析柱柱体积、200mMPBS.10个层析柱柱体积、300mMPBS30个层析柱柱体积；以1.2cm/分钟的径流速洗脱目标组分，缓冲液为600mMPBS,洗脱4个层析柱柱体积d)步骤c)中得到的洗脱组分即为目的自体gp96抗原复合物。【文档编号】A61P35/00GK104306976SQ201410534622【公开日】2015年1月28日申请日期:2014年10月13日优先权日:2014年4月26日【发明者】黄锡坚,张小俊,高华申请人:深圳市康尔诺生物技术有限公司