热休克蛋白gp96的疫苗接种及其使用方法

专利名称：热休克蛋白gp96的疫苗接种及其使用方法
技术领域：
本发明涉及医学、免疫学和肿瘤学领域。更具体而言，本发明涉及用于诱导动物受 治疗者中针对肿瘤的免疫应答的方法和组合物。背景抗肿瘤疫苗接种当施用至首次用于实验的无肿瘤小鼠时是相当有效的，在随后的 攻击之后产生免于肿瘤生长的保护。保护总体上是持久的且是肿瘤特异性的，表明适应性 免疫应答的参与。当疫苗用于已形成的肿瘤的治疗性处理时，这种景象从根本上改变。能 够有效建立保护性免疫的相同剂量的疫苗一般不能提供治疗益处。这种缺乏治疗性疫苗接 种的疗效的原因被认为是由肿瘤诱导的抑制性细胞的诱导、调节性细胞的产生、T细胞无反 应性或耐受的诱导、或这些机制的组合引起的。无论肿瘤引导的免疫抑制的确切机制是什 么，用于癌症治疗的疫苗疗法的成功将取决于战胜或中和这些肿瘤引导的抑制作用。位于内质网(ER)的热休克蛋白(hsp)gp96被认为用作在到达MHCI类分子和II 类分子途中的肽的蛋白伴侣。gp96陪伴的肽包括全部范围的在细胞中产生并运输到ER中 的肽和较大蛋白片段。从肿瘤细胞获得并用作疫苗的gp96大概通过运输肿瘤特异性肽至 APC 来诱导特异性肿瘤免疫。参见 J Immunol. 1999 Nov 15 ；163(10) :5178_82。本申请中描述的发明提供了抗肿瘤组合物。热休克蛋白糖蛋白(gp)96相关 肽被树突细胞交叉递呈至CD8细胞。研发了适于抗肿瘤治疗的疫苗接种系统。参见J Immunother. 2008 May ；31(4) :394_401和其中引用的参考文献。将gp96_免疫球蛋白(Ig) Gl-Fc融合蛋白转染到肿瘤细胞中导致与陪伴的肿瘤肽相复合的gp96-Ig的分泌。分泌 gp96-Ig的肿瘤的胃肠外施用引发与先天免疫系统激活相联合的强健的抗原特异性CD8细 胞毒性T淋巴细胞扩增。分泌gp96的肿瘤引起树突细胞(DC)和自然杀伤(NK)细胞向分 泌gp96的部位募集并通过结合CD91和Toll样受体-2和Toll样受体-4介导DC的激活。 gp96及其陪伴的肽的胞吞摄取引发肽通过主要组织相容性复合体(MHC) I类的交叉递呈以 及不依赖CD4细胞的强的同源CD8的激活。在该模型系统中，通过使用过继转移的、T细胞 受体(TCR)转基因的、绿色荧光蛋白(GFP)标记的CD8T细胞可以在疫苗接种4至5天内对 ⑶8 CTL扩增进行精确定量。概述本发明提供了被基因修饰以表达编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp96多肽的 核酸的肿瘤细胞。本发明还提供了通过施用被基因修饰以表达编码分泌形式的gp96多肽的核酸的肿瘤细胞来刺激对包括癌症肿瘤在内的肿瘤的免疫应答的方法。优选地，所述免 疫应答是保护性免疫应答。优选地，所述肿瘤细胞是异基因肿瘤细胞。本发明另外提供了通 过施用被基因修饰以表达分泌形式的gp96多肽的肿瘤细胞如癌症肿瘤细胞来抑制包括癌 症在内的肿瘤的方法。优选地，所述肿瘤细胞是异基因肿瘤细胞。本发明另外提供制造针 对癌症的疫苗的方法，该方法包括基因修饰癌细胞群以表达编码核酸的肿瘤细胞，所述肿 瘤细胞用包含编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp9多肽的核酸的真核表达载体转染。本 发明另外提供了在人类受治疗者中产生保护性免疫应答的方法，该方法包括向该受治疗者 施用有效量的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp96多肽 的核酸的真核表达载体转染。根据一些优选的实施方案，gp96多肽是包含gp96多肽和免疫球蛋白信号肽 (IgSP)的融合蛋白。任选地，IgSP选自由小鼠IgSP、大鼠IgSP、猪IgSP、猴IgSP、人IgSP 组成的组。 根据一些优选的实施方案，gp96免疫被频繁地施用(例如，每天一次或每天两次) 大约1天到大约6个月的一段时间。根据其他优选的实施方案，治疗性组合物以每剂20mg 至2000mg的剂量被胃肠外施用。根据一些优选的实施方案，将gp96免疫与破坏正常的和/或恶性的B淋巴细胞的 一种或多种化合物、或者用来治疗以具有太多B细胞、活动过度的B细胞或功能失常的B细 胞为特征的疾病的一种或多种化合物联合施用。这些疾病包括肿瘤疾病，诸如白血病或淋 巴瘤。优选地，破坏B细胞的化合物是抗体。在某些实施方案中，抗体选自低于人类的灵长 类抗体、鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在其他实施方案中，抗体结合的B 细胞抗原选自 CD19、CD20、CD22、HLA-DR 和 CD74。附图描述

图1A-F. gp96-Ig转染的E.G7(A)和LLC (B)减少的致肿瘤性。Gp96_Ig转染 的；〇，模拟品转染的；以及□，未转染的细胞。每剂量接种细胞使用每组六只小鼠。C-F， 分泌型gp96-Ig的疫苗接种产生肿瘤特异性记忆。以两周一次的间隔用IO6个gp96-Ig转 染的E. G7(在所有图中· )、106个受辐照的E. G7( □)免疫两次，或者不免疫(OC57BL/6 小鼠。两周以后，用各图中标出的肿瘤细胞数攻击小鼠(每组六只小鼠)。未形成肿瘤的小 鼠被观察3个月，然后判定为无肿瘤。图2A-C. A，在敏化阶段免疫活性细胞的耗竭(cbpletion)对排斥IO6个 E.G7-gp96-Ig的作用；对照接受PBS。示出了个体小鼠的肿瘤生长曲线。耗竭时间表以 简图方式示于顶部。免疫活性细胞的耗竭是在接种IO6E. G7-gp96-Ig前2天用抗CD8、抗 ⑶4、或角叉菜聚糖完成的。B，⑶4缺陷的小鼠能够排斥E.G7-gp-Ig。用未受辐照的IO6E. G7-gp96-Ig经皮下攻击五只⑶4缺陷的小鼠。记录肿瘤生长，并报告平均肿瘤直径。C，免 疫活性细胞的耗竭对E.G7排斥的效应阶段的作用。免疫和免疫耗竭的时间表以简图方式 示于顶部。对于免疫，将IO6个未辐照的E. G7-gp96-Ig经皮下接种到六只小鼠的各组中两 次。在用IO6E. G7攻击前三天，如上耗竭免疫细胞；对照接受PBS。记录肿瘤生长，并报告为 平均肿瘤直径。图3A-B. gp-96介导的CD8T细胞的交叉敏化(cross-priming)在不存在CD4细胞 时增强，但不受⑶40L的缺失影响。小鼠经静脉注射接受1百万的GFP-OT-I，并在2天后用4百万EG7-gp96-Ig腹腔内免疫。在另外5天后从腹膜腔(PC)收集细胞并通过FACS分析 ⑶8门(gate)中的GFP-OT-I频率。将值表达为PC中的GFP-OT-I的绝对数。A，与野生型 小鼠比较的⑶4缺陷的小鼠。B，⑶40L缺陷的小鼠。 图4A-C. gp96介导的CD8T细胞的交叉敏化需要CD80和CD86并且不依赖于NKT 细胞。小鼠经静脉注射接受1百万的GFP-OT-I，并在2天后用4百万EG7-gp96-Ig(A和C) 或2百万3T3-0VA-gp96-Ig(B)腹腔内免疫。在另外5天后从脾脏(SP)或PC收集细胞并 通过FACS分析⑶8门中的GFP-OT-I频率。A，⑶80或⑶86单缺陷；B，⑶80/⑶86双缺陷； 以及C，NKT缺陷(Jal8敲除)。图5A-C.在不存在淋巴结时gp96的有效交叉敏化。A，LT α缺陷，代表性FACS数 据。小鼠经静脉注射接受1百万的GFP-0T-I，并在2天后用2百万3T3-0VA-gp96-Ig腹 腔内免疫。在另外5天后从指定部位收集细胞并通过FACS分析⑶8门中的GFP-OT-I频 率。B，相同的数据呈现为直方图。数据代表两个独立的实验，每个条代表两只小鼠的平均 值士SE。C，3T3-0VA-gp96-Ig对OT-I的先体外后体内交叉敏化。从早三天腹腔内注射 3T3-0VA-gp96-Ig、3T3-gp96-Ig或3T3的小鼠中收集的PEC与CFSE标记的OT-I —起以 1 IOU 100和1 1000的OT-I PEC比率孵育72小时(a-f)。作为另外的对照， 3T3转染子也在体外直接与OT-I —起孵育。细胞用抗CD8-PE染色并分析CFSE稀释，将其 在b-h中作图。图6A-B. gp96-0VA对⑶8T细胞的交叉敏化比通过EG7-Kb_°VA的抗原递呈的直接敏 化更有效。小鼠经静脉注射接受1百万的GFP-0T-I，并在2天后用2百万EG7-gp96-Ig或 EG7腹腔内免疫。A，在免疫之前(免疫前)和在免疫后5天从PC收集细胞并且通过FACS 分析CD8门中的GFP-OT-I频率。B，在EG7-gp96_Ig和EG7免疫后在PC和脾脏中GFP-OT-I 扩增的动力学；对给定部位的GFP-OT-I总数作图。图7A-B.先天免疫细胞被gp96增加募集到PC中。一百万OT-I被静脉注射转移， 在第-2天和第2天后，4百万EG7或EG7gp96-Ig细胞被腹腔内注射。在表明的天数从PC 中收集细胞并通过流式细胞术进行表型分析。A，通过注射EG7-gp96-Ig对⑶11c+、NKl. I+ 和F4/80 (F4/80dim)细胞的募集。F4/80s (F4/80toight)细胞在免疫之前存在于PC中，并且 免疫后数目不改变。B，由EG7和EG7-gp96-Ig将细胞募集到PC中的比较。图8A-C. gp96分泌介导DC和⑶8细胞的增殖并激活PC中的NK细胞。小鼠经静脉 注射接受1百万的GFP-OT-I，并在2天后用4百万EG7-gp96-Ig或EG7腹腔内免疫。A，通 过在用4X 106EG7或EG7-gp96-Ig免疫后2天和4天的PC、肠系膜和主动脉旁淋巴结(dL) 以及脾脏(SP)中的BrdU染色所测量的⑶Ilc+细胞的增殖。⑶Ilc+细胞被门圈出并通过 细胞内染色分析BrdU。注意到CDllc+增殖(红色线纹的)只在第二天的PC中并且只在 EG7-gp96-Ig施用后。从免疫之日小鼠接受饮用水中的BrdU。B，通过BrdU摄取测量的CD8 增殖只在第2天的PC中(红色线纹的)以及只在gp96敏化后可检测到。在EG7-gp96-Ig 免疫后第4天在PC中强的CD8增殖；dLN，引流淋巴结(主动脉旁的、肠系膜的)；ndLN，非弓丨 流淋巴结(腹股沟的)。C，如通过CD69上调所测量的，由EG7-gp96-Ig免疫对PC中NKl. 1 细胞的激活。A-C代表三个独立实验。图9A-B.与无卵白蛋白相比，gp96陪伴的卵白蛋白(OVA)对⑶8T细胞的交叉敏 化增强。C57BL/6小鼠经静脉注射接受1百万GFP-OT-I ；2天后，用不同数目的同基因的EG7-gp96-Ig或异基因3T3-0VA或3T3-0VA-gp96_Ig或用PBS中的OVA蛋白经腹腔内免疫 它们。调整腹腔内注射的细胞数目以产生如在χ轴上所标出的24小时内分泌的gp96-Ig 或OVA的数量。OVA和gp96-Ig分泌分别是在体外通过ELISA确定的。GFP-OT-I扩增是 在PC中免疫后第5天通过流式细胞术确定的。A，对EG7-gp96-Ig和OVA蛋白作出应答的 GFP-OT-I 扩增。B，对 3T3-0VA、3T3-0VA-gp96-Ig 和 OVA 蛋白作出应答的 GFP-0T-I 扩增。图10A-B. gp96是用于蛋白交叉敏化的佐剂并且当连续释放时最有效地发挥作 用。A，小鼠经静脉注射接受1百万GFP-0T-I，并在2天后如所示被腹腔内免疫。在免疫后 4天通过FACS测量体内GFP-OT-I扩增。通过ELISA对来自注射细胞的分泌产物体外定量。 所指出的分泌产物的量是指在24小时内由注射的细胞数目在培养物中分泌的量。注意到 50 μ g OVA连同200ng从3T3-gp96_Ig细胞分泌的gp96 —起造成的GFP-OT-I扩增比从 3T3-0VA-gp96-Ig分泌的含有大约0. 1% gp96_0VA的200ng gp96_Ig小。B，小鼠经静脉注 射接受1百万GFP-OT-I。两天后，用200ng从上清3T3-0VA gp96_Ig培养物收集的可溶性 gp96-Ig或用随后24小时内分泌200ng gp96_Ig的3T3-gp96_Ig细胞数腹腔内免疫它们。 在PC中的GFP-OT-I扩增是在免疫后第4天通过流式细胞术确定的。图11A-D.远端的已形成的肿瘤对OT-I CTL扩增的抗原非特异性抑制。A，在未免 疫小鼠、在免疫的无肿瘤小鼠以及在免疫的荷EG7肿瘤小鼠的腹膜腔中OT-I CD8 CTL频率 的比较。将一百万EG7肿瘤细胞经皮下移植在胁腹b 中，并允许其在用EG7-gp96-Ig免疫前长 成5天。在免疫前2天将一百万OT-I⑶8 T细胞经静脉内过继转移。用2百万EG7-gp96-Ig 经腹膜内免疫小鼠。5天后通过流式细胞术分析腹膜细胞。B，形成的肿瘤对OT-I扩增的抑 制是抗原非特异性的。不表达卵白蛋白的EL4和LLC形成5天代替EG7。OT-I过继转移和 疫苗接种如在A中那样进行。C，在不存在或存在形成的肿瘤的情况下(与B相同的实验) 在腹膜腔疫苗接种部位中积累的OT-I绝对数。D，通过EG7-gp96-Ig免疫募集到腹膜腔的 总细胞数在存在形成的肿瘤的情况下增加。示出3个或更多个别实验的代表性实验。在每 组中N = 3到5只小鼠。通过t检验计算图中标出的显著性值。阴性对照是未免疫的小鼠 (免疫前)并且阳性对照是胁腹中没有外周肿瘤的小鼠。CTL表示细胞毒性T淋巴细胞；gp， 糖蛋白；Ig，免疫球蛋白；LLC，Lewis肺癌。图12A-D.频繁的gp96免疫能够战胜肿瘤引导的免疫抑制。A，将一百万EG7肿瘤 细胞经皮下移植在胁腹中。通过腹腔内施用一百万EG7-gp96-Ig或受辐照的EG7进行的免 疫开始于肿瘤移植同一天或在肿瘤移植后2天或4天。阴性对照-无治疗，η= 17 ；受辐照的 EG7免疫，η = 15。在不同的时间表用EG7-gp96_Ig免疫，η = 15。B，除了腹腔内免疫开始 于第3天并且每天重复直至第14天(黑色箭头)以外，与A中相同。一百万EG7-gp96-Ig (η =17)或一百万LLC-gp96-Ig(n = 5)或受辐照的EG7(阴性对照，η = 5)或无治疗(阴性 对照，η = 19)。C，形成肿瘤5天，然后从第5天到第16天每天给予一次(黑色箭头)或两 次(红色箭头)用一百万EG7-gp96-Ig腹腔内免疫；在每组中n = 5。D，形成肿瘤7天，然 后从第7天到第18天每天给予一次(黑色箭头)或两次(红色箭头)每天一次或两次用 一百万EG7-gp96-Ig腹腔内免疫；在每组中η = 5。在肿瘤生长上的差异的显著性值在单 个图中标出，gp表示糖蛋白；Ig，免疫球蛋白；LLC，Lewis肺癌；ns，不显著。图13.频繁的免疫造成形成的LLC的肿瘤生长延缓。将LLC(105)经皮下移植在胁 腹中并使其形成3天。用一百万LLC-gp96-Ig(n = 15)、EG7-gp96_Ig(η = 5)或受辐照的LLC (η = 5)进行的免疫或无治疗(η = 19)开始于第3天并且在第7、10和14天重复。示 出了在19只未治疗的荷瘤小鼠和15只治疗的荷瘤小鼠之间的差异显著性(P = 0. 0234)， gp表示糖蛋白；Ig，免疫球蛋白；LLC，Lewis肺癌。图14A-B. B细胞抑制gp96介导的NK细胞向腹膜腔中募集和腹膜腔中DC的停留。 A，EG7-gp96-Ig免疫将B细胞，但仅适度的⑶5+B细胞募集到腹膜腔中。无瘤小鼠经腹腔 内接受一百万EG7-gp96-Ig，此后通过流式细胞术每天测定⑶5+和⑶5_B细胞的积累。代 表多于3个实验。B，在B细胞缺陷小鼠(BCDM)中NK细胞的募集与NK细胞和DC的滞留增 加及其通过过继转移B细胞的逆转。用2百万EG7-gp96-Ig以及从2天和4天后从腹膜腔 收集的细胞经腹腔内免疫野生型和BCDM，并通过流式细胞术分析。在用EG7-gp96-Ig免疫 前2天通过静脉内过继转移107野生型B细胞进行B细胞重建。代表3个实验。BCDM表 示B细胞缺陷的小鼠，DC，树突细胞，gp，糖蛋白；Ig，免疫球蛋白；NK，自然杀伤细胞，WTJf 生型。图15A-B.在不存在B细胞的情况下，gp96介导的0Τ-Ι⑶8 CTL扩增是增加的且 持久的。野生型小鼠和B细胞缺陷的小鼠接受一百万GFP-0T-I，B细胞重建的小鼠另外通 过静脉内过继转移接受一千万野生型B细胞。2天后用4百万EG7-gp96-Ig免疫小鼠，并且 在所指示的日期通过从腹膜腔(A)和肠系膜及主动脉旁淋巴结(dLN) (B)中收集细胞进行 分析。*通过重复测量的方差分析(ANOVA)P = 0.04。在每组中四只小鼠，代表3个实验。 ANOVA表示方差分析；CTL，细胞毒性T淋巴细胞；dLN，引流淋巴结；GFP绿色荧光蛋白；gp， 糖蛋白；Ig，免疫球蛋白；WT，野生型。图16A-B. gp96介导的肿瘤排斥在BCDM中增强并且被B细胞重建消除。A，野生型 小鼠。B，BCDM。将0. 2-mL PBS中的一百万LLC-ova细胞移植到胁腹中。五天后，静脉内给 予一百万0Τ-Ι。在肿瘤移植后七天，用一百万LLC-OVa-gp96-Ig腹腔内免疫小鼠。用二 维 测径器测量肿瘤大小。在每组中N = 5，代表3个实验。BCDM表示B细胞缺陷的小鼠；gp， 糖蛋白；Ig，免疫球蛋白；LLC，Lewis肺癌；PBS，磷酸盐缓冲盐水。图17A-C.高CTL前体频率和免疫增强在BCDM中由gp96疫苗引起的肿瘤排斥。 A，除了省略用LLC-OVa-gp96-Ig疫苗接种之外，BCDM如图6中那样处理。B，如在图6中那 样。省略OT-I转移。C，如在图16中那样，除外的是BCDM小鼠在肿瘤(LLC-ova)移植之前 用1千万B细胞重建。在每组中η = 5到6只小鼠，代表2个实验。BCDM表示B细胞缺陷 的小鼠；CTL，细胞毒性T淋巴细胞；gp，糖蛋白；Ig，免疫球蛋白；LLC，Lewis肺癌。图18 小B细胞群可能抑制针对LLC-ova肿瘤攻击的免疫应答。在LLC-ova移植四 天后(在OT-I注射前一天)，每只人⑶20转基因小鼠接受Img的利妥昔单抗(Rituximab )或PBS。处理后七天，通过流式细胞术检查PBL中⑶19+细胞的频率。在利妥昔单抗注 射后在PBL中剩下大约3%的⑶19+细胞群。每个条的数据是三只小鼠的平均值士 S. E.。详述根据一些优选的实施方案，本发明提供了在人类受治疗者中产生保护性免疫应答 的方法，该方法包括向该受治疗者施用有效量的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌 形式的热休克蛋白(hsp)gp96多肽的核酸的真核表达载体转染。根据一些优选的实施方案，一种制造针对癌症的疫苗的方法，该方法包括基因修 饰癌细胞群以表达编码核酸的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp96多肽的核酸的真核表达载体转染。根据一些优选的实施方案，本发明提供了刺激对肿瘤的免疫应答的方法，该方法 包括向该受治疗者施用有效量的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌形式的热休克蛋 白(hsp)gp96多肽的核酸的真核表达载体转染。根据优选的实施方案，本 发明提供了抑制肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗 者施用有效量的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp96多 肽的核酸的真核表达载体转染。gp96 多肽优选地，gp96多肽是野生型蛋白之一，并且优选地是野生型人gp96多肽。在本发 明中有用的gp96多肽还包括如下那些gp96多肽其具有的氨基酸序列与上述gp96多肽具 有实质相似性或同一性。优选地，所用的gp96多肽与本文描述或本领域已知的gp96多肽 具有至少70%、更优选85%、仍更优选90%或更进一步优选95%的同一性或相似性。最优 选地，所用的gp96多肽与野生型人gp96多肽具有至少99%的相似性或同一性。候选多肽与本发明的gp96多肽共有的同源性的程度是按照两条氨基酸序列之间 的相似性或同一性的程度确定的。高水平的序列同一性表明第一条序列来源于第二条序列的可能性。氨基酸序列 同一性要求在两条比对的序列之间相同的氨基酸序列。因此，候选序列与参考序列共有 70%氨基酸同一性要求在比对后该候选序列中70%的氨基酸与参考序列中的对应氨基酸 相同。同一性是通过计算机分析确定的，例如不限于ClustaIX计算机比对程序(Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, Jeanmougin F, & Higgins DG:" The ClustaIX windows interface :flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools (ClustaIX窗口界面通过质量分析工具辅助的多重序列比对的灵活策 略)〃 ；Nucleic Acids Res. 1997，25 (24) :4876_82)以及其中建议的缺省参数。使用该程 序，由本发明的类似DNA序列编码的多肽的成熟部分展现出与gp96多肽序列的氨基酸序列 至少70 %、更优选85 %、仍更优选90 %或更进一步优选95 %、最优选至少99 %的同一性程 度。本发明的gp96多肽包括变体多肽。在本发明的背景下，术语“变体多肽”包括具有 在一个或多个氨基酸位置与野生型gp96多肽不同的氨基酸序列的多肽(或蛋白)。这样的 变体多肽包括上述的修饰多肽、以及保守置换、剪接变体、同种型、来自其他物种的同源物、 以及多晶型物。如本文所定义的，术语“保守置换”表示一个氨基酸残基被另一个生物学上相似的 残基取代。通常，以上提到的生物学相似性反映了具有保守氨基酸的野生型序列上的置换。例如，将预期保守性氨基酸置换对生物活性具有很小的影响或没有影响，特别是 如果它们代表多肽或蛋白中小于10%的残基总数时。优选地，保守性氨基酸置换代表多肽 或蛋白的小于5%，最优选小于多肽或蛋白的2%的变化。在一个实施方案中的gp96多肽包括高达15个氨基酸置换。在另一个实施方案 中，gp96多肽包括高达12个氨基酸置换。在另一个实施方案中，gp96多肽包括高达10个 氨基酸置换。在另一个实施方案中，gp96多肽包括高达8个氨基酸置换。在另一个实施方 案中，gp96多肽包括高达5个氨基酸置换。在特别优选的实施方案中，在成熟序列中具有单个氨基酸置换，其中被置换的氨基酸和替代氨基酸是非环状的。具体保守置换的其他实 例包括一个疏水残基置换另一个疏水残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或 者一个极性残基置换另一个极性残基，例如精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸、或谷 氨酰胺置换天冬酰胺，以及类似置换。术语保守置换还包括使用置换的氨基酸残基取代未置换的亲本氨基酸残基，条件 是针对置换的多肽产生的抗体也与未置换的多肽免疫反应。这种一级氨基酸序列的修饰可能产生如下蛋白其具有与未修饰的对应蛋白相比 实质上等同的活性并因此认为是亲本蛋白的功能类似物。这些修饰可能是故意的，例如通 过定点诱变，或者它们可能自然地发生，并且包括剪接变体、同种型、来自其他物种的同源 物、以及多晶型物。根据本发明还可以涵盖这些功能类似物。

信号月太信号肽被包含在染色体DNA的编码部分中并且作为蛋白的一部分由核糖体装置 合成。信号肽一般组成N端并促使新合成的多肽被引导到粗面内质网中。此处，信号肽从 多肽上被切割，并且成熟的蛋白被分泌到周围环境中。因此，信号肽仍在细胞内部。信号肽_真核信号肽。真核信号肽是注定为分泌组分或为膜组分的蛋白上存在的 肽。它通常是蛋白的N端。在本背景下，认为在SignalP(版本2.0或优选版本3.0)中鉴 定的所有信号肽都是信号肽。哺乳动物信号肽是来源于通过ER分泌的哺乳动物蛋白的信号肽。根据本发明优选的实施方案，将gp96分子与信号肽(SP)相融合来产生gp96_SP 融合蛋白。根据本发明的表达载体包括核酸，所述核酸包含能够指导编码与gp96多肽可操 作地连接的信号肽的核苷酸序列的表达的启动子序列。信号肽可以是任何功能性信号肽，例如异源信号肽，如免疫球蛋白信号肽。信号肽 可以来自任何适宜物种，例如人、小鼠、大鼠、猴、猪。在一些实施方案中，免疫球蛋白信号肽(IgSP)是已知来自一大群哺乳动物的小 的19个氨基酸肽。优选地，IgSP是小鼠来源或人来源的，因为小鼠IgSP已知在小鼠、大鼠 和人类中有功能。对于在人类中使用，IgSP优选地是人来源的，以减少任何交叉物种副作 用的风险。优选地，IgSp为以下多种之一人 IgSP(Met Asp Cys Thr Trp Arg IleLeu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly Thr His Ala)；称猴(Macaca mulatta)(猴)IgSP(Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser)；普通狨 (Callithrix jacchus) (^)IgSP(Met Asp Trp Thr Trp Arg lie Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Ala His Ser)；小家鼠(Mus musculus)(小鼠)IgSP(Met Lys Cys Ser Trp Val lie Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser)；野猪(Sus scrofa) (猪)IgSP(Met Glu Phe Arg Leu Asn Trp Val Val Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gly Val Gln Gly)；以及褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)IgSP(Met Lys Cys Ser Trp lie lie Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Thr Gly Val Asn Ser)。信号肽的切割在确定具体的pg96形式并入表达构建体中之前，切割信号肽 例如IgSP的可能性可使用该领域预测工具的状况来检验。这样一种优选的预测工具 是在SignalP WWW服务器可得到的SignalP软件，或是优选的从同一服务器可得到的更新版本3. O。此外，有几篇描述用于选择信号肽的工具和技术的参考文献。这些参考 文献包括Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，Sren Brunak 禾口 Gunnar von Heijn e Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites (原核和真核信号肽的鉴定以及它们的切割位点的预测).Protein Engineering, 10，1-6 (1997)。对于 SignalP-HMM 输出模型Henrik Nielsen 和 Anders Krogh Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model (通过隐藏的Markov模型预测信号肽和信号锚).In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology(ISMB6) (在分子生物学智能系统第六次国际会议(ISMB 6)的会议记录中)，AAAI Press, Menlo Park, Calif. 122-130 ]λ (1998). Improved prediction of signal peptides-SignalP 3. 0(信号 Jft 的改进预测-SignalP 3. 0). Jannick Dyrlv Bendtsen, Henrik Nielsen, Gunnar von HeijnefPSren Brunak. J M B (2004). Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model (通过隐藏的Markov模型预测信号肽和信 号锚)· Henrik Nielsen 禾口 Anders Krogh. Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6)(在分子生物学 智能系统第六次国际会议(ISMB 6)的会议记录中)，AAAI Press, Menlo Park, Calif.，第 122-130页，1998。以上每篇文献都通过引用整体并入本文。施用根据一些优选的实施方案，gp96免疫被频繁地施用(例如，每天一次、每天两次、 每天三次等)大约1天到大约6个月的一段时间。根据一些实施方案，施用时间段为大约1 天到90天；从大约1天到60天；从大约1天到30天；从大约1天到20天；从大约1天到 10天；从大约1天到7天。根据一些实施方案，施用时间段为大约1周到50周；从大约1周 到50周；从大约1周到40周；从大约1周到30周；从大约1周到24周；从大约1周到20 周；从大约1周到16周；从大约1周到12周；从大约1周到8周；从大约1周到4周；从大 约1周到3周；从大约1周到2周；从大约2周到3周；从大约2周到4周；从大约2周到 6周；从大约2周到8周；从大约3周到8周；从大约3周到12周；或从大约4周到20周。联合治疗根据一些优选的实施方案，将gp96免疫与破坏正常的和/或恶性的B淋巴细胞的 一种或多种化合物、或者用来治疗以具有太多B细胞、活动过度的B细胞或功能失常的B细 胞为特征的疾病的一种或多种化合物(例如Rituximab )联合施用。这些疾病包括肿瘤 疾病，诸如白血病或淋巴瘤。优选地，所述用于治疗以为具有太多B细胞、活动过度的B细胞或功能失常的B 细胞特征的疾病的一种或多种化合物是靶向B细胞的抗体。参见，例如美国专利公开第 2003/0133930号，通过引用将其整体并入本文。优选地，靶向B细胞的抗体是针对B细胞抗 原的抗体，所述B细胞抗原例如⑶19、⑶20、⑶22、HLA-DR和⑶74。优选地，治疗性组合物 以每剂20mg至2000mg的剂量被胃肠外施用。根据一些实施方案，受治疗者接受胃肠外剂 量的抗体。根据一些实施方案，受治疗者以重复的胃肠外剂量接受抗体。根据一些实施方 案，抗体是低于人类的灵长类抗体、鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体之一。根 据一些实施方案，抗体是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体之一。
根据一些优选的实施方案，gp96免疫是与一种或多种抗癌剂联合施用。众多类型的抗癌剂是那些在本发明的方法中有应用的示例性抗癌剂。这些类别的抗癌剂以及它们优 选的作用机制在以下描述1 烷化剂一种将烷基给予核苷酸的化合物。烷化的DNA不能复制它本身并且细 胞增殖停止。这些化合物的实例包括但不限于白消安、配位金属络合物(例如，钼配位化 合物，如卡钼、奥沙利钼和顺钼)、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、双氯乙基甲 胺(氮芥)以及美法仑；2.双功能烷化剂具有与四碳烷基链的对侧端相连的两个不稳定的甲磺酸酯基 团的化合物。甲磺酸酯基团与癌细胞中的DNA相互作用并对其造成损坏，阻止其复制。这 些化合物的实例包括但不限于苯丁酸氮芥和美法仑。3.非留体芳香酶抑制剂抑制参与雌激素产生的酶芳香酶的化合物。因此，芳香 酶的阻断导致阻止雌激素产生。这些化合物的实例包括阿那曲唑和依西美坦。4.免疫治疗剂靶向癌细胞的抗体或抗体片段，所述癌细胞产生与恶性肿瘤相关 的蛋白。示例性免疫治疗剂包括靶向HER2或HER2/neu的赫赛汀，HER2或HER2/neu在大约 25%至30%的乳腺癌中以高数目发生；靶向结肠癌中的表皮生长因子受体(EGFR)的爱必 妥(Erbitux)；靶向结肠癌表达的血管表皮生长因子(VEGF)的阿瓦斯丁；以及引发B细胞 淋巴瘤凋亡的美罗华(Rituxan)抗CD20抗体。另外的免疫治疗剂包括免疫毒素，其中毒素 分子例如蓖麻毒蛋白、白喉毒素和假单胞菌毒素与识别肿瘤特异性抗原的抗体相轭合。轭 合可以通过生物化学方法或通过重组DNA方法来实现。5.亚硝基脲化合物抑制DNA修复所需的酶。这些剂能够前往大脑，所以它们用 于治疗脑肿瘤以及非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和恶性黑素瘤。亚硝基脲的实例包括卡 莫司汀和洛莫司汀。6.抗代谢药一类干扰DNA和核糖核酸(RNA)的合成的药物。这些剂是期特异性 的(S期)并且用于治疗慢性白血病以及乳房、卵巢和胃肠道的肿瘤。抗代谢药的实例包括 5_氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR )、阿糖胞苷(Ara-C)和氟达拉滨。7.抗肿瘤抗生素具有抗微生物活性和细胞毒活性的化合物。这些化合物也可以 通过化学方法抑制酶和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA。实例包括但当然不限于博来 霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星和手霉素(例如，手霉素A、C、D、 E和G以及它们的衍生物；参见例如美国专利第5，444，087号)。8.有丝分裂抑制剂能够抑制有丝分裂(例如微管蛋白结合化合物)或抑制阻止 细胞复制所需的蛋白合成的酶的化合物。有丝分裂抑制剂的实例包括紫杉烷类，例如紫杉 醇和紫杉萜、埃坡霉素、依托泊苷、长春碱、长春新碱以及长春瑞滨。9.放射治疗包括但不限于从外部供应源例如光束递送或通过植入小放射源递 送的X射线或γ射线。10.拓扑异构酶I抑制剂干扰拓扑异构酶活性由此抑制DNA复制的剂。这些剂 包括但不限于CPT-Il和托泊替康。11.激素治疗包括但不限于抗雌激素，例如它莫西芬；GNRH激动剂，例如柳普林 (Lupron)，以及黄体酮剂，例如甲地孕酮。自然地，通过广泛的多种机制发挥功能的其他类型抗癌剂在gp96免疫中和本发明的方法中有应用。其他这些剂包括例如亚叶酸；激酶抑制剂，例如易瑞沙(Iressa)和黄 酮吡多；常规化疗剂类似物，例如紫杉烷和埃坡霉素类似物；抗血管生成剂，例如基质金属 蛋白酶抑制剂和其他VEGF抑制剂，例如ZD6474和SU6668。在gp96免疫和本发明的方法中 也可以采用类视黄醇，例如Targretin。也可以采用干扰法尼基(famesyl)转移酶活性和化 疗耐药调节剂例如伐司朴达的信号转导抑制剂。还可以采用单克隆抗体，例如C225抗体和 抗VEGFr抗体。癌症类型术语“肿瘤”用来表示可能是良性(例如，不形成转移灶并且不破坏附近正常组织 的肿瘤)或恶性/癌症(例如，侵入周围组织并且通常能够产生转移灶、在试图摘除后可 能复发并且如没有充分治疗可能引起宿主死亡的肿瘤)的致瘤性生长(参见Steadman' s Medical Dictionary (斯特德曼医学词典)，第 26 版，Williams & Wilkins，Baltimore, MD(1995)) 0如本文所述，术语“肿瘤”、“肿瘤生长”或“肿瘤组织”可以互换使用，并且是指 由不受控制的进行性细胞倍增产生并且没有承担生理功能的组织的异常生长。实体瘤可以是恶性的例如倾向于转移并威胁生命，或是良性的。能够根据本发明 的方法治疗或防止的实体瘤的实例包括肉瘤和癌，例如但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、月旨 肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑 膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺 癌、卵巢癌、输卵管癌、腹膜原癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺 癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、肝转移、胆管癌、 绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、甲状腺癌例如间变性甲状腺癌、维尔姆斯(氏)肿瘤、宫 颈癌、睾丸瘤、肺癌如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞 瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶 质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、和视网膜母细胞瘤。 此外，可以用gp96免疫或本发明的方法在上皮组织例如在宫颈、食道和肺的上皮 组织中治疗或防止包括异常增殖变化(例如化生和发育异常)在内的肿瘤。因此，本发明 提供了用于治疗已知或怀疑在先进展成瘤或癌症的病症，特别是其中已经发生非瘤细胞生 长的瘤或癌症，所述非瘤细胞生长包括增生、化生或最特别的发育异常(对于此类异常生 长病症的综述，参见 Robbins 和 Angell，1976，Basic Pathology，第 2 版.，W. B. Saunders Co.，Philadelphia，第68至79页)。增生是一种受控制的细胞增殖形式，包括组织或器官 中细胞数目的增加，而没有结构或功能上的显著改变。例如，子宫内膜增生通常发生在子宫 内膜癌之前。化生是一种受控制的细胞生长形式，其中一种类型的成人细胞或完全分化细 胞代替另一种类型的成人细胞。化生可以发生在上皮组织细胞或结缔组织细胞中。非典型 化生包括有点无序的化生上皮。发育异常经常是癌症的先兆，并且主要在上皮中发现，它是 非瘤细胞生长的最无序形式，包括个体细胞均勻度和细胞构造方向的丧失。发育异常的细 胞通常具有异常大的、深染色的细胞核并展现出多型性。发育异常特有地发生在存在慢性 刺激或炎症之处，并且通常在宫颈、呼吸道、口腔和胆囊中发现。关于这些疾患的综述，参见 Fishman 等人，1985，Medicine，第二片反.,J. B. Lippincott Co.，Philadelphia。为良性的并且能够根据本发明的方法治疗或防止的肿瘤的其他实例包括动静脉 (AV)畸形，尤其是在颅内部位，和骨髓瘤。
根据一些实施方案，提供用于控制实体瘤生长(例如，乳腺、前列腺、黑素瘤、肾 脏、结肠、宫颈的肿瘤生长)和/或转移方法，包括向需要它的受治疗者施用有效量的本发 明的化合物。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“有效量”是指足以在患有癌症的动物优选人中提供期望的抗癌 作用或抗肿瘤作用的量。期望的抗肿瘤作用包括但不限于调节肿瘤生长(例如肿瘤生长 延迟)、肿瘤大小或转移，减少具体抗癌剂伴有的毒性和副作用，使癌症症状的临床损伤改 善或降到最低，延长受治疗者的存活率超过在没有这种治疗的情况下另外预期的存活率， 以及在施用前没有任何肿瘤形成的动物中防止肿瘤生长，即，预防性施用。
如本文所用，术语“调节(modulate)”、“调节(modulating)"或“调节 (modulation) ”是指改变特定过程发生的速度、抑制特定过程、逆转特定过程和/或防止特 定过程的起始。据此，如果特定过程是肿瘤生长或转移，则术语“调节”包括但不限于降低 肿瘤生长和/或转移发生的速度；抑制肿瘤生长和/或转移；逆转肿瘤生长和/或转移(包 括肿瘤皱缩和/或根除)和/或防止肿瘤生长和/或转移。
如本文所用的“协同作用”是指通过两种药物的组合所产生的、并且超过单独施用 任一种药物另外所产生的作用的大于加性的抗癌作用。两种药物之间的协同作用的一个量 度是 Chou 和 Talalay 的联合指数(Cl)法(参见 Chang 等人，Cancer Res. 45 :2434-2439, (198 )，该方法是基于中效原则。该方法计算在不同细胞毒性水平的两种药物之间的协同 作用、加性或拮抗作用的程度。在CI值小于1时，这两种药物之间具有协同作用。在CI值 为1时，具有加性作用，但没有协同作用。CI值大于1表明拮抗作用。CI值越小，协同作用 越大。协同作用的另一量度是分数抑制浓度(FIC)。这个分数值是通过将联合起作用的药 物的IC5tl表示成单独起作用的药物的IC5tl的函数来确定的。对于两种相互作用的药物，每 种药物FIC值的和表示协同相互作用的量度。在FIC值小于1时，这两种药物之间具有协 同作用。FIC值为1表明加性作用。FIC值越小，协同相互作用越大。
如本文所用的术语“抗癌剂”表示能够调节肿瘤生长或转移的化合物或电磁辐射 (特别是X射线)。当提到使用具有分泌形式的gp96多肽的这样一种剂时，该术语是指除 分泌形式的gp96多肽以外的剂。除非另外指明，否则该术语可以包括一种或多于一种这样 的剂。在采用多于一种抗癌剂时，施用分泌形式的gp96多肽的相对时间可以根据需要来选 择以提供一种或多于一种抗癌剂的时间依赖性有效肿瘤浓度。
除非内容另外清楚地规定，如在本说明书中所用的单数形式“一(a)”、“一个 (an)”和“该(the)”具体还涵盖它们所指的术语的复数形式。如本文所用，除非具体另外 指明，字“或”在“和/或”的“包括”意义上使用而不是在“或/或”的“排除”意义上使用。 在本说明书和所附权利要求中，除非上下文另外清楚地规定，单数形式包括复数指称物。
本文使用术语“大约”来表示近似，在…附近，大致，或在…左右。当术语“大约” 与数字范围结合使用时，它通过将边界延伸到给出的数值以上和以下来修改该范围。一 般而言，本文使用术语“大约”在设定值以上和以下20%的变化内修改数值。如在本说明 书中所用的，无论是在过渡短语或在权利要求主体中，术语“包括(comprise)”和“包括 (comprising) ”应被解释为具有开放式含义。也就是说，这些术语应当与短语“至少具有” 或“至少包括”被同义解释。当在方法的背景下使用时，术语“包括”表示该方法至少包括列 举的步骤，但可以包括另外的步骤。当在化合物或组合物的背景下使用时，术语“包括”表示该化合物或组合物至少包括列举的特征或组分，但是还可以包括另外的特征或组分。
其他定义
本发明的组合物和方法可用于刺激针对肿瘤的免疫应答。这样的免疫应答在治疗 或减轻与肿瘤相关的体征或症状中是有用的。这样的免疫应答能够改善与肺癌相关的体征 或症状。如本文所用，所谓“治疗”表示与没有根据本发明治疗的个体的症状相比减少、阻 止和/或逆转施用了本发明化合物的个体中的症状。开业医师将理解本文所述的组合物和 方法应当与由熟练开业医师(医生或兽医)给出的连续的临床评估一起共同使用以确定后 续治疗。所以，在治疗后开业医师将评估根据标准方法学治疗肺部炎症上的任何改善。这 样的评估将帮助和告知评估是否增加、减少或继续特定的治疗剂量、施用方式等。
本发明的方法因此能够用于治疗肿瘤，包括例如癌症。本发明的方法能够用于， 例如通过阻止肿瘤的进一步生长、通过减慢肿瘤生长或通过造成肿瘤退化来抑制肿瘤的生 长。因此，本发明的方法能够用于例如治疗癌症，如肺癌。将理解被施用本发明的化合物的 受治疗者不必遭受特定的创伤性状态。其实，本发明的化合物可以在症状的任何发展之前 (例如，从癌症中缓解的患者)预防性地施用。术语“治疗的”、“治疗上”和这些术语的变换 用于涵盖治疗的、姑息的以及预防的用途。所以，如本文所用，所谓“治疗或减轻症状”表示 相比于未接受这种施用的个体的症状，减少、阻止和/或逆转已施用治疗有效量的本发明 组合物的个体的症状。
术语“治疗有效量”用来表示以有效达到所追求的治疗结果的剂量治疗。此外，技 术人员将理解，通过微调和/或通过施用多于一种本发明的组合物(例如，通过共同施用两 种不同的基因修饰的肿瘤细胞)或通过施用本发明的组合物与另一种化合物以增强治疗 效果(例如，协同地)，本发明组合物的治疗有效量可以被降低或提高。本发明因此提供了 使施用/治疗适合于给定哺乳动物特定的特别紧急需要的方法。如在以下实施例中说明的 那样，治疗有效量可以容易地确定，例如根据经验通过以相对低的量开始并逐步增量同时 评估有益效果。本发明的方法因此能够单独使用或与其他公知的治疗患有肿瘤的患者的肿 瘤疗法联合使用。本领域技术人员将容易地理解例如在延长肺癌患者的预期寿命和/或改 善肺癌患者的生活质量上本发明的有利用途。
疫苗接种方法诸如本文公开的疫苗接种方法可以是诱导患有非免疫原性肿瘤的 患者的免疫应答的有效手段。
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有本发明所属领域的技术 人员通常理解的含义。
本发明的方法旨在用于可能获益于本发明的方法的任何受治疗者。因此，根据本 发明，“受治疗者”、“患者”以及“个体”(互换使用)包括人以及非人受治疗者，特别是家养 动物。
如本文所用，“异基因细胞”是指如下一种细胞并非从施用该细胞的个体获取，即 具有不同于该个体的基因构成的细胞。异基因细胞一般是从与施用该细胞的个体相同的物 种获得。例如，异基因细胞可以是如本文所公开的用于施用给人患者例如癌症患者的人细 胞。如本文所用，“异基因肿瘤细胞”是指并非从要施用该异基因细胞的个体获取的肿瘤细 胞。
一般而言，异基因肿瘤细胞表达一种或多种肿瘤抗原，所述肿瘤抗原能够在施用该细胞的个体中刺激针对肿瘤的免疫应答。如本文所用，“异基因癌细胞”例如肺癌细胞是 指并非从要施用该异基因细胞的个体获取的癌细胞。一般而言，异基因癌细胞表达一种或 多种肿瘤抗原，所述肿瘤抗原能够在要施用该细胞的个体中刺激针对癌症的免疫应答，例 如肺癌。
如本文所用，“基因修饰的细胞”是指被基因修饰以通过例如转染或转导来表达外 源核酸的细胞。
如本文所公开的，可以选择异基因全细胞疫苗，因为目前为止全细胞疫苗给出良 好的临床结果。在以下假设之下，基于异基因细胞的疫苗提供了对自体疫苗的良好替代 物肿瘤抗原在不同患者的肿瘤中是共有的并且该抗原能够被患者的抗原递呈细胞交叉递 呈。参见，例如，Fong，等人，Annu. Rev. Immunol. 18 :245-273(2000) ；Boon，等人，Annu. Rev. Immunol. 12 :337-365(1994)。
通过包括免疫可用的任何公知组分，包含被基因修饰以表达分泌形式的gp96多 肽的肿瘤细胞的本发明的组合物能够与在疫苗中可用的生理学上可接受的载体相组合。生 理学载体的组分旨在促进或增强对疫苗中施用的抗原的免疫应答。制剂可以在刺激对抗原 的免疫应答的组合物中包含维持优选的PH范围的缓冲液、盐或将抗原呈现给个体的其他 组分。生理学上可接受的载体还可以包含一种或多种增强对抗原的免疫应答的佐剂。制剂 可以被皮下、肌内、皮内施用或以任何免疫接受的方式施用。
佐剂是指如下一种物质当它被加至本发明的免疫原性剂例如被基因修饰以表达 分泌形式的gp96多肽的肿瘤细胞时，在暴露于该混合物的受体宿主中非特异性增强或强 化对该剂的免疫应答。佐剂可以包括例如，水包油乳剂、油包水乳剂、明矾(铝盐)、脂质体 和微粒，例如聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/多糖苷。
佐剂还可以包括，例如角鲨烯混合物(SAF-I)、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细 胞壁制备物、单磷酰脂质A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒 素B亚基、聚磷腈和衍生物，以及免疫刺激复合物(ISCOM)，例如由Takahashi等人Nature 344:873-875(1990)描述的那些。对于兽医用途和在动物中产生抗体，可以使用弗氏佐剂 (完全和不完全的两种)促有丝分裂组分。在人类中，不完全弗氏佐剂(IFA)是一种有用 的佐剂。多种适当的佐剂是本领域公知的(参见例如，Warren和Chedid，CRC Critical Reviews in Immunology (在免疫学中的 CRC 述评)8 :83 (1988) ；Allison 和 Byars，在 Vaccines :New Approaches to Immunological Problems (疫苗针对免疫学问题的新方 法)，Ellis，编.,Butterworth-Heinemann,Boston(1992)中)。另外的佐剂包括，例如卡介 苗(BCG)、DETOX(包含草分枝杆菌细胞壁骨架(CWQ和来自明尼苏达沙门菌的单磷酰脂质 A(MPL))以及类似物(参见，例如，Hoover 等人· , J. Clin. Oncol. , 11 :390(1993) ；Woodlock 等人，J. Immunotherapy 22 :251-259 (1999))。
本文所公开的本发明的组合物和方法对于治疗具有肿瘤的患者是有用的。尽管具 体的实施方案用肺癌举例说明，应理解类似的方法也可以使用适宜的异基因细胞治疗其他 类型的肿瘤，包括癌症。
应理解没有实质影响本发明的各实施方案的活性的修改也在本文提供的本发明 的定义之内。据此，以下实施例旨在说明而不限制本发明。尽管要求保护的发明已在细节 上并关于其具体实施方案而进行了描述，但是对本领域普通技术人员将明显的是可以对要求保护的发明作出各种改变和修改而不背离其精神和范围。因此，例如，本领域技术人员将 仅仅使用常规实验认出或能够确定本文所描述的具体物质和方法的众多等同物。这些等同 物被认为是在本发明的范围之内并且被以下权利要求覆盖。
实施例1 肿瘤分泌的热休克融合蛋白引起CD8细胞排斥
在包括从肿瘤抗原衍生的那些肽的肽通过MHC I类递呈的途中，内质网固有的热 休克蛋白gp96陪伴它们。内质网的gp96滞留信号被鼠IgGl的Fc部分取代产生了 gp96 的分泌形式gp96-Ig。分泌gp96-Ig的肿瘤细胞在体内表现出降低的致肿瘤性和提高的免 疫原性并且在起初的生长后被排斥。排斥在敏化和效应阶段需要CD8T细胞。排斥在任一 阶段都不需要CD4T细胞。角叉菜聚糖是一种已知使体内巨噬细胞失活的化合物，它并不减 少⑶8介导的肿瘤排斥。因此，用分泌gp96-Ig的肿瘤免疫产生了有效的排斥肿瘤的⑶8 CTL而无需CD4或巨噬细胞帮助。相反，用纯化的源自肿瘤的gp96或用受辐照的肿瘤细胞 免疫需要二者。
开发了 gp96的分泌形式gp96_Ig并在肿瘤模型中测试它。用gp96_Ig的cDNA转 染肿瘤细胞导致gp96-Ig分泌。如在本公布中所示，分泌gp96-Ig的肿瘤细胞在体内引起 专门依赖于CD8细胞的强大的免疫和肿瘤排斥。
细胞系所有细胞系是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) (Manassas, VA)获得的并被培养在具有10% FCS的培养基中。如Savaraj等 人.，Am. J. Clin. Oncol. 20 :398中所述那样建立人小细胞肺癌(SCLC)细胞系(SCLC-2和 SCLC-7)。克隆到表达载体中的鸡OVA即apc-NEO-OVA由M. Bevan博士 (西雅图，华盛顿 州)惠赠并用于转染Lewis肺癌(LLC)。
gp96-Ig的构建为了产生gp96_Ig融合蛋白，将KDEL序列缺失并用鼠的铰链、 CH2 和 CH3 结构域代替；用 GeneAmp RNA PCR 试剂盒(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) 从Jurkat DNA制备双链cDNA并通过PCR进行扩增。PCR引物是5 ‘ -ATTACTCGAGGGCCGCA CGCCATGAGGG-3‘和 5' -GCCCGGATCCTTCAGCTGTAGATTCCTTTGC-3‘。PCR 引物包括 XhoI 位 点(正向引物)和BamHI位点(反向引物)。通过使用鼠IgGlcDNA作模板并使铰链部分的 三个半胱氨酸突变为丝氨酸来扩增鼠IgGl的铰链、CH2和CH3结构域。PCR引物是5' -G CGAGGATCCGTGCCCAGGGATTCTGGTTCTAAG-3'和 5‘ -CTAAGCGGCCGCMGGACACTGGGATCATTTACC AGG-3'。PCR引物包括BamHI位点(正向引物)和NotI位点(反向引物)。将gp96插入 到真核表达载体pBCMGSNeo和pBCMGHis的XhoI和BamHI位点，并转染到SCLC_2、SCLC_7、 B16F10、MC57、LLC NIH3T3、EL4、E. G7 和 P815 中。用 lmg/ml 的 G418 或 2. 5-10mM 的 L-组胺 醇(Sigma，St. Louis，M0)选择转染的细胞。参见 J mmunol. 1999 Nov 15 ；163(10) :5178-82 和其中引用的参考文献。
ELISA 这是使用针对Ig标签的抗体进行的。将产生Gp96_Ig的细胞以106/ml铺 板在具有10% FCS的AIMV或IMDM中，并在不同的时间点收集培养上清。为了分析gp96_Ig 的细胞内表达，通过三个冷冻-融化循环裂解细胞并以13，OOOXg离心60min。
gp96-Ig融合蛋白的纯化通过蛋白A柱上的亲和色谱使用标准步骤(Bio-Rad， Hercules, CA)纯化 gp96_Ig。通过 Micro BCA 蛋白测定试剂盒(Pierce, Rockford, IL)确 定gp96-Ig的浓度。使用标准步骤完成SDS-PAGE和蛋白质印迹。
FACS分析对于gp96-Ig转染的SCLC的膜染色，细胞用山羊抗小鼠IgG-FITC或作为对照的山羊抗兔IgG-FITC在4°C染色15分钟，并通过Becton Dickinson FACScan流 式细胞仪(San Diego,CA)分析。对于细胞内染色，用4%多聚甲醛固定细胞，并用皂苷 透化，接着用山羊抗小鼠IgG-FITC、山羊抗小鼠IgG-PE、山羊抗兔IgG-FITC或山羊抗叙利 亚仓鼠IgG-FITC在4°C染色15分钟，并且通过流式细胞仪分析。
肿瘤的接种和疫苗接种通过将200μ 1 PBS中的活肿瘤细胞皮下注射到小鼠胁 腹中来确定体内致瘤性。每周两次测量肿瘤的二维大小持续至少2个月。当平均肿瘤生长 超过IOmm直径时，处死小鼠。
通过皮下注射在右胁腹中给予IO6活的E.G7-gp96_Ig或作为对照的受辐照的 E.G7(在200μ1 PBS中)免疫小鼠。以2周间隔给予两次免疫。两周后，通过将指定数目 的活肿瘤细胞(在200 μ 1 PBS中的EL4、E. G7、LLC或LLC-0VA)皮下注射到左胁腹中来攻击小鼠。
体内T细胞或巨噬细胞的耗竭通过腹腔内注射施用在200 μ 1 PBS中的总计 100 μ g的GKl. 5 (抗⑶4)或2. 43 (抗⑶8)。通过FACS分析验证⑶4和⑶8细胞的耗竭。 在抗体注射后CD4或CD8水平保持偏低(> 95%耗竭)持续大于2周(数据未显示)。对 于巨噬细胞的功能抑制，通过腹腔内注射施用在200μ 1 PBS中的Img的角叉菜聚糖(II型； Sigma)ο
MM 从肿瘤细胞纯化的ER固有的hsp gp96能够提供肿瘤特异性免疫。gp96的 C端序列KDEL用作ER滞留信号。该序列的缺失导致gp96与来自转染的肿瘤细胞的结合肽 一起分泌并且可以使得肿瘤免疫原性更强以允许肿瘤被免疫系统排斥。
用在Fc受体结合中无效的Ig同种型鼠IgGl的铰链、CH2和CH3结构域取代gp96 的KDEL序列，并将cDNA转染到肿瘤细胞中导致gp96_Ig分泌到培养上清中，在培养上清中 通过ELISA对gp96-Ig定量。蛋白A纯化的gp96_Ig在SDS-PAGE上迁移，其中预测的分子 质量为120kDa的主要条带为融合蛋白，并且两个次要的较高的分子条带为之前也报道过 的未修饰的gp96。用对gp96特异的mAb进行的蛋白质印迹证实了融合蛋白的身份。只有 主要条带被染色，暗示次要条带是不被抗体识别的gp96的糖基化变体。
gp96-Ig的分泌导致其在上清液中时间依赖性的线性积累。细胞内的gp96_Ig在 转染细胞的裂解物中以较低且恒定的稳态水平被检测出，表明它没有在细胞中积累。对膜 完整的转染的肿瘤细胞的FACS分析揭示没有高于背景的抗小鼠IgG染色，表明融合蛋白的 Ig部分没有被展示在质膜外层上。相比之下，在膜透化后，用山羊抗小鼠IgG抗体在细胞内 检测到gp96-Ig，但gp96-Ig没有被对照山羊抗兔IgG抗体检测到。gp96的跨膜结构域没 有干扰gp96-Ig的分泌并且没有导致细胞内积累。这些数据与之前的报道一致，暗示跨膜 结构域未用于锚定膜中的gp96并且gp96不是膜内在蛋白质。Altmeyer等人，1996 Int. J.Cancer 69 :340。
所有用gp96_Ig转染的鼠和人的细胞系都分泌融合蛋白。模拟品转染的细胞不分 泌gp96-Ig。Ε. G7是在同基因的C57BL/6小鼠中形成致死性肿瘤的EL4淋巴瘤的OVA转染 子。Ε. G7的gp96-Ig转染允许确定是否E. G7-gp96_Ig除了 E. G7之外免母肿瘤， E. G7是OVA替代转染的肿瘤。作为第二种肿瘤，使用以gp96-Ig或OVA转染的LLC，因为 与E. G7相比，它是一种非造血的、低免疫原性肿瘤。两种细胞系分泌同等量的gp96-Ig。
分泌的gp96_Ig造成致瘤性降低当与模拟品转染的E. G7或未转染的E. G7相比时，gp96-Ig的分泌将E. G7在C57BL/6小鼠中的致瘤性降低了大于100倍。皮下接种1千万 分泌hsp的肿瘤细胞只在10%的接种小鼠中引起肿瘤(图1A)。对于转染的EL4观察到类 似的由gp96-Ig分泌降低致瘤性(数据未显示)。LLC分泌gp96-Ig导致较适度的、约5倍 的致瘤性降低(图1B)。
为了确定免疫原性和免疫记忆应答，以2周间隔用受排斥剂量的非辐照的 E. G7-gp96-Ig(106)免疫两次C57BL/6小鼠。随后，用未转染的E. G7或模拟品转染的E. G7、 母EL4、未转染的LLC和OVA转染的LLC攻击小鼠(图1，C_F)。用受辐照的Ε. G7免疫的小 鼠或未接种的小鼠用作对照。Ε. G7-gp96-Ig免疫的小鼠抵抗E. G7肿瘤攻击比用受辐照的 细胞接种疫苗的小鼠或未免疫的小鼠高10倍(图1C)。在接种疫苗的小鼠中的肿瘤生长 通常被延迟。当用EL4攻击时免疫的作用甚至更显著，使得与对照相比EL4攻击的剂量提 高五十倍(图1D)。正如预期的那样，E. G7-gp96-Ig免疫没有提供针对未转染的LLC或载 体转染的LLC的攻击的保护(图1E)，而当OVA转染的LLC用作攻击物时观察到适度的、约 3倍的保护提高(图1F)。用E.G7-gp96-Ig免疫的小鼠针对EL4攻击的强烈保护可能是因 为E. G7和EL4共享多个肿瘤抗原。针对LLC-OVA攻击的较弱保护取决于T细胞识别来源 于T细胞识别的OVA替代的单个表位或有限数目的表位。
在敏化阶段和效应阶段需要CD8细胞通过体内耗竭/失活免疫活性细胞进一步 检验在E. G7-gp96-Ig的排斥中包含的免疫机制。已报道对于有效的免疫而言，MethA肿瘤 来源的gp96需要CD4细胞、CD8细胞和巨噬细胞，而用受辐照的MethA肿瘤细胞免疫需要 ⑶4细胞和⑶8细胞，但不需要巨噬细胞。
为了敏化，皮下接种一百万未受辐照的分泌gp96_Ig的活的E. G7。该剂量足以形 成长至平均直径大约8mm、随后皱缩并被排斥的肿瘤。肿瘤排斥在接种肿瘤前2天(图2A) 或接种肿瘤后达3天(未显示)用抗CD8抗体2. 43处理的小鼠中被阻断。不考虑注射时 间，尽管抗CD4抗体GKl. 5完全耗竭CD4细胞大于14天(数据未示出)，但它对肿瘤排斥 没有作用(图2A)。CD4缺陷的小鼠能够排斥E. G7-gp96-Ig(图2B)，支持CD8细胞的重要 性。不分泌gp96-Ig的E. G7在未处理的小鼠和免疫耗竭的小鼠中形成肿瘤。已知使体内 巨噬细胞失活的角叉菜聚糖对肿瘤排斥没有作用。
为了研究肿瘤排斥的效应阶段，用活的E. G7-gp96-Ig以14天间隔免疫小鼠两次。 十一天后(第25天)，免疫细胞被耗竭，并且3天后用未转染的E.G7攻击小鼠。在效应阶 段只需要CD8细胞；CD4细胞的耗竭或巨噬细胞的角叉菜聚糖失活对效应阶段的E. G7排斥 没有影响(图2C)。
gp96的内质网滞留信号的去除以及被IgGl的Fc部分取代容易导致gp96_Ig的 分泌，gp96-Ig似乎通过IgGl的hours链被二聚化。E. G7分泌的gp96能够提供持久的特 异性免疫，暗示它陪伴肿瘤肽。相比之下，受辐照的E. G7或模拟品转染的E. G7不能提供保 护性免疫。小棒杆菌(Corynebacterium parvum)也不能充当用于Ε. G7免疫的佐剂。分泌 的gp96-Ig提供了对替代抗原OVA和其他EL4抗原的免疫特异性，但是不与LLC来源的肿 瘤抗原交叉免疫。
该数据与以下解释是一致的与分泌的gp96_Ig相关的肽被转移到I类MHC并且 被I类MHC递呈，并刺激引起肿瘤排斥的肿瘤特异性CD8+CTL应答。CD8应答似乎不依赖 ⑶4辅助并且不需要巨噬细胞。是否这种细胞需求是因为gp96-Ig 二聚还是未知的。
比较纯化的肿瘤来源的gp96和肿瘤分泌的gp96_Ig的免疫机制是有指导性的。 Udono 等人.，(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :3077,1994)使用从用于免疫的 Meth A 肿瘤 细胞纯化的gp96，报道了在敏化阶段需要CD8细胞和巨噬细胞，并且在Meth A肿瘤的肿瘤 排斥效应阶段需要CD4细胞和CD8细胞以及巨噬细胞。用受辐照的MethA肿瘤免疫在敏化 阶段需要⑶4细胞，并且在效应阶段需要⑶4细胞和⑶8细胞二者。受辐照的EG7不产生 针对随后攻击的免疫。肿瘤分泌的gp96-Ig的显著作用完全依赖于⑶8细胞而没有⑶4辅 助。在对肿瘤的CTL应答敏化阶段和效应阶段需要CD8细胞。似乎不需要巨噬细胞。树突 细胞或其他APC在gp96陪伴的肽向CD8细胞递呈中的作用是未知的，但仍有可能性。分泌 gp96-Ig的EG7直接刺激⑶8细胞也是可能的。
实施例2 增强抗原向CD8细胞毒性T淋巴细胞递呈的分子需求和细胞需求
这个实施例显示肿瘤分泌的热休克蛋白gp96陪伴的肽提高CD8CTL的抗原交叉敏 化的效率胜过单独的未受陪伴的蛋白的交叉敏化活性几百万倍。gp96还通过未受陪伴的 蛋白充当交叉敏化的佐剂，但是在这方面的能力gp96比作为肽蛋白伴侣的活性小1000倍。 机械地，由转染的肿瘤细胞原位分泌的gp96-Ig募集并激活树突细胞和NK细胞至gp96释 放位点，并促进⑶8 CTL局部扩增。在不存在NKT和⑶4细胞且没有⑶40L的情况下，gp96 介导的CD8T细胞的交叉敏化需要B7. 1/2共刺激，但在淋巴结缺陷的小鼠中无阻碍地进行。 在不存在淋巴结的情况下gp96驱动的⑶8CTL的MHC I交叉敏化在gp96释放位点提供了 局部的、基于组织的CTL产生的新颖机制。该途径可能构成极其重要的早期检测和快速应 答机制，该机制在有效防御破坏组织的抗原剂的实质组织中是有效力的。
热休克蛋白是能够被APC摄取并被交叉递呈至CD8细胞的蛋白伴侣肽。外源热休 克蛋白(HSP)被树突细胞(DC)上的CD91和L0X-1主动地捕获，并通过将陪伴的肽递送至 MHC I类途径以便被交叉递呈至⑶8+CTL而引发肽特异性免疫应答。被HSP-gp96交叉敏化 与导致CD8CTL偏倚应答的TLR2和TLR4的刺激以及DC的成熟有关。
用分泌gp96的肿瘤细胞免疫产生不依赖于CD4细胞的肿瘤特异的和替代抗原特 异的免疫。Oizumi等人.J Immunol. 2007Aug 15 ； 179 (4) =2310-7 使用这种免疫方法对 ⑶8应答定量，这个实施例显示微量的、飞摩尔(femtomolar)量的gp96陪伴的抗原对于局 部地在gp96释放位点不依赖于淋巴结和CD4细胞的同源CD8交叉敏化而言是足够的。
小鼠在C57BL/6(B6)背景下的野生型(wt)和 B7. 1、Β7· 2、Β7· 1/2、CD40L、淋巴毒 素α (LTa)以及CD4缺陷的小鼠是从Jackson实验室获得。Β6. Ja小鼠(NKT缺陷的， 又名J a 18敲除(ko))是在Taniguchi博士(千叶大学，千叶，日本)的许可下由M. Lotze 博士(匹兹堡大学医疗中心，匹兹堡，宾夕法尼亚州)提供。通过生产者的许可获得GFP转 基因小鼠。C57BL/6 OT-I小鼠是从M. Bevan博士(华盛顿大学医学院，西雅图，华盛顿州) 获得。所有小鼠是在6-12周使用抗原(antigene)。
细胞系将由M. Bevan博士慷慨提供的OVA转染的EL4淋巴瘤系EG7如之前所述进 一步用包含gp96-Ig的载体pCMG-His转染。用pAC-neo_0VA(由M. Bevan博士慷慨提供) 中的OVA以及用包含gp96-Ig的pCMG-His来转染NIH 3T3细胞。
抗体荧光抗体是从BD Pharmingen禾Π eBioscience购买。
OT-I细胞的纯化和过继转移使用磁性分离(> 95%纯；Miltenyi Biotec)通过 用抗⑶8的阳性选择来纯化GFP标记的OT-I细胞。通过C57BL/6小鼠的尾静脉过继转移在0. 3ml体积PBS中的一百万GFP-OT-I细胞。
免疫在过继转移GFP-OT-I后两天，腹腔内注射在0. 5ml体积PBS中的2_4X IO6 未受辐照的EG7-gp96-Ig细胞或对照EG7细胞。对于一些实验，用溶解于PBS中的 3T3-0VA-gp96-Ig、3T3-0VA 或完整的 OVA(Sigma-Aldrich)腹腔内免疫小鼠。
OT-I的先体外后体内的抗原交叉递呈和交叉敏化用2X 1063T3-0VA-gp96_Ig或 3T3-gp96-Ig腹腔内免疫B6野生型小鼠的各组。在3天后，收集腹膜腔渗出细胞(PEC)，并 且将IO5 PEC与纯化的首次用于实验的CFSE标记的OT-I在圆底96孔微孔板中在200 μ 1 的组织培养基中以不同比率(5 UlO UlOO 1和1000 1)共同培养48小时和72 小时。还将CFSE标记的OT-I直接与3T3、3T3-0VA-gp96-Ig和3T3-gp96_Ig共同培养。在 指定时间段后，收集细胞并用抗⑶8-PE染色。如在ISR II流式细胞仪(BD Biosciences) 中所分析的通过CFSE稀释来测量OT-I扩增。通过在门圈出(gated)的淋巴细胞中或在总 的CFSE+细胞中的CFSE稀释来分析细胞分裂并将其表示为总的CFSE+细胞的百分比。
BrdU标记和分析在免疫时间在小鼠的饮用水中对小鼠施用 BrdU(Sigma-Aldrich) (0. 8mg/ml)。在固定和透化后通过对 BrdU(eBioscience)染色来分 析细胞样品。
⑶4细胞通过HSP gp96肽抑制抗原交叉递呈至⑶8 CTL 用分泌形式的gp96即 gp96-Ig转染的肿瘤细胞在小鼠中变得具有免疫原性并且诱导肿瘤特异性免疫。Yamazaki 等人·，J. Immunol. 163 :5178-5182(1999)。肿瘤免疫在免疫应答的传入枝(afferent arm) 或传出枝(efferent arm)中需要⑶8细胞但是不依赖⑶4细胞。
因为CD4细胞表现辅助细胞和调节性细胞的活性，我们感兴趣的是确定这些相对 功能中的任一种是否调节gp96对CD8细胞的交叉敏化。我们使用过继转移的Kb_°VA-特异 性TCR-转基因CD8细胞OT-I来定量在对EG7-gp96-Ig或EG7的腹腔内免疫的应答中的 CTL扩增。EG7是OVA转染的EL4淋巴瘤。在该系统中的OT-I扩增在之前已显示依赖于 gp96陪伴的OVA肽并且不受Ig-Fc-标签影响，因为gp96-myc具有同等活性。肿瘤分泌的 gp96-Ig免疫系统也产生针对真正的肿瘤抗原的免疫。然而，测量OT-I扩增提供了比测量 肿瘤排斥更为精确和快速的读数。
在⑶4 ko中，所有的⑶4功能(辅助和调节)被缺失，而在⑶40Lko中主要失去 了⑶4细胞的辅助细胞功能。因此我们比较了相对于野生型小鼠在⑶4 ko和⑶40L中，在 对由EG7-gp96分泌的gp96-0VA应答中的OT-I扩增(图3)。为了使分析容易，通过用GFP 转基因小鼠培育OT-I小鼠，OT-I TCR转基因细胞也被GFP标记(GFP-OT-I)。在与野生型 小鼠的比较中，作为对EG7-gp96-Ig的应答，在⑶4 ko小鼠中的OT-I扩增提高了 100%，暗 示⑶4细胞的存在干扰⑶8的克隆扩增(图3A)。相比之下，在⑶40L ko小鼠中OT-I扩 增与在野生型小鼠中的扩增相似(图3B)。数据表明经由CD40L介导的CD4辅助功能不是 gp96介导的抗原交叉递呈至⑶8 CTL所需的。相比之下⑶4+T调节性细胞在⑶4 ko中不 存在，正常情况下下调由gp96-0VA引起的OT-I交叉敏化。
由gp96引起的⑶8交叉敏化依赖于B7. 1和B7. 2并且不依赖NKT细胞有效的T 细胞敏化需要通常通过⑶40信号介导的DC的成熟以及MHC和共刺激分子的上调。然而， gp96介导的OT-I敏化显然不需要通过CD40L/CD40轴的CD4辅助(图3)。gp96结合CD91 并且结合TLR2和TLR4，并由此可能激活DC而不依赖⑶40。我们确定是否体内⑶8细胞的这种交叉敏化机制依赖于B7. 1 (CD80)和B7. 2 (CD86)共刺激。单独的B7. 1或B7. 2缺陷的 小鼠(图4A)能够以野生型小鼠的约50%的效率共刺激gp96介导的OT-I的交叉敏化。然 而，在完全不存在B7. 1和B7. 2的情况下，在双缺陷的小鼠中(图4B)，gp96介导的OT-I的 交叉敏化完全被消除。
NKT细胞通常参与抗肿瘤免疫。Jal8 ko小鼠缺乏NKT细胞，原因是它们不能产生 ⑶Id受限的不变的NKT细胞所特有的不变的TCRval4链。Jaw ko小鼠支持未减少的OT-I 扩增的能力(图4C)暗示NKT细胞不是gp96介导的OT-I交叉敏化所必需的。
抗原被gp96交叉递呈不需要淋巴结引流淋巴结使APC、⑶4辅助细胞、⑶8 CTL 前体和NK细胞在一起，促进细胞相互作用并增强CTL敏化和扩增。因为gp96介导的^^交 叉敏化不依赖CD4辅助，我们提出了 OT-I扩增需要引流淋巴结的问题。LTa缺陷的小鼠缺 乏外周和肠系膜淋巴结(包括派尔集合淋巴结)，并且在抗病毒应答中受损伤。然而，当分 析gp96-0VA介导的OT-I扩增时，当与野生型小鼠比较时，LTa缺陷的小鼠显示几乎正常 的腹膜腔(PC)中的OT-I扩增(图5，A和B)。在脾脏中，GFP OT-I的积累减少了约50%， 反映出不存在基于淋巴结的OT-I克隆扩增。该发现暗示淋巴结不是gp96介导的肽交叉敏 化所必需的，并且局部交叉敏化在gp96释放位点发生。
为了直接测试不依赖淋巴结的OT-I交叉敏化，我们在用异基因3T3细胞、3T3-0VA 细胞或3T3-0VA-gp96-Ig细胞腹腔内免疫后第3天从B6小鼠中分离PEC。将PEC以各种比 率与CFSE标记的OT-I混合，并且在48和72小时后确定CFSE稀释。如通过CFSE稀释所 指示的，从用3T3-0VA-gp96-Ig注射的小鼠中分离的PEC能够在体外交叉敏化OT-I (图5， C,a-d)。相比之下，从用3T3-gp96或未转染的3T3注射的小鼠中分离的PEC不能刺激OT-I 增殖(图 5 的 c、e、f)。同样，CSFE 标记的 OT-I 与 3T3-0VA-gp96_Ig 或与 3T3-gp96_Ig 的 直接体外孵育不能引起CSFE稀释。该数据支持在PC中不存在淋巴结的情况下gp96-0VA 诱导的抗原交叉递呈至同源CD8细胞的模型。
gp96将DC细胞和NK细胞募集至其释放位点并引起这些细胞的激活最小的交叉 敏化需要APC和CD8细胞在一起，而CD4细胞在我们的模型系统中不是必需的。我们确定 是否在PC中gp96的局部释放引起APC和OT-I的局部募集和激活，从而绕过对淋巴结的需要。
在gp96_Ig免疫后的OT-I扩增到第4天和第5天是最大的并且在PC中最显著。 实质上从0开始，约5百万OT-I在第4天和第5天在PC中积累，代表高达60 %的募集的 ⑶8细胞。也像其他人观察到的一样，强OT-I扩增高度依赖于gp96-Ig的分泌(图6)，并 且对EG7的应答最小。gp96在4天内在野生型小鼠中交叉敏化CD8细胞的能力暗示对APC 和其他先天细胞的早期激活。已知gp96能够在体外激活DC并使之成熟，并且gp96陪伴的 肽被体外和体内的DC和巨噬细胞上的MHC I交叉递呈。Oizumi等人.J Immunol. 2007 Aug 15 ； 179 (4) :2310-7ο 已报道 gp96 能够激活 NK 细胞。Oizumi 等人.J Immunol. 2007 Aug 15;179(4) :2310-7。未受损的OT-I激活发生在LT α ko小鼠中的事实暗示细胞的募集和 激活必须在gp96释放位点局部地发生。
在腹腔内注射EG7-gp96_Ig或作为对照的EG7后，在第1_4天收集PEC，并通过表 型和通过BrdU的摄取来分析激活。最大部分的EG7-gp96-Ig募集的细胞，约80-90%，是 F4/80 单核细胞/巨噬细胞。在免疫之前存在的固有的腹膜巨噬细胞是F4/80汽并且在注射EG7-gp96-Ig后数目不改变。⑶Ilc+DC和NKl. I+NK细胞各自组成了最初2天内募集到PC 中的细胞的约5-10 %。在第3天开始发现B细胞和⑶4T细胞在PC中的数目提高，并且在第 4天和第5天进一步提高(数据未显示)。在与EG7的比较中，腹腔内注射EG7-gp96-Ig使 得最初2天内募集到PC中的总细胞数增加一倍(图7A)。如通过ELISA所测量的，该作用需 要注射的细胞在M小时内分泌至少60ng的gp96-Ig。Oizumi等人.J Immunol. 2007 Aug 15 ； 179 (4) :2310-7.如果该数目的注射细胞分泌较低量的gp96_Ig，对细胞募集和CD8交 叉敏化的作用快速衰减，暗示对于交叉敏化的刺激存在阈值水平的灵敏性(数据未显示)。 与不分泌gp96-Ig的EG7相比，由EG7分泌的gp96使募集的F4/80 细胞总数增加一倍并 且使DC和NK细胞数增加2倍(图7B)。在最初2天内由gp96募集到PC中的DC掺入大 量的BrdU，表明DC的激活。相比之下从引流的主动脉旁淋巴结、肠系膜淋巴结和脾脏中分 离的DC是BrdU阴性的(图8A)。这一发现强烈暗示DC被激活并且在gp96分泌位点局部 地增殖。不久在淋巴结和脾脏中也发现了 BrdU阳性的DC。在最初2天内的PC中，不分泌 gp96的EG7并不使BrdU被DC摄取。然而有趣的是，在第4天EG7募集的DC为BrdU弱阳 性(图8A)，表明与被EG7-gp96早且强烈的激活相比，被EG7激活延迟且较弱。DC被野生 型肿瘤EG7延迟激活只与最少的CD8扩增有关。
在EG7-gp96-Ig组中到第2天在PC中出现的CD8细胞显示大量的BrdU摄取，而 同时在引流的淋巴结和脾脏中的⑶8细胞仍是BrdU阴性的(图8B)。这一发现与⑶8的 增殖在局部的腹膜开始而不是在淋巴结中开始是一致的。到第4天，BrdU被CD8细胞gp96 依赖性摄取在PC中是非常明显的，并且仍非常显著地高于在淋巴结或脾脏中(图8B)。
如通过⑶69(图8C)和2B4(数据未显示)上调所指示的，在gp96组而不是EG7 组中的NK细胞到第4天被激活。如通过⑶69上调所测量的，NK激活只发生在PEC中(图 8C)，而未发生在淋巴结或脾脏中(数据未显示)，抗原(antigenain)暗示局部激活。
这些数据显示在PC中的局部gp96释放能够传递导致先天免疫细胞和适应性免疫 细胞的局部募集和激活的信号，提供不依赖于淋巴结和CD4细胞的CD8交叉敏化的细胞机 制。该交叉敏化机制不依赖于PC的特定解剖学，因为EG7-gp96-Ig或3T3-0VA-gp96_Ig的 皮下施用在OT-I交叉敏化上同等有效(数据未显示)。
gp96陪伴的肽对CD8 CTL的高效交叉敏化当与EG7比较时，EG7-gp96_Ig分 泌gp96-Ig导致OT-I扩增的急剧增加，即使两种细胞系分泌同等量的OVA(约80ng/M小 时X IO6细胞)(图6)。当比较在对异基因的3T3-0VA和3T3-0VA-gp96_I应答中的OT-I 扩增时，看到在OT-I扩增上的类似差别。Oizumi等人.J Immunol. 2007 Aug 15 ； 179 (4) 2310-7。从OVA转染的细胞中分泌的gp96-Ig包含小部分(约0. 1 %或更少)陪伴OVA肽 的gp96分子(gp96-0VA)，并且认为这些gp96分子负责OT-I交叉敏化。然而，分泌的gp96 可能还充当DC的募集和激活的非特异性佐剂，并由此增强OVA蛋白的摄取和交叉敏化。最 后，有可能gp96-Ig和OVA蛋白作为单独的分子被分泌，并且在胞外形成gp96-Ig-0VA复合 物。进行几个实验来区分这些可能性。
首先，我们比较了在腹腔内注射3T3-0VA、3T3-0VA-gp96-Ig 或 EG7、EG7gp96_Ig 和纯的OVA蛋白之后在PC和脾脏中的OT-I扩增效率的剂量-应答曲线(图9)。OVA和 gp96-Ig的分泌速率在体外通过ELISA分别被测定为每M小时分泌的纳克数。通过注射不 同的细胞数，如图9所示获得了分泌的OVA和gp96-Ig的剂量范围。在刺激后的4天测量OT-I扩增。以每M小时80-800ng的速率只分泌OVA的3T3-0VA细胞不能扩增OT-I。清楚 地，这种数量的OVA即使在存在免疫系统的异基因激活的情况下也不能交叉敏化OT-I。类 似地，即使EG7细胞表达Kb_°VA，单分泌OVA的同基因的EG7细胞只最少地扩增OT-I (图6)， 暗示OT-I的直接敏化非常低效。相比之下，当由包含OVA的肿瘤细胞分泌gp96时，每M 小时80-800ng的gp96有效地交叉敏化0Τ-Ι，并导致它们局部地以及在脾脏中扩增。相比 之下由OVA蛋白有效地交叉敏化OT-I需要3-10mg蛋白。在对OVA蛋白与包含OVA的细胞 分泌的gp96的应答中OT-I扩增上的灵敏性差异按重量是约10，000倍(图9)。考虑到分 子量以及分泌的gp96分子最多有0. 与OVA肽相伴随的事实，gp96-0VA与OVA蛋白相比 在OT-I交叉敏化活性上的差异按摩尔计是大约2千万倍。
gp96对非陪伴蛋白引起的CD8-CTL交叉敏化的佐剂活性图9中呈现的数据未解 决以下可能性即作为单独的分子而不是作为gp96-0VA复合物分泌的gp96-Ig和OVA负 责OT-I的有效的交叉敏化。为了检验该可能性，在有意将gp96和OVA作为单独分子施用 的条件下研究OT-I扩增。只分泌gp96而不分泌OVA的3T3-gp96细胞被腹腔内单独注射 或与OVA蛋白共同注射，并且按通常步骤对OT-I扩增进行定量。如在图IOA中所示，每M 小时分泌200ng gp96-Ig的异基因3T3-gp96_Ig细胞不引起非特异性OT-I扩增。同样，单 独注射的200ng和50 μ g OVA不能介导OT-I扩增。相比之下，当50 μ g的OVA与每M小 时分泌200ng gp96-Ig的3T3-gp96_Ig细胞共同注射时，几乎观察到最佳的OT-I扩增，表 明gp96充当OT-I的OVA交叉敏化的佐剂。与OVA反式作用的gp96的作用提高OT-I交叉 敏化超过单独的OVA 100-1000倍，而陪伴OVA的gp96 (顺式)提高交叉敏化超过1百万倍 (相对于单独的OVA)。作为阴性对照，尽管3T3-gp96-Ig具有同种异型(allogenicity)，它 在不存在OVA的情况下对OT-I扩增没有作用。而且，分泌200ng gp96_Ig的3T3-gp96_Ig 与共同注射的200ng OVA蛋白的组合不能交叉敏化0Τ-Ι，排除了 gp96_Ig和OVA形成胞外 复合物的可能性。
该数据暗示gp96的佐剂作用被DC的激活和胞饮作用的刺激所介导，导致OVA蛋 白的摄取和被MHC I交叉递呈至OT-I增加。尽管gp96显示出大量的对非陪伴OVA的交 叉敏化的佐剂活性，但gp96-0VA复合物通过⑶91受体的内化在获得用于I类MHC递呈的 gp96陪伴的肽上甚至更有效，并由此进一步增强交叉敏化效力。
gp96-Ig的连续分泌为过继转移的转基因⑶8细胞和内源性⑶8细胞提供了最 大的⑶8交叉敏化活性从肿瘤细胞分泌gp96的模型系统产生一个问题，即连续分泌的 gp96与推注的gp96在对OT-I交叉敏化的作用上如何进行比较。因为OVA和OT-I是人工 测试系统，所以确保用OT-I获得的数据适用于内源的非转基因CD8细胞也是重要的。重 要的是，与免疫前的小鼠相比，B6小鼠的EG7-gp96-Ig免疫提供了提高50到100倍的针 对随后的母EL4细胞攻击而不是针对Lewis肺癌的CD8依赖性保护，暗示针对内源肿瘤 抗原的 gp96 依赖性交叉敏化。Yamazaki 等人·，1999，J. Immunol. 163 :5178_5182。以约 1/20，000的CD8细胞的低频率(0. 005% )存在的内源性非转基因的OVA特异性CD8细胞 针对EG7-gp96-Ig免疫扩增到在⑶8门中的1_3%的频率，表明从较低频率开始的与OT-I 相似的扩增(数据未显示)。这些数据一起表明gp96介导的交叉敏化并不限于TCR转基因 的OT-I细胞，而且也对内源肿瘤特异性和OVA特异性CD8细胞起作用。
比较腹腔内注射从3T3-0VA-gp96-Ig培养物收集的200ng无血清的gp96_Ig-0VA的作用和注射在体内M小时内分泌200ng的3T3-0VA-gp96-Ig细胞的作用，当gp96_0VA 经推注gp96-0VA被连续分泌时观察到OT-I扩增的显著增加。该观察表明gp96的连续释 放是对没有⑶4辅助且不需要淋巴结的同源⑶8交叉敏化的最适刺激，所述gp96的连续释 放可能例如由于注射引起的进行中的细胞死亡而发生。
该研究揭示gp96陪伴的肽令人惊讶地增强交叉敏化活性，与单独的纯化蛋白相 比大于1百万倍。该发现是意义重大的，因为它为产生针对濒死细胞释放的抗原肽的CD8 CTL提供了高度敏感的机制。
在我们对抗原交叉递呈的效率的分析中，OT-I扩增用作由gp96_0VA、由 gp96+0VA、或由单独的OVA介导的抗原交叉递呈的敏感且定量的读数。所观察的OT-I扩增 上的差异只能通过不同形式的OVA的交叉递呈活性的效率来解释。gp96陪伴的OVA显然在 交叉递呈中活性最强，接着是OVA加上作为佐剂的gp96，然后是单独的0VA，在交叉敏化中 单独的OVA比陪伴的OVA活性小超过1百万倍。
但细胞由于感染或坏死而死亡时，这种gp96介导的交叉敏化机制可能在生理上 是重要的，所述坏死是一种可能伴有gp96陪伴的抗原肽的释放的过程，所述gp96陪伴的抗 原肽是从引起细胞死亡的感染8〒获取的。DC细胞和NK细胞至感染位点的吸引和激活、细 胞死亡、以及gp96释放提供了用于将抗原性的gp96陪伴的肽交叉递呈至CD8细胞和用于 产生不依赖淋巴结的原位CTL的有效途径。然后这些CTL用于清除临近的感染细胞，从而 限制感染因子的传播。
基于热休克蛋白对先天免疫系统的刺激的防御系统显然已经存在于两栖动物中 的早期脊椎动物种系发生中。随着适应性免疫的进化，似乎gp96的作用从其佐剂功能扩展 到用于CD8 CTL的有效的MHC I类交叉递呈和交叉敏化的具体抗原的载体的作用。
为了支持该模型和假设，我们提供了如下证据，即gp96的原位分泌导致能够局部 激活同源CD8细胞的大量DC细胞和NK细胞的局部募集和激活。在对gp96的分泌应答中 的DC在PC中增殖但未在其他部位增殖；类似地，NK细胞只在PC中变得活化。同源CD8细 胞在PC中显示出最早的且最活跃的增殖；然而后来，CD8增殖也传播到包括脾脏的其他部 位。如在PC中在我们的模型中所暗示的那样，由gp96引起的CD8细胞的局部交叉敏化的 解释预测并要求交叉敏化过程应该能够在不存在淋巴结的情况下起作用。这在LT α ko小 鼠中被证实。重要的是，由gp96-Ig引起的有效的CD8交叉递呈不限于PC。在皮下免疫分 泌gp96-Ig的肿瘤后也观察到同样有效的⑶8交叉递呈以及全身性免疫的产生。选择腹膜 部位用于分析是由于其容易获得并且不存在见于其他部位的混杂的细胞群。
由gp96陪伴的肽引起的不依赖于淋巴结的⑶8细胞的交叉递呈与其不依赖⑶40L 和⑶4辅助一致。而DC激活如之前由其他人所显示的那样似乎是由gp96与⑶91和TLR2/4 结合所介导。在预实验中，我们能够证明抗CD91抗体完全阻断gp96介导的CD8交叉敏化。 然而⑶8细胞被⑶80和⑶86共同刺激绝对是由gp96引起⑶8交叉敏化所需的。
这些研究还显示gp96能够通过增强定居在胞外环境中的抗原蛋白的交叉敏化而 充当CTL产生的佐剂。热休克蛋白从濒死的细胞中释放可能充当通过激活DC、刺激DC对 胞外蛋白的胞饮作用以及它们的MHC I交叉递呈来激活先天免疫应答的“危险信号”。gp96 的佐剂活性也激活NK细胞，从而引发Thl应答并增强胞外感染因子的清除。
gp96杰出的交叉敏化活性的一个重要因素是其通过分泌连续、持续的释放。在我们的模型系统中，异基因或同基因的肿瘤细胞分泌gp96，允许分析体内系统中单一可变的 gp96的分泌与不分泌。该方法不需要细胞的分级分离以及抗原或gp96的纯化，从而避免了 生物化学纯化步骤伴随的潜在问题。数据显示少量gp96-肽复合物的持续(Mh)释放(分 泌)(约200ng/Mh)在CD8交叉敏化中比相同量的作为推注的gp96_肽复合物有效得多。 明显的是，免疫系统经一段时间的连续刺激，与正在进行的感染中观察到的相似，是比被快 速稀释或被吞噬细胞摄取的推注强得多的免疫刺激。初步数据暗示分泌gp96的、腹腔内注 射的活的异基因3T3成纤维细胞在被清除之前存活5-7天。分泌gp96的肿瘤细胞的辐照 或用丝裂霉素C处理既不减少其gp96分泌也不减少其体内交叉敏化活性(数据未显示)， 表明增强的CD8交叉敏化不需要细胞增殖。
除了揭示可能重要的依赖淋巴结和⑶4的免疫防御机制外，这些研究为设计有效 的细胞疫苗策略提供了基础。
实施例3 在频繁的疫苗接种或不存在B细胞的情况下免疫打破了肿瘤诱导的免 疫抑制
该实施例证明肿瘤诱导的免疫抑制是抗原非特异性的并且能够被频繁的免疫或 被B细胞的不存在克服。形成的肿瘤抑制体内CD8 T细胞的克隆扩增，体内CD8 T细胞的克 隆扩增通常在抗原特异性糖蛋白(gp)96-蛋白伴侣的疫苗接种后在无肿瘤小鼠中观察到。 形成的肿瘤抑制CD8 T细胞扩增不依赖于由CD8-T细胞受体识别的抗原的肿瘤相关性表 达。与无肿瘤小鼠相比，荷瘤小鼠的疫苗接种伴随细胞向疫苗位点的募集增加。然而，已形 成的抑制性肿瘤的排斥需要频繁的(每天)gp96疫苗接种。B细胞已知减弱T辅助细胞-1 应答。我们发现在B细胞缺陷的小鼠中，已形成的肿瘤的肿瘤排斥可以通过单次疫苗接种 实现。因此，在无肿瘤的B细胞缺陷的小鼠中，在对gp96蛋白伴侣的疫苗接种的应答中，增 强了同源CD8细胞毒性T淋巴细胞的克隆扩增。用细胞疫苗频繁接种和同时进行的B细胞 缺失可能大大增强在患者中抗癌疫苗治疗的活性。
小鼠C57BL/6J(B6)小鼠从Jackson 实验室(Bar Harbor, ME)或 Charles River 实验室(Frederick，MD)购买。具有C57BL/6J背景的Ig_m-链缺陷的小鼠[B细胞缺陷的 小鼠(BCDM)]从Jackson实验室购买。
GFP小鼠是通过生产者的友好许可获得的。C57B L/6J催产素-I(OT-I)小鼠(从 M. Bevan博士获得，华盛顿大学，西雅图，华盛顿州)表达对H_2Kb限制的鸡卵白蛋白来源的 肽257至264(SIINFEKL)特异的转基因TCR(Va2Vb5. 1. 2)。在迈阿密大学的动物设施中， 根据机构指南将GFP小鼠与OT-I小鼠杂交以产生GFP-0T-1小鼠。通过聚合酶链式反应筛 选表达ova-TCR基因的子代小鼠并通过荧光筛选GFP。所有小鼠是在6至12周使用抗原 (antigene)。
细胞系用包含所述gp96_Ig的载体pCMG-His转染EG7细胞系(从M. Bevan获 得)。用单独的载体转染对照细胞。Lewis肺癌(LLC)细胞是从美国典型培养物保藏中心 获得的，并且用pAC-neo-ova中的卵白蛋白转染或者用卵白蛋白载体和包含gp96-Ig的 pCMG-His 二者转染。将所有细胞培养在具有10%胎牛血清和庆大霉素(GIBCO)的Iscove 改良的Dulbecco培养基(GIBC0，Carl skid，CA)中。为了保持转染的细胞，将用于选择的抗 生素(G418或L-组胺醇，Sigma, St Louis, MO)添加至培养物中。
抗体以下抗体用于染色；抗CD 16/32 O. 4G2)、细胞色素-抗CDIBe (145-2C11)、26细胞色素-抗 CD5 (UCHT2)、细胞色素-抗 CDga (53-6. 7)、PE-CD19 (4G7)、PE 或 FITC-抗 NKl. 1(PK136)，以及 PE 或 FITC-抗 CDllc(HL3)从 BD PharMingen (San Diego, CA)购买。
GFP-0T-1细胞和⑶19+B细胞的纯化和过继转移脾细胞和淋巴结细胞的混合的 单细胞悬液是从GFP-0T-1小鼠获得的，并且通过氯化铵裂解耗竭红细胞。根据制造商的说 明书，通过使用抗CD8a磁性微珠和MACS柱(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)的阳性柱选择 来分选GFP-0T-1细胞。如通过流式细胞分析所确定的，分离的OT-I细胞的纯度高于95%。 在纯化的细胞上Va2和Vb5. 1. 2的表达是通过流式细胞术定量的。对于B细胞的纯化，用 抗CD19微珠(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)纯化CD19+细胞。为了在BCDM小鼠中重建B 细胞，在移植肿瘤细胞前2天将IO7纯化的细胞通过尾静脉过继转移。
体内⑶8 CTL扩增的分析为了测量⑶8+CTL的扩增，用IO6GFP-OT-I过继转移 小鼠，并在2天后通过腹腔内注射1 X IO6至4X IO6非辐照的EG7-gp96-Ig细胞免疫小鼠。 在紧接着免疫的计时间隔后，在指定时间从腹膜腔、肠系膜、主动脉旁淋巴结[引流淋巴结 (dLN)]和外周血中收集细胞。通过氯化铵裂解从样品中除去红细胞。将一百万细胞与在包 含0.5%牛血清白蛋白(苯基硼酸)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的抗⑶16/32单克隆抗体 在4°C孵育10分钟以阻断FcR的结合。此后，将细胞与指定抗体孵育30分钟。在具有CELL Quest 软件(BD Bioscience) ^ FACScan(Becton Dickinson)上分析样品。每种组织指明 的免疫细胞总数是由靶细胞的百分比和每种组织中细胞的总数计算的。
肿瘤接种和处理方案将未受辐照的EG7、LLC或LLC-ova细胞在200_mL PBS中 皮下注射到小鼠的协腹中。在LLC-ova细胞接种五天后(第5天)，通过尾静脉注射在 0. 3-mL体积PBS中的IO6纯化的GFP-0T-1。两天后，根据图中指示的时间表，通过腹腔内注 射0. 5-mL体积PBS中的IO6未受辐照的LLCova-gp96-Ig或EG7-gp96_Ig细胞免疫小鼠。 用PBS或用EG7或LLC-ova处理对照小鼠。在胁腹中的肿瘤大小以二维方式每周测量两次 持续至少20天。
统计分析通过重复测量的方差分析并通过威氏符号等级检验(Wilcoxon signed rank test)评估显著性。P < 0. 05的值被认为指示统计显著性。
已形成的肿瘤抑制不依赖TCR特异性的Gp96介导的⑶8 CTL扩增热休克融合蛋 白gp96-Ig转染到肿瘤细胞中导致分泌gp96-Ig连同gp96陪伴的肽。gp96_Ig是由IgGl 的Fc部分取代gp96的内质网滞留信号(KDEL)所产生的融合蛋白。用分泌gp96_Ig的肿 瘤细胞注射小鼠导致诱导肿瘤特异性免疫和记忆以及免受随后用相同但未转染的肿瘤攻 击的保护。由分泌的gp96-Ig产生的肿瘤免疫对gp96陪伴的肽和替代抗原是特异性的，所 述gp96陪伴的肽包括来源于肿瘤内源性抗原例如EL4特异性抗原的肽，所述替代抗原例如 转染到EL4(EG7)或LLC(LLC-Ova)中的卵白蛋白。卵白蛋白替代抗原提供了通过过继转移 卵白蛋白特异性的、0T-1 TCR转基因的⑶8细胞准确地确定体内⑶8 CTL扩增的方法。
已形成的肿瘤已知对CTL扩增是抑制性的。为了测量在存在或不存在形成的肿瘤 时的CTL应答，我们使用TCR转基因的0T-1系统，该系统中转基因CD8 CTL应答于转染卵 白蛋白的分泌gp96-Ig-OVa的同基因或异基因的肿瘤。作为可移植的肿瘤模型，我们使用 来源于被卵白蛋白转染的EL4的EG7，EG7被分类为免疫原性且高致瘤性的。此外，我们还 使用LLC和LLC-ova，它们被认为具有更小的免疫原性和高致瘤性。两种细胞系的分裂速率 都非常快，在培养物中具有8到12小时的倍增时间。
在用一百万EG7-gp96-Ig细胞(在M小时内分泌60至80-nggp96_Ig/106细胞) 单次腹腔内免疫后，在无肿瘤的小鼠中OT-I CD8 T细胞从CD8门中的较低的免疫前水平 (B0. 2% )扩增到高频率(15%到40% )(图11A)。不分泌gp96_Ig的受辐照的EG7的施 用不能引起显著的OT-I扩增。然而，在胁腹中远端位点皮下形成的EG7肿瘤的存在显著抑 制在腹膜腔中(图11A-C)和系统地在脾脏和淋巴结(未示出)中gp96-疫苗诱导的OT-I 扩增。EG7肿瘤分泌卵白蛋白并表达Kb-ova。因此，有可能过继转移的OT-I在通过肿瘤床 或肿瘤dLN再循环后变得无反应性，因为通过它们的Kb-ova特异性TCR接收信号，而不接 受共刺激信号。为了测试该假设，都不表达卵白蛋白的同基因肿瘤EL4和LLC在远端位点 皮下被形成。随后，通过静脉注射过继转移OT-I并像以前一样用EG7-gp96-Ig腹腔内免疫 小鼠。已形成的EL4和LLC在由分泌的gp96-OVa抑制OT-I扩增上与已形成的EG7同样有 效，表明抑制不依赖肿瘤中的适当的TCR抗原Kb-0Va(图11B，C)。尽管在腹膜腔中和系统 地OT-I扩增被远端位点LLC和EL4的存在抑制，出人意料地，在EG7-gp96_Ig腹腔内免疫 时免疫到腹膜腔中后总的细胞募集当与无肿瘤小鼠比较时实际上增加了(图11D)。
数据表明已形成的肿瘤能够引起对CTL扩增的抗原非特异性抑制的诱导。这种抑 制的诱导与细胞向腹膜腔内的疫苗位点募集增加有关。正在研究这种细胞募集的增加是否 负责⑶8T细胞的抑制。
为了克服抗原非特异性免疫抑制，这些实验测试了是否通过疫苗接种对⑶8CTL 的频繁重复的抗原特异性刺激可以抵抗荷瘤小鼠中发现的抑制活性。
已形成的肿瘤的排斥需要频繁的Gp96_Ig免疫尽管包括分泌的gp96_Ig在内的 许多疫苗接种策略能够在小鼠中建立针对肿瘤和肿瘤抗原的保护性免疫，但通过治疗性疫 苗接种排斥已经形成的肿瘤是更困难的。鉴于观察到CD8扩增的抗原非特异性抑制，我们 分析不同的疫苗接种时间表如何影响肿瘤排斥和/或肿瘤生长。
我们最初通过在肿瘤移植同一天开始疫苗接种来分析治疗性疫苗接种的作用。 将一百万EG7肿瘤细胞皮下移植在同基因小鼠的胁腹中。在同一天(第0天)，将以60 至80ng/106细胞XM小时的速率分泌gp96-Ig的一百万分泌gp96_Ig的EG7疫苗细胞 (EG7-gp96-Ig)作为疫苗腹腔内施用，并在第3、7、10和14天重复疫苗接种。与不接受治 疗的小鼠相比，在肿瘤移植同一天开始的4 EG7-gp96-Ig疫苗接种显著减少肿瘤生长(P = 0. 0078)(图12A)。治疗作用是gp96和抗原依赖性的。不分泌gp96_Ig的受辐照的EG7 (图 12A)或不表达EG7抗原但以与EG7-gp96-Ig相同的速率分泌gp96_Ig的LLC-gp96_Ig(图 12B)当作为疫苗以与EG7-gp96-Ig相同的剂量和时间表腹腔内施用时不能延缓肿瘤生长。 当在EG7接种后2天或2天以后开始用EG7-gp96-Ig疫苗接种时，使用相同疫苗接种时间 表的治疗作用实质上减少了(图12A)。这些数据显示甚至在2天后，通过疫苗接种形成的 肿瘤比新鲜移植的肿瘤更难控制。
还测试了是否形成3天或更多天的肿瘤可以被更频繁的疫苗接种时间表控制。在 胁腹中皮下移植一百万EG7肿瘤细胞，并使其形成3至7天，允许至少7倍或更多肿瘤细 胞倍增。在该时间内，发生了可目测的肿瘤结节的血管化作用。然后小鼠每天用一百万 EG7-gp96-Ig细胞腹腔内接种，或者在特异性对照中，用相同时间表和剂量的LLC-gp96-Ig 细胞或受辐照的EG7细胞接种，或者不接种。每天用EG7-gp96-Ig疫苗接种显著(P = 0. 0078)并有效地控制已形成3天的EG7的生长(图12B)，而每天用受辐照的EG7或用LLC-gp96-Ig疫苗接种对已形成的EG7的生长没有作用(图12B)。在进一步的研究中，我 们允许移植的EG7肿瘤在开始用EG7-gp96-Ig疫苗接种前5天和7天形成。如在图12C和 12D中所示，每天两次疫苗接种是在肿瘤形成后期延迟肿瘤生长所需的。该数据显示频繁的 免疫能够在M天的时间检验小鼠中的肿瘤生长。将需要进一步研究来确定持续的长期疫 苗接种时间表是否能够完全根除肿瘤。
为了验证用免疫原性EG7淋巴瘤获得的数据，用较小免疫原性的、已形成的LLC重 复实验(图13)。在肿瘤移植后第三天开始用LLC-gp96-Ig进行重复的腹腔内免疫(第3、 7、10和14天)导致LLC肿瘤演进的显著(P = 0.0234)延迟。每天的LLC免疫并非在肿瘤 延迟中更有效。免疫的作用是肿瘤特异性的，因为EG7-gp96-Ig疫苗接种不能控制LLC肿 瘤生长。肿瘤生长控制也不能通过受辐照的LLC实现，但是依赖gp96-Ig分泌。
这些数据暗示与由分泌的gp96_Ig及其陪伴的肽引起的抗原交叉递呈相联合的 频繁的DC细胞和NK细胞的激活能够克服已形成的肿瘤诱导的抗原非特异性免疫抑制。
gp96介导的DC细胞和NK细胞的募集以及⑶8 CTL扩增在BCDM中增强几个小组 已报道当与野生型(WT)小鼠比较时T辅助细胞-1的抗肿瘤应答在BCDM中增强。因此我们 研究了 B细胞在gp96介导的CTL扩增和抗肿瘤免疫中的作用。腹膜腔集聚了 CD5+CD19+B 细胞和⑶5+⑶19+B1-B细胞，后者产生IgM抗体并且在激活时不经历同种型转换(图14A)。 在用EG7-gp96-Ig腹腔内免疫时，⑶5+⑶19+群到免疫后第4天增加了约5倍，而⑶5+B1-B 细胞仅适度增加(图14A)。gp96介导的OT-I扩增在免疫后第4天和第5天是最大的。 gp96介导的OT-I扩增之前是募集到疫苗接种部位腹膜腔内的DC细胞和NK细胞中以及腹 膜腔内的DC细胞和NK细胞的激活。如之前所显示的，NK细胞是gp96-Ig介导的⑶8 CTL 扩增的重要促进者。在BCDM中，DC向腹膜腔(疫苗位点)中募集与在疫苗接种后第2天 在野生型小鼠中的募集相似。然而，尽管DC数目到疫苗接种后第4天在野生型小鼠中减少 了 50%，但是在B细胞缺陷小鼠中的DC数目仍保持在相同的高频率(图14B)。在BCDM中 NK细胞的募集在第2天和第4天增加(图14B)。差异并没有达到显著性，但是在3个独立 实验中是可再现的。野生型B细胞向BCDM过继转移消除了 DC滞留的增加和NK细胞的募 集。该发现暗示B细胞影响gp96诱导的先天免疫细胞的募集，并且暗示B细胞可能还参与 调解或抑制⑶8CTL扩增。
因此，还测试了 GFP标记的OT-I⑶8 CTL的扩增是否作为对gp96免疫应答在BCDM 中增加。如图15所示，在BCDM中gp96免疫后OT-I扩增在第5天与野生型小鼠相比显著增 强。重要的是，OT-I在腹膜腔中免疫后第7天和第12天继续显著更高的频率(P = 0. 04) (图15A)在dLN(图15B)中，OT-I的扩增和滞留也增加了，然而没有达到显著性。在免疫之 前野生型B细胞向BCDM过继转移将OT-I扩增降低至等于或低于野生型小鼠中看到的水平 (图15A，B)。B细胞的存在抑制OT-I的扩增不受白介素(IL)-IO的产生介导，因为IL-10 缺陷的小鼠表现出与野生型小鼠相似的OT-I扩增，而不是在BCDM中看到的增强的扩增。
gp96介导的已形成的非免疫原性肿瘤的排斥在不存在B细胞的情况下增强如以 上所示，在野生型小鼠中已形成的EG7肿瘤的生长控制最低限度地需要每天的gp96免疫。 类似地，可以通过频繁的免疫延迟LLC演进。EG7和EL4细胞在BCDM中被排斥并且没有形 成肿瘤；然而，尽管LLC和LLC-ova比在野生型小鼠中生长速率慢，但它们可以在BCDM中形 成。LLC-ova在BCDM和野生型小鼠中在胁腹中皮下形成5天。经静脉内过继转移OT-I，并且2天后，以单剂量腹腔内施用一百万LLC-OVa-gp96-Ig并监测胁腹内的肿瘤生长。在野生型 小鼠中，用LLC-OVa-gp96-Ig单次免疫引起胁腹中肿瘤演进的显著延迟，但是不能排斥肿 瘤(图16A)。相比之下，在BCDM中，单次免疫导致3只小鼠中已形成的、7天LLC-ova肿瘤 的完全排斥和在2只小鼠中的显著的肿瘤皱缩(图16B)。在不存在治疗的情况下，LLC-ova 在BCDM中渐进地生长(图16B)，尽管以比在野生型小鼠中慢的速率生长(图16A)。BCDM 中的B细胞重建(图17C)使得疫苗接种的作用与在野生型小鼠看到的相似(图16A)，即演 进的延迟。将感兴趣的是确定由抗体引起的完全或部分的B细胞耗竭是否具有与B细胞缺 陷相似的作用。进行中的初步研究似乎支持这一方法。
单次免疫对BCDM中已形成的LLC的最佳肿瘤控制依赖于数目足够高的肿瘤特异 性CTL前体(0T-1)并依赖于抗原特异性免疫(LLCOVa-gp96-Ig)。在BCDM中，存在一百万 过继转移的OT-I而没有gp96免疫在大多数小鼠中并没有导致肿瘤的排斥(图17A)。同 样，单独的gp96免疫而没有OT-I转移不如组合有效(图17B)。
完全理解已形成的肿瘤抑制抗肿瘤免疫。肿瘤特异性T细胞在已形成的肿瘤的存 在下变得无反应性。对该研究中使用的B细胞淋巴瘤无反应性是抗原特异性的、MHC限制 的，并且依赖于MHC匹配的骨髓来源的抗原递呈细胞的存在。在其他研究中，抗原非特异性 骨髓抑制性细胞和T调节性细胞与抗肿瘤免疫的抑制有关。我们的研究显示体内CTL应答 的抑制可以通过不依赖抗原的途径由已形成的肿瘤实现。在对gp96-OVa疫苗接种应答中 的OT-I⑶8 CTL扩增受已形成的肿瘤抑制而不依赖于肿瘤表达的卵白蛋白。这种抑制类 型可以通过T调节性细胞或通过其他抑制性细胞诸如骨髓抑制性细胞或M2巨噬细胞来实 现。根据这一假设，通过转移荷瘤小鼠中由gp96疫苗接种引发的腹膜细胞，在初步实验中 的抑制活性可转移至无肿瘤的小鼠。
尽管对gp96-OVa免疫的OT-I应答在存在已形成的肿瘤的情况下被强烈抑制，但 是它总体上未被阻断，暗示在由已形成的肿瘤引起的免疫抑制与疫苗诱导的CD8 CTL激活 之间存在平衡，所述疫苗诱导的CD8 CTL激活是通过被分泌的gp96-OVa刺激的激活的DC的 抗原交叉递呈而进行的。我们之前已经显示，在肿瘤中，固有的小鼠gp96-OVa导致NK细胞 和DC的募集和激活，接着是OT-I的扩增。已形成的肿瘤尽管实际上通过LLC-gp96-Ig的 疫苗接种增强了细胞向腹膜腔中的募集，但它们抑制OT-I扩增，暗示在存在已形成的肿瘤 的情况下，许多募集的细胞可能是抑制性细胞。这一假设预测用gp96-OVa频繁的免疫可以 通过将这种平衡从抑制转换成增加的免疫激活来克服抑制活性，所述增加的免疫激活是通 过重复的gp96介导的DC细胞和NK细胞刺激、增加的抗原交叉递呈和CTL敏化实现的。实 际上，频繁的免疫对延迟肿瘤演进具有显著作用。在已形成的EG7的情况下，每天一次或两 次疫苗接种在停止肿瘤演进上比每两天或三天一次疫苗接种有效得多。对于LLC，每隔一天 或每三天一次免疫是足够的，并且每天免疫并非更有效。这些肿瘤特异性差异可能与由外 周肿瘤的存在产生的抑制性细胞的速率有关。作为替代，这可能取决于肿瘤介导抑制性细 胞的诱导或已诱导的抑制性细胞的性质所凭借的机制。
通过研究OT-I对分泌gp96-OVa的肿瘤的腹腔内免疫应答，我们注意到大量B细 胞被募集到为疫苗位点的腹膜腔中。已报道B细胞对抗肿瘤免疫具有抑制性，从而就其在 gp96介导的OT-I扩增中的作用提出问题。使用BCDM，立即变得清楚的是，NK细胞和DC在 腹膜腔中的募集和滞留增加，并且OT-I扩增在gp96-OVa免疫后增强。B细胞重建的BCDM像野生型小鼠一样应答于gp96-OVa介导的OT-I扩增，排除了以下可能性即B细胞缺陷 以与B细胞的不存在无关的方式改变BCDM对gp96-OVa免疫的应答性。B细胞缺陷不仅引 起增强的OT-I扩增，而且促使在单次gp96-Ig免疫后形成7天的LLC-ova肿瘤的肿瘤排斥 强烈增强。该数据暗示肿瘤介导的抑制性细胞的诱导在不存在B细胞的情况下大大减小或 者B细胞本身充当“抑制性细胞”。B细胞是否参与抑制性细胞的诱导或B细胞本身是否对 CTL应答是免疫抑制性的需要进一步研究；然而，IL-10似乎没有参与B细胞介导的肿瘤免 疫的抑制。在正在进行的研究中，我们已发现0X40-L缺陷的B细胞显示抑制抗肿瘤免疫应 答的能力降低。
这些研究提供了一个模型，通过该模型可以研究和进一步确定不依赖抗原的免疫 抑制。B细胞在该过程中的具体作用将是极其令人感兴趣的。此外，这些研究指向可使抗肿 瘤疫苗更为有效的方法。用抗体和随后的频繁疫苗接种，例如用分泌gp96的肿瘤疫苗，对 B细胞的耗竭可能导致比常规疫苗接种方法看到的对肿瘤生长更为有效的控制。
实施例4 由热休克蛋白gp96的疫苗接种引起的抗肿瘤作用在不存在B细胞的情 况下增强。
在不存在B细胞的情况下gp96的抗肿瘤活性增加免疫学上肿瘤排斥通常依赖于 在Thl偏倚的抗肿瘤免疫应答过程中细胞毒性CD8细胞的产生。肿瘤逃逸策略通常包括向 Th2偏倚的体液应答(包括Th2细胞因子的产生)的免疫偏离。因为Th2应答与B细胞激 活和THl极化的反馈抑制有关，我们测试针对gp96的抗肿瘤免疫应答是否受B细胞的不存 在影响。作为肿瘤系统我们使用LLC-ova作为替代抗原，LLC-ova是一种用卵白蛋白转染 的自发性可移植的肺癌。LLC-ova是非免疫原性的、快速生长的(16小时的分裂时间)，并 且在大约四周内是致命性的。进一步用gp96-Ig转染LLC-ova以产生LLC-OVa-gp96-Ig， LLC-ova-gp96-Ig是以M小时内分泌(Song) 1百万细胞的速率分泌gp96_Ig的肿瘤。 LLC-gp96-Ig介导强烈的同源⑶8-CTL激活并产生抗肿瘤免疫。使用这种免疫模型来评估 B细胞的不存在对抗肿瘤应答的作用。将LLC-ova皮下地移植在野生型小鼠和B细胞缺陷 (pMT)小鼠的胁腹中，并且使其形成7天，在该时间后(第0天)腹腔内注射1百万活的 LLC-OVa-gp96-Ig细胞。在用LLC-gp96-Ig免疫前两天静脉内给予(IO6细胞)TCR转基因 OT-I细胞，所述TCR转基因OT-I细胞检测由ICb呈现的来源于卵白蛋白的肽SIINFEKL。甚 至在OT-I存在时，野生型小鼠中的LLC-ova在不存在免疫的情况下渐进地生长(图16)。 一次腹膜内注射一百万LLC-OVa-gp96-Ig细胞延迟肿瘤生长但不能介导完全的肿瘤排斥。 在B细胞缺陷的小鼠中LLC-ova也在所有小鼠中形成渐进性肿瘤，但肿瘤演进比在野生型 小鼠中慢。用分泌gp96的LLC-ova免疫具有形成7天的肿瘤的B细胞缺陷的小鼠导致完 全的肿瘤排斥。肿瘤在6周的继续研究期间没有复发。
显然在这个模型肿瘤系统中B缺陷的小鼠能够在存在肿瘤特异性前体CTL(OT-I) 的频率升高的情况下建立对gp96免疫的肿瘤排斥应答。肿瘤排斥依赖两种组分，因为在不 存在过继转移的OT-I的情况下，对LLC-OVa-gp96-Ig的抗肿瘤应答显著减少(图17B)。类 似地，单独的OT-I不能排斥没有免疫的LLC-0Va(图17A)。在B细胞缺陷小鼠中通过转移 野生型B细胞来重建B细胞消除了 gp96排斥已形成的肿瘤的能力(图17C)。显然不存在 正常的B细胞是B缺陷的小鼠中肿瘤排斥应答增强的原因。
在B缺陷的小鼠中增强的⑶8 CTL克隆扩增基于gp96的免疫在B缺陷的小鼠中排斥已形成的LLC-ova肿瘤的能力提高暗示⑶8 CTL激活的增加。使用gfp标记的OT-I细 胞我们比较了在免疫B缺陷的小鼠和野生型小鼠后OT-I细胞的克隆扩增。OT-I细胞被静 脉内过继转移，并且在两天平衡期后用LLC-OVa-gp96-Ig注射小鼠。在免疫后第5、7和12 天，在腹膜腔中以及在引流的肠系膜淋巴结和主动脉旁淋巴结中确定gfp-OT-I的频率。在 免疫之前腹膜腔中实质上没有0Τ-Ι，并且它们在引流淋巴结中的频率在CD8门中是0.5%。 如之前所报道的，分泌gp96的肿瘤在野生型小鼠中介导强烈的⑶8 CTL扩增，在第5天最 大。不分泌gp96-Ig的LLC-ova不扩增OT-I。扩增后面是下一周的收缩(图15)。在B缺 陷的小鼠中，CD8CTL扩增一致地增加到在野生型小鼠中看到的数目的近似两倍。
用野生型B细胞重建B细胞缺陷的小鼠产生了与野生型小鼠在表型上不能区别的 CD8应答。用分泌gp96的肿瘤细胞腹膜内免疫导致包括B细胞、树突细胞和NK细胞在内的 大量免疫细胞的募集。在野生型小鼠中，B细胞累积在动力学上与CD8 CTL扩增相符，二者 均在第3天到第5天之间最大地发生。在gp96-Ig免疫后最初48小时期间，DC细胞和NK 细胞被募集到腹膜腔中。在不存在B细胞的情况下，DC细胞和NK细胞的募集增加，而用野 生型B细胞重建B细胞缺陷的小鼠恢复了 DC细胞和NK细胞的野生型水平的募集。
OT-I细胞和⑶19+B细胞的纯化和过继转移脾细胞和淋巴结细胞的混合的单细 胞悬液是从gfp-οτ-ι小鼠获得的，并且通过氯化铵裂解耗竭红细胞。根据制造商的说明 书，通过使用抗CD8a磁性微珠和MACS (Miltenyi Biotec，Auburn，CA)的阳性柱选择来分选 gfp-OT-I细胞。如通过流式细胞分析所确定的，分离的OT-I细胞的纯度高于95%的⑶8 阳性。在纯化的细胞上Va2和VP5. 1.2的表达是在注射前通过流式细胞术定量的。为了纯 化B细胞，在相同步骤下用抗⑶19微珠纯化⑶19+细胞。为了在pMT小鼠中重建B细胞， 在接种LLC-ova细胞前2天将10'纯化的细胞通过尾静脉过继转移。
肿瘤接种和处理方案将未受辐照的LLC或LLC-ova细胞在200plPBS中皮下注 射到小鼠的协腹中。在LLC-ova细胞接种后五天(第5天)，通过尾静脉注射在0.3ml体 积PBS中的IO6纯化的0Τ-Ι。在第7天，用腹腔内注射在0. 5ml体积PBS中的非受辐照的 lo6 LLC-ova-gp96-Ig细胞免疫小鼠。作为非处理对照，在第5天和第7天用PBS处理小 鼠。每周两次以二维方式测量肿瘤大小持续至少20天。为了研究OT-I扩增，在过继转移 106gfp-0T-I后用腹腔内注射4X 10 非受辐照的EG7-gp96-Ig细胞免疫小鼠。为了评价 在利妥昔单抗(RituximabR)处理的人CD20转基因小鼠中的肿瘤生长，在第4天用腹腔内 注射在0. 5ml PBS中的Img利妥昔单抗或单独的PBS处理小鼠。除了利妥昔单抗处理以外， 实验细节按照以上提到的相同方案。
流式细胞术分析在计时的间隔后，以指定的次数从肠系膜淋巴结和主动脉旁淋 巴结(dLN)以及腹膜腔中收集细胞。为了检验在Rituximab 处理后表达人类⑶20的B 细胞的耗竭，在注射后一周获得外周血细胞。通过氯化铵裂解从样品中除去红细胞。首先， 将一百万细胞与在包含0. 5% BSA的PBS (PBA)中的抗⑶16132mAb在4°C一起孵育10分钟 以阻断FcR结合。此后，将细胞在指定抗体中孵育30分钟。在具有CELL Quest软件(BD Bioscience)的FACScan(Becton Dickinson)上分析样品。每种组织指明的免疫细胞总数 是由靶细胞的百分比和在每种组织中细胞的总数计算的。在肿瘤生长上统计分析的显著性 差异是通过重复的方差分析检验评估的，P < 0. 05的值被认为指出了统计显著性。
权利要求
1.一种药物组合物，所述药物组合物包括用真核表达载体转染的肿瘤细胞，所述真核 表达载体包含编码分泌形式的gp96多肽的核酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分泌形式的gp96多肽是包括gp96多肽和 免疫球蛋白信号肽(IgSP)的融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述IgSP选自由小鼠IgSP、大鼠IgSP、猪IgSP、 猴IgSP、人IgSP组成的组。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述IgSP是小鼠IgSP。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述IgSP是人IgSP。
6.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括至少一种针对B细胞抗原的抗体。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述抗体选自由低于人类的灵长类抗体、鼠单克 隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体组成的组。
8.如权利要求6所述的组合物，其中所述抗体是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
9.如权利要求6所述的组合物，其中所述B细胞抗原选自由⑶19、⑶20、⑶22、HLA-DR 和⑶74组成的组。
10.一种在人类受治疗者中产生保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受治疗 者施用有效量的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌形式的gp96多肽的核酸的真核 表达载体转染。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述分泌形式的gp96多肽是包括gp96多肽和 免疫球蛋白信号肽(IgSP)的融合蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述IgSP选自由小鼠IgSP、大鼠IgSP、猪IgSP、 猴IgSP、人IgSP组成的组。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述IgSP是小鼠IgSP。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述IgSP是人IgSP。
15.如权利要求10所述的方法，其中gp96免疫在大约1周到大约6周的时间段被每天施用两次。
16.如权利要求10所述的方法，其中gp96免疫在大约1周到大约6周的时间段被每天施用一次。
17.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括向所述受治疗者施用包括药学上可接 受的载体和至少一种针对B细胞抗原的抗体的治疗性组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述治疗性组合物以每剂20mg至2000mg的剂量 被胃肠外施用。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述受治疗者以重复的胃肠外剂量接受所述抗体。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述抗体选自由低于人类的灵长类抗体、鼠单克 隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体组成的组。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述抗体是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述B细胞抗原选自由⑶19、⑶20、⑶22、HLA-DR 和⑶74组成的组。
23.一种在人类受治疗者中产生保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp96多 肽的核酸的真核表达载体转染。
24. —种制造针对癌症的疫苗的方法，所述方法包括基因修饰癌细胞群以表现编码核 酸的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞用包含编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp96多肽的核酸的 真核表达载体转染。
全文摘要
本发明提供了被基因修饰以表达编码分泌形式的热休克蛋白(hsp)gp96多肽的核酸的肿瘤细胞。本发明还提供了通过施用被基因修饰以表达编码分泌形式的gp96多肽的核酸的肿瘤细胞来刺激对肿瘤的免疫应答的方法。
文档编号A61K48/00GK102036677SQ200980118345
公开日2011年4月27日 申请日期2009年3月19日 优先权日2008年3月20日
发明者埃克哈德·R·波达克, 约瑟夫·R·罗森布拉特 申请人:迈阿密大学