专利名称：重组幽门螺杆菌血型抗原粘附素的制作方法
技术领域：
本发明涉及幽门螺杆菌粘附素，特别是一种重组幽门螺杆菌血型抗原粘附素。
背景技术：
长期以来，人们已知人胃粘膜中存在螺形菌(Bizzozero，1893)。不过，直到Marshall和Warren从胃溃疡患者的胃粘膜中成功地分离出并培养这种细菌时，人们才认识到它们是致病性细菌这一事实(Warren和Marshall，1983；Marshall等，1984)。最初的分析表明，分离出的微生物是革兰氏阴性螺形菌，它具有极高的游动性和能在强酸性条件下(约达pH1.5)存活的非凡能力。这些最初被称为幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)的细菌最终根据生化和形态特征归入新确立的“螺杆菌(Helicobacter)”属(Goodwin等，1989)。
几年来，从Taylor和Blaser(1991)所做的流行病学研究表明，幽门螺杆菌感染在全球范围内发生，约有50％人口受到这种细菌感染，发展中国家比工业化国家的感染率更高。并随年龄的提高，慢性幽门螺杆菌感染的概率急剧增大。因此，慢性幽门螺杆菌感染是人类最常见的慢性细菌感染之一。
目前已经知道，这种感染不可避免地导致人类细菌性胃炎(B型胃炎)的诱发。另外，还假设幽门螺杆菌在胃溃疡和十二指肠溃疡以及某些形式的胃癌(腺癌)的发展中起诱因作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。更少见被视为免疫系统B细胞瘤的先兆的胃MALT(粘膜相关淋巴组织)淋巴瘤大概也是幽门螺杆菌感染的结果。对这类病人进行的能成功根除幽门螺杆菌的抗菌治疗导致胃溃疡和低级MALT淋巴瘤的治愈(Spponen和Hyvarinen，1993；Isaacson和Spencer，1993；Stolte和Eidt，1993)。
长期受幽门螺杆菌感染的一个后果是萎缩性胃炎，粘性、产酸或产胃蛋白酶的胃上皮细胞变性，被视为癌前期损害。根据1980年对全球最常见癌症类型的统计结果，胃癌位居第二，但有下降趋势(Parkin等，1988)。研究表明了幽门螺杆菌感染和胃癌发生(肠型)之间的统计学显著相关性；两者得出的结论都是，发生的全部胃癌中约有60％大概是幽门螺杆菌感染的结果(Parsonnet等，1991；Nomura等，1991)。Sipponen(1992)所做的进一步研究表明，许多工业化国家中受到感染的人有20％以上在其一生中患上胃溃疡或十二指肠溃疡；而对胃粘膜正常的人而言，这种危险性小得可以忽略。这类常见的胃-十二指肠疾病必被视为传染病并需适当治疗(Alper，1993)。消除已发生的慢性幽门螺杆菌门螺杆菌感染的一项疗法会治愈胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡或者MALT淋巴瘤。因此，可以采用防止幽门螺杆菌感染的预防性疗法(例如，免疫接种)以及消除已发生的幽门螺杆菌感染的疗法来治疗这类常见的胃-十二指肠疾病。
细菌从口摄入后，首先到达极酸的胃腔(pH1-2)中。在此，通过产生脲酶这种酶使细菌可能存活，所述脲酶造成已有脲的分解，从而引起胃中酸性pH值的局部中和。借助趋化定向和依赖于鞭毛的游动性，微生物再移动到胃窦区的碳酸氢盐缓冲的粘膜层，它们在此处于独特的生态小境中，由于酸性屏障作用，只有几种竞争性细菌能进入该生态环境。为到达上皮，微生物大概借助于腔(pH1-2)和上皮细胞表面(Ph6-7)之间的pH梯度进行自身定向。由于其螺形、其在粘膜的游动性、粘膜修饰酶的产生及其微需氧的生活方式，这些细菌最佳地适应了该栖所中的生活条件。
它们通常生活在窦区的深腺(deep crypts)中，在此免受如酸、胃蛋白酶这样的外界影响，也免受如抗生素这样的药物对其进行的清除。部分菌群(约20％)与上皮细胞、特别是产粘液细胞密切相关。在胃化生的条件下即在十二指肠中由酸诱发的胃上皮形成的条件下，十二指肠中的化生区也被移生；这就产生了十二指肠溃疡发展的前提。随流出的粘液完全排出大概受到其粘附能力的阻碍，这样细菌就可以存活几年、几十年或者甚至一生(慢性感染)。
在知道幽门螺杆菌的存在和其对溃疡病的意义之前，是用所谓的解酸剂或H2-受体拮抗剂进行治疗的。虽然能抑制胃壁细胞分泌酸，通常能治愈溃疡，但却不能由此消除溃疡病。
更为常用的溃疡疗法是铋处理。各种铋盐(CBS、BSS)对幽门螺杆菌都有杀菌效果。但仅在8-32％的病例中达到完全清除细菌的效果。这种处理表面上造成细菌的暂时抑制，但停止处理后多数病例中感染会再次发作。用高剂量长期治疗会导致这些物质在肝、肾和神经系统中的积累，具有相当大的神经学副作用(Malfertheiner，1994)。
受幽门螺杆菌感染会导致胃粘膜的慢性炎症反应(胃炎)。另外，诱发对幽门螺杆菌抗原的特异性全身免疫反应，发炎的结果是在胃粘膜和亚粘膜中存在多种免疫细胞，例如多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞(Blaser，1992)。此外，幽门螺杆菌在体外激活嗜中性白细胞、单核细胞和巨噬细胞(Mai等，1991)。用特异性抗体和补体进行的实验表明，在体外嗜中性白细胞使幽门螺杆菌迅速失活。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术的不足之处，提供一种运用PCR技术克隆幽门螺杆菌血型抗原基因并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，提高抗血清可阻止幽门螺杆菌粘附于胃粘膜上皮细胞的重组幽门螺杆菌血型抗原粘附素。
本发明的目的是这样实现的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列；和(a)它编码一种能粘附人细胞的多肽，(b)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(c)细胞被载体所转化；及(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人细胞。
除了序列号1所示核苷酸序列和在遗传密码简并性范围内与该序列相应的核苷酸序列之外，本发明还包括在严格条件下与这些序列之一杂交的DNA序列。本发明包括在些洗涤条件下与序列号1所示核苷酸序列之一杂交或与在遗传密码简并性范围内的相应核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明的DNA分子最好编码能粘附到人细胞上、特别是人胃上皮细胞上的多肽。此外，本发明的DNA分子最好在核苷酸水平上与序列号1所示核苷酸序列有至少70％、特别优选至少90％的同源性。而且，该DNA分子的长度最好至少为45个核苷酸，优选至少50个核苷酸。
本发明的又一个目的是含本发明DNA分子的至少一个拷贝的载体。该载体可以是最好在表达信号(启动子、操纵基因、增强子等)控制下本发明DNA分子位于其上的任何原核或真核载体。原核体的例子有象噬菌体(例如λ噬菌体)这样的染色体载体以及象质粒这样的染色体外载体，而环状质粒载体是特别优选的。
本发明的载体也可以是真核载体例如酵母载体或者是适于高等细胞的载体(例如，质粒载体、病毒载体、植物载体)。
本发明的又一目的是用本发明载体转化的细胞。在一优选实施方案中，该细胞是原核细胞、优选革兰氏阴性的原核细胞、特别优选大肠杆菌细胞。不过，另一方面，本发明的细胞也可以是真核细胞，例如真菌细胞(如酵母)、动物或植物细胞。
本发明还涉及由本发明DNA分子编码的多肽。该多肽最好能粘附人细胞，并且包括(a)序列号1所示氨基酸序列，或(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的氨基酸序列。
本发明的多肽最好与序列号1所示核苷酸序列有至少90％的同源性，最优选至少98％的同源性。
本发明的多肽最好通过下述方法生产用本发明的DNA分子或载体转化一种细胞，在多肽能得以表达的条件下培养转化的细胞，从细胞或/和培养物上清液中分离多肽。该方法中可获得融合多肽以及非融合多肽形式的本发明多肽。
本发明的多肽也可用作免疫原来产生抗体。因此，本发明还涉及抗本发明多肽的抗体。
本发明另一方面涉及一种药用组合物，它包含作为活性物质的本发明的DNA分子、本发明的多肽或本发明的抗体，选择性地含有常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。
一方面，本发明的药用组合物可用于诊断幽门螺杆菌感染。
另一方面，该药用组合物也可用于防止或治疗幽门螺杆菌感染。对治疗应用而言，将多肽或其片断用于产生主动疫苗，或将抗体用于产生被动疫苗。
蛋白电泳分析结果发现，经诱导后高效表达相对分子量为78 000的蛋白，凝胶自动扫描分析，其重组黏附素血型抗原蛋白占菌体总蛋白的34.8％，其中分泌表达占周质总蛋白的22.7％，可溶性表达占上清的15.0％，包涵体占沉淀的86.7％。
动物实验表明重组黏附素血型抗原蛋白是制备Hp疫苗的一种新抗原。同时，体外黏附实验证实重组黏附素血型抗原的抗血清可阻止幽门螺杆菌黏附于胃黏膜上皮细胞。
本发明具有运用PCR技术克隆幽门螺杆菌血型抗原基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，提高抗血清可阻止幽门螺杆菌粘附于胃粘膜上皮细胞和提高免疫原性等优点。
图1是本发明的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，图2是本发明的重阻质粒PET-22b(+)/血型抗原粘附素的双酶鉴定图谱，图3是本发明的血型抗原粘附素重组蛋白的SDS-PAGE分析图，图4是序列表。
具体实施例方式
下面将结合附图和实施例对本发明的作进一步的详述如图1～3所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列；在核酸水平上它与序列号1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的长度至少为45个核苷酸；(a)它编码一种能粘附人细胞的多肽，(b)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(c)细胞被载体所转化；多肽，它由DNA分子所编码，它包括(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人细胞。产生多肽的方法，载体转化一种细胞，在多肽得以表达的条件下培养转化的细胞，并从细胞或/和培养物上清液中分离出多肽。多肽作为免疫原产生抗体的应用和多肽的抗体。药用组合物，(a)它包含作为活性物质的DNA分子、多肽或者抗体，选择性地包含常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体，(b)药用组合物用来诊断幽门螺杆菌感染的应用，(c)药用组合物用于生产防止或治疗幽门螺杆菌感染用的药剂的应用。
利用基因克隆技术对血型抗原黏附素的基因进行了克隆和表达并研究了其免疫防治作用。
1材料与方法1.1质粒和菌株菌株BL21(DE3)、质粒pET-22b(+)和幽门螺杆菌SS1为第一军医大学南方医院消化研究所保存。
1.2工具酶及试剂限制性内切酶NotI、NocI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶购自New EnglandBiolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准λDNA/EcoR I+Hind III购自华美生物工程公司，琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司，测序质粒纯化试剂盒购自美国Qiagen公司，其它试剂为国产分析纯。
1.3Hp染色体DNA的提取从固定培养基上刮取生长良好的Hp菌落，按基因组DNA小量制备法制备，详见参考文献[1]。
1.4质粒的提取及纯化质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法，详见参考文献[2]。
1.5目的基因的PCR扩增设计引物，在其5’端加上合适的限制性酶切位点，由博亚公司合成。
序列如下血型抗原黏附素15’ -TG GCC ATG GAT AAA AAA CAC ATC CTT TCA-3’NcoI血型抗原黏附素25’ -AG TGC GGC CGC ATA AGC GAA CAC ATA G-3’NotI热启动法进行PCR，95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后再延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。
1.6DNA片段的酶切、连接、转化和阳性克隆的鉴定质粒和目的基因DNA经NotI和NotI双酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4连接酶作用下16℃连接12h，转化宿主菌BL21(DE3)，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。
1.7序列测定及分析碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆质粒，用自动测序仪进行序列分析。
1.8诱导表达和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳血型抗原黏附素阳性克隆经IPTG诱导表达后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.9动物实验对已经感染幽门螺杆菌的小鼠通过黏膜途径给予血型抗原黏附素，观察治疗作用。对未感染幽门螺杆菌的小鼠先通过黏膜途径给予血型抗原黏附素，然后再用幽门螺杆菌进行攻击，观察保护作用。
1.10光镜定量计数法测定粘附活性MGC-803细胞接种于带盖玻片的6孔板中培养至形成单细胞层，取出盖玻片，PBS漂洗1次后将阳性克隆株或空载体克隆株悬液(109CFU/ml)滴至盖玻片上，37℃湿盒内孵育40min，用PBS漂洗6次以去除未粘附细菌，自然干燥，固定，Gram染色，油镜下观察MGC-803与细菌的粘附作用，计算每个细胞周围粘附的细菌数，重复3次，取平均值，每份标本共随机计数30个细胞，结果以均数±标准差表示。
1.11统计学处理采用SPSS7.0软件中的独立样t检验。P＜0.01为差异有显著性意义。
2结果2.1血型抗原黏附素基因的扩增
PCR结果电泳分析发现在2200bp左右有一条带，大小与预计相符，结果见图1。
2.2重组质粒的构建及酶切鉴定将PCR产物经NotI和NocI双酶切后，定向插入经同样双酶切的pET-22b(+)载体中，获得重组质粒命名为pET-22b(+)/血型抗原黏附素。经NotI和NocI双酶切后的重组质粒电泳，结果见图2。
2.3血型抗原黏附素基因片段的序列分析直接以重组质粒pET-22b(+)/血型抗原黏附素为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列，自动测序仪序列分析结果见后(图4)。
2.4血型抗原黏附素基因在大肠杆菌中的表达将血型抗原黏附素阳性克隆株在LB培养液(含100ug/ml氨苄表霉素)中37℃过夜培养，然后按1％mmol/L，诱导表达3h，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液、菌体超声后的上清以及沉淀进行10％SDS-PAGE电泳分析(图3)。结果发现，经诱导后高效表达相对分子量为78kD的蛋白，与预期分子量大小一致，凝胶自动扫描分析，其重组血型抗原黏附素蛋白占菌体总蛋白的34.8％，其中分泌表达占周质总蛋白的22.7％，可溶性表达占上清的15.0％，包涵体占沉淀的86.7％。
2.5动物实验血型抗原黏附素的治疗和保护有效率均为100％。
2.6光镜黏附实验结构与空载体克隆株处理组相比，阳性克隆株处理组细胞周围细菌数明显增多(p<0.01>，其差异具有显著性。光镜黏附实验结果表明血型抗原黏附素具有黏附作用。
参考文献[1]Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manual[M].
New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，198935。
Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.颜子颖，王海林泽。精编分子生物学指南[M]。
北京科学出版社，199839。
权利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它与序列号1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.权利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的长度至少为45个核苷酸。
4.权利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)它编码一种能粘附人细胞的多肽，(b)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(c)细胞被载体所转化。
5.多肽，其特征在于它由权利要求1～4之一的DNA分子所编码。
6.权利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人细胞。
7.产生权利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用权利要求1～3之一的DNA分子或权利要求4的载体转化一种细胞，在多肽得以表达的条件下培养转化的细胞，并从细胞或/和培养物上清液中分离出多肽。
8.权利要求5～6之一的多肽作为免疫原产生抗体的应用和多肽的抗体。
9.药用组合物，其特征在于(a)它包含作为活性物质的权利要求1～3之一的DNA分子、权利要求5～6之一的多肽或者权利要求8或9的抗体，选择性地包含常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体，(b)药用组合物用来诊断幽门螺杆菌感染的应用，(c)药用组合物用于生产防止或治疗幽门螺杆菌感染用的药剂的应用。
全文摘要
重组幽门螺杆菌血型抗原粘附素，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列。本发明具有运用PCR技术克隆幽门螺杆菌血型抗原基因并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，提高抗血清可阻止幽门螺杆菌粘附于胃粘膜上皮细胞的优点。
文档编号G01N33/68GK1654471SQ03109888
公开日2005年8月17日 申请日期2003年4月17日 优先权日2002年4月11日
发明者张振书, 张亚历, 白杨, 王继德, 陈烨, 赖卓胜, 林焕健, 周殿元 申请人:南方医院