专利名称：人红细胞膜抗原包被的微球及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及血型检测材料和长久保持红细胞抗原活性的方法，特别是涉及人红细 胞膜抗原包被的微球及其在人血型的抗体检测中的应用。
背景技术：
对人体细胞膜抗原及其特异性抗体的研究和检测是生物科学、免疫学实验研究和 临床检测的最基本内容之一。人AB0和Rh血型抗原/抗体检测是临床常规检测项目。血 型鉴定是基于抗原-抗体反应导致的细胞凝集反应。使用红细胞表面抗原检测血清中的血 型抗体称之为反定型。在临床输血中，必须保证正、反定型法鉴定结果一致，才能确保输血 的安全性。根据携带于红细胞表面的血型抗原与存在于被试血清中的同源抗体之间的免疫 化学凝集反应，进一步鉴定血型(反定型检测)，是输血前必须完成的一项实验室检查。目 前，大多数的反定型试验，都是以有活力的红细胞表面抗原作为标准抗原。然而，新鲜红细 胞不易保存，并且红细胞表面抗原的抗原性随保存时间延长而逐渐降低。这类试剂不仅需 要低温(约2-8°C )保存，且最长保存期只有3至6个月。长期以来，如何保持红细胞抗原的抗原性是生命科学、免疫科学尚未能很好解决 的难题。为了解决这个难题，人们曾采取低温冷冻技术，但低温冷冻方法难以保存大量红细 胞。而且红细胞的抗原性会随冻存时间延长而削减。另外，红细胞保存困难的问题也限制 了其在其他方面的应用，如作为正定型试剂的质控品，或抗红细胞抗体效价测定等领域。目 前，新鲜的红细胞试剂存在难以批量获得、有效期短、保存条件苛刻、质量不稳定等问题。因 此，有必要对传统血型抗体鉴定方法和红细胞抗原的保存方法做实质的改进。
发明内容
根据携带于红细胞表面的血型抗原与存在于被检血清中的同源抗体之间的免疫 化学凝集反应，进一步鉴定血型(反定型检测)，是输血前必须完成的一项实验室检查。目 前，大多数的反定型试验，都是以有活力的红细胞血型抗原作为标准抗原。然而，新鲜红细 胞不易保存，并且红细胞血型抗原的抗原性随保存时间延长而逐渐降低。这类试剂不仅需 要低温(约2-8°C )保存，且最长保存期只有3至6个月。为了解决这一问题，本发明提供了一种保存人细胞膜血型抗原活性的方法，该方 法包括制备红细胞膜血型抗原提取物，然后将制备的红细胞膜血型抗原包被在固体微球 上。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的固体微球是是人工合成的彩色无磁 性微球，例如包括但不只限于聚苯乙烯_丙烯酸微球、聚苯乙烯_丙烯酰胺、PMMA微球、PVC 微球等有机微球；二氧化硅微球、碳酸钙微球、二氧化钛微球、过渡金属硫化物微球等无机 微球；以及无机/有机复合物微球等。按本发明方法制备的微球可以使人红细胞膜表面血型抗原至少保存一年以上，而 不丧失或降低红细胞的抗原活性。
按照本发明的方法制备的红细胞膜血型抗原包被的微球，可以有效地维持和保留 红细胞的抗原活性，作为试剂可广泛用于人血型抗体的检测。例如，在临床血型分析实践 中，可以作为血型反定型实验的试剂来使用。简单的说，首先将红细胞膜固定包被在微球 上，并以该包被有红细胞膜的微球代替红细胞进行血型抗体的检测。另外，如此制备的包被 有红细胞膜的微球，也可用于其他使用红细胞抗原的实验室和工业生产实践中，如作为正 定型试剂的质控品，或抗红细胞抗体效价测定等领域。所说的红细胞膜血型抗原，可以是用低渗压或者表面活性剂处理得到的、依附在 完整红细胞膜表面上的血型抗原，或者是用有机溶剂处理过的去除杂质的血型抗原提取 物。所说的红细胞膜血型抗原包被，是指用物理吸附或者化学偶联等方式，将红细胞 膜或者血型抗原提取物固定在固体微球上。为了制备红细胞膜抗原，可首先于室温下，在压积的红细胞中加入表面活性剂胀 溶红细胞，或者利用低渗透压方法溶胀红细胞，然后反复离心收集沉淀物，即所需要的红细 胞膜抗原提取物。为了制备可包被红细胞膜血型抗原的微球，例如可以依次向乙醇/水的混合物中 加入过硫酸铵、苯乙烯和丙烯酸，混勻后通入高纯度氮气。然后置于水浴中(60°C)搅拌并 加热(约48小时)，即得到所需的聚苯乙烯-丙烯酸微球。取如上制备的聚苯乙烯-丙烯酸微球，离心去上清。取适量十二烷基磺酸钠(SDS) 加水稀释。再在另一容器内，向无水乙醇中加入染料甲基红，溶解并摇勻后加入到上面配制 的液体中。置于水浴(60°C )中加热后(约24小时)，即得到红色着染的聚苯乙烯_丙烯 酸微球。当然，也可以使用其他染料物质，将如此制备的聚苯乙烯-丙烯酸微球染成其他所 需的颜色。为了制备红细胞膜包被的微球，可取一定量红细胞膜，加入IOmM PBS溶液，振荡混 合均勻后，加入适量的碳酸钾溶液调节PH值至大约9。然后向该红细胞膜的PBS溶液中加 入适量如上制备的微球悬液，振荡并混勻，离心后收集沉淀，即得到所需要的红细胞膜包被 的微球。如此利用细胞膜的亲脂性制备的红细胞膜包被的微球，可使细胞膜与微球牢固的 结合。这样，既保存了红细胞膜表面的血型抗原性，又使红细胞膜血型抗原脱离活细胞存 在，大大延长了红细胞膜血型抗原的保存期限。根据本发明的一个优选实施方案，红细胞抗原物质包被的微球颗粒粒度通常为 10nm-50μ m。我们的初步试验观察结果表明，按照本发明的方法制备的红细胞膜血型抗原包被 的微球，可以使红细胞表面抗原(包括血型抗原)活性保留一年以上，而不发生表面抗原活 性的丧失或衰减。可以在低温或常温条件下，保存按照本发明的方法制备的红细胞膜血型 抗原包被的微球。可以使用包被有红细胞膜抗原的微球，代替保留有表面抗原活性的新鲜红细胞， 用于临床血型反定型检测，或者是血型抗体检测。如此制备的包被有红细胞膜的微球，也可 用于其他使用红细胞抗原的实验室和工业生产实践中。根据本发明的一个优选实施方案，用于包被红细胞抗原的微球可以是聚苯乙烯_丙烯酸、二氧化硅，或其他有机或无机聚合材料制成的微球。根据本发明的一个优选实施方案，所采用的血型鉴定方法可以是玻片法，或其他 常规血型鉴定方法。本发明的红细胞膜抗原保存方法，以及使用如此保存的红细胞膜抗原检测人血型 的反定型检测方法，特别适合于血站血型抗体筛查和街头采血使用。该方法保存的红细胞 膜抗原有效期长，抗原性稳定。另外，该方法简单易行，适合大规模工业化生产。用该方法 制备的红细胞膜抗原用于人血型反定型检测，能够准确的反映出血型抗体种类，达到了代 替新鲜红细胞的目的。再者，按照本发明方法制备的红细胞膜抗原包被的微球，也可满足需要使用新鲜 红细胞膜抗原的其他研究和生产的需求，例如用作血型正定型检测的质控品。
图1显示以本发明制备A型和B型红细胞膜抗原包被的微球代替新鲜红细胞，完 成的人ABO血型反定型检测。从左到右，各纵列依次为A型、B型、AB型、0型血清。如图所 示，A型血清中仅B型微球出现凝集；B型血清中仅A型微球出现凝集；AB型血清两孔均不 出现凝集；0型血清两孔均出现凝集。图2显示以本发明制备的RhD阳性红细胞膜抗原包被的微球代替新鲜红细胞，完 成的人血清中抗-D抗体的检测。左边为加入含抗-D血清的离心管，右边为加入不含抗-D 血清的离心管。如图所示，在含抗-D的血清中，RhD阳性红细胞膜微球出现了肉眼可见的 凝集；在右边不含抗-D的血清中，RhD阳性红细胞膜微球分散均勻，未见凝集。
具体实施例方式以下实施例旨在进一步举例描述本发明，这些实施例并不以任何方式限制本发 明。在不背离本发明技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实 现的任何改动或者改变都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1 :A型、B型和RhD阳性血型红细胞膜抗原提取物的制备取新鲜A/B型静脉血1ml，3000rpm离心5分钟去上清，取压积红细胞进行下一步 处理。在压积红细胞中加入IOml 5%十二烷基磺酸钠(SDS)，室温下放置3分钟后，3000rpm 离心去上清。向沉淀物加入IOml纯水并振荡混勻，再次3000rpm离心去上清。如此反复5 次，所得到的沉淀物即为A/B型血红细胞膜抗原提取物。取新鲜RhD阳性静脉血1ml，3000rpm离心5分钟收集细胞沉淀。在压积红细胞中 加入IOml十二烷基磺酸钠(SDS)。室温下放置3分钟后，3000rpm离心去上清，向所得细胞 沉淀物加入无水乙醇。振荡混勻后，再次3000rpm离心并去上清，向沉淀物加入纯水并振荡 混勻。然后，以3000rpm离心，去上清留沉淀，得到RhD阳性红细胞膜抗原提取物。实施例2 红色着染的聚苯乙烯_丙烯酸微球的制备取70ml无水乙醇加入30ml纯水混勻待用。向所得含水乙醇中依次加入1. Og过 硫酸铵、IOml苯乙烯和5ml丙烯酸。混勻后通入高纯氮气(10分钟)。然后置于60°C水浴 中搅拌，连续加热48小时后结束反应，得到聚苯乙烯-丙烯酸微球。取如上制备的聚苯乙烯-丙烯酸微球，离心去上清。向沉淀中加入IOOml纯水，再
5加入Ig十二烷基磺酸钠(SDS)。取另一小瓶加入IOml无水乙醇，0. Olg甲基红，Iml苯乙 烯，0.03g偶氮异丁腈。溶解并摇勻后加入到如上配制的液体混合物中。置于70°C水浴锅 中加热24小时后结束反应，即得到红色着染的聚苯乙烯_丙烯酸微球。实施例3 =RhD阳性型红细胞膜抗原包被的二氧化硅微球的制备取IOOml无水乙醇加入IOml正硅酸乙酯和IOml氨水，室温搅拌24小时后反应结 束，得到二氧化硅微球。取如此制备的二氧化硅微球20ml，离心去上清，留沉淀。向二氧化硅微球沉淀物中加入实施例1制备的RhD阳性0型红细胞膜抗原，调节 PH值至10，混勻并适度振荡。离心去上清，即得到RhD阳性红细胞膜抗原包被的二氧化硅 微球沉淀物。将IOml 10mg/ml的罗丹明B溶液加入到上述RhD阳性红细胞膜抗原包被的二氧 化硅微球沉淀中。37°C染色2小时，即得到亮红色的RhD阳性型红细胞膜抗原包被的二氧 化硅微球。实施例4 :A/B型红细胞膜抗原包被的聚苯乙烯_丙烯酸微球的制备取实施例2中制备的红色着染的聚苯乙烯_丙烯酸微球1. Og，离心去上清。向微 球沉淀中加入实施例1制备的A/B型红细胞膜抗原，调节pH值至10，混勻并适度振荡。离 心去上清后，即得到A/B型红细胞膜抗原包被的聚苯乙烯_丙烯酸微球。实施例5 使用本发明的红细胞膜抗原包被的聚苯乙烯-丙烯酸微球完成人ABO 血型的反定型检测取8孔的凹式血型鉴定纸，第一排4个孔各加入25 μ 1实施例4中制备的A型红 细胞抗原微球，第二排4个孔各加入25 μ 1实施例4中制备的B型红细胞抗原微球。然后， 取已知的A型、B型、AB型、0型4例血清，分别沿纵向各加50 μ 1到含A型红细胞抗原微球 和B型红细胞抗原微球的上下两个孔中。搅勻后，5分钟内判定结果。结果可见，A型血清 中仅B型微球出现肉眼可见的凝集；B型血清中仅A型微球出现肉眼可见的凝集；AB型血清 两孔均不出现凝集；0型血清两孔均出现凝集(参见图1)。实施例6 使用本发明的RhD阳性红细胞膜抗原包被的聚苯乙烯_丙烯酸微球完 成人抗-D抗体的检测取已知的含抗-D和不含有抗-D的两份新鲜的人血清各200 μ 1于1. 5ml离心管 中，并在每管各加入50 μ 1实施例3制备的RhD阳性红细胞膜抗原包被的聚苯乙烯-丙烯 酸微球悬液。充分混勻震荡后，37°C保温60分钟。取出反应离心管，以4000转离心分离并弃去上清。用生理盐水洗涤沉淀物3次。 每管加入100 μ 1广谱抗球蛋白试剂，充分混合后，以2000rpm离心1分钟。然后观察结果。 结果可见，在含有抗-D的血清中，RhD阳性红细胞膜微球出现了肉眼可见的凝集；在不含 抗-D的血清中，RhD阳性红细胞膜微球分散很均勻，未见有凝集现象(参见图2)。
权利要求
一种保存人细胞膜血型抗原活性的方法，该方法包括制备红细胞膜血型抗原提取物，然后将所制备的红细胞膜血型抗原包被在固体微球上。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的微球是人工合成的无磁性微球。
3.根据权利要求1的方法，所说的红细胞膜血型抗原，可以是用低渗压溶液或者表面 活性剂处理得到的依附在完整红细胞膜表面上的血型抗原，或者是用有机溶剂处理过的去 除杂质的血型抗原提取物。
4.根据权利要求1的方法，其中所说的红细胞膜血型抗原包被，是以物理吸附或者化 学偶联方法将红细胞膜或者血型抗原提取物固定在固体微球上。
5.按照权利要求1的方法保存的红细胞膜血型抗原在人血型抗体的检测中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种保存人细胞膜血型抗原活性的方法，该方法包括制备红细胞膜血型抗原提取物，然后将制备的红细胞膜血型抗原包被在固体微球上，借以代替新鲜红细胞，用于检测样品中的血型抗体。
文档编号G01N33/543GK101957366SQ200910158168
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月15日 优先权日2009年7月15日
发明者曹大与, 江应玲, 汪大明, 肖江群, 钟乾兴 申请人:英科新创(厦门)科技有限公司