专利名称：用于诊断和治疗应用的不同类型的血型抗原的制作方法
技术领域：
本发明 一般涉及用于治疗或预防抗体-调节的移才直排斥的组 合物和方法，更具体地，涉及包括血型决定簇的组合物，所述血 型决定簇能够有效的除去抗血型抗原的抗体。
背景技术：
早在移植的前期就发现穿过ABO血型屏障的肾移植会导致 大范围的不发生作用的移才直，因此，遵守传统的用于l命血的兰斯 坦纳法则一皮认为是异体移4直的先决条件。受赠者预先形成的抗A / B同种凝集素造成针对ABO血型-不相容移植物超急性排斥反_抗体同种免疫病人体内观察到的反应相似。第 一个5争越ABO血 型屏障的移植手术在二十世纪七十年代开始，是将A2血型的尸 体肾脏移植到O型血的受赠者体内、在二十世纪八十年代，使 用Ai和B型血捐献者进行第一组的ABO血型不相容的活体捐赠 者(LD)肾移才直，且存活下来的移才直受赠者与ABO血型相容的 情况相似。这种免疫抑制草案包括前期进4于血浆除去法除去抗A / B抗体、捐赠者血小4反输血、脾切除术和用抗'淋巴细胞/胸胨_ 细胞球蛋白进行的诱导治疗、注射从猪胃中萃取出的A或B血型 的物质和环孢霉素-硝基咪唑錄^嘌呤-强的松。从那以后，在世界 范围内报道了超过500个ABO血型不相容活体捐赠者肾移植手 术，主要是日本报道(参见。，有很多文件证明了移植之前减 少受赠者抗A/B抗体水平从而避免排异性的重要性。"这一组移植手术幸存者情况比较好(大约85%的Al和B型捐赠者的移 植存活期是1年)但是由于单个案例发生严重的抗A/B抗体调 节的排异作用4'5,因此这一'lt况略逊于ABO血型相容的移植术。使用抗CD20抗体(Rituximab )与除去抗体相结合进行ABO 血型不相容的肾移植，在这方面最近的数据显示了更好的移植存 活情况6' 7。在器官严重不足的情况下，增加使用来自ABO血型不相容 的捐赠者中的移植物能够进行更多的活体捐献者肾移植。另外， 在此方面获得的经—验还可以用在人体白细胞抗原-致:敏病人的预 处理和后移一直处理8。发明内容本发明部分地以用于从血浆中除去血型抗原抗体的改进的 纟且合物和方法，以及血型鉴定方法为基础。在本发明的一个方面，本发明纟是供了一种组合物，这种组合 物包含至少两种血型抗原，每种血型抗原在不同核心糖化物链式 上表达。^尤选的纟且合物包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 或更多的血型A/B 4元原。在另一个方面，通过4是供不同子类型的耀J兹i朱确定(例如血 型测定)来自主体的样品中血型抗体的存在，其中每个子类型都 包覆有不同的血型抗原，并将来自主体的样品加入到微磁珠中。 将样品和微磁珠培养足够长的时间使样品中抗血型抗体与血型 抗原在微磁珠上相结合，形成一种抗血型抗体-微磁珠复合物。 培养这种复合物，例如，与至少一种标记物标记过的更具体地说 能够结合所述抗血型抗体的配位体相4妄触培养，所述抗血型抗体能够与血型抗原相结合， 一佥测是否存在这种结合抗血型抗体的标 记过的配位体可以确定所述反应性抗体的存在。这种配位体可以 是，例如， 一种抗体或其片段。这种抗体是一种单^f介抗体片,殳，例如Fab或Fab'片,殳。例如，Fab或Fab'片段可以是一种抗Fc抗 体片4史、 一种抗kappa轻《连抗体片,殳、 一种抗X轻链抗体片萃殳、 和单链抗体片^殳。所述标记物例如一种荧光标记物。通过本领域 移才直的方法，例如流式细l包计或luminex液态芯片(蛋白分析系 统)可以测定标"i己的配<立体。通过提供大量不同子类型的微f兹珠除去样品中的血型反应 性抗体，其中，所述不同子类型的凝J兹珠上包^隻有不同的血型抗 原。将样品和这些微f兹珠相接触并培养足够长的时间，使样品中 的抗血型抗体与血型抗原相结合。樣U兹i朱与样品分离，乂人而/人样 品中除去血型反应性抗体。血型抗原包纟舌A型纟元原、B型纟元原和H型纟元原。核心4唐〗匕物 4连类型包括1型、2型、3型和4型。血型抗原不含有糖化物(在这 里是指ABO血型4氐聚糖或任选的，血型抗原在粘蛋白多肽上表 达。这里的粘蛋白多肽是粘蛋白免疫球融合蛋白质(在这里是指 ABO融合蛋白质或多肽)的一部分。任选的，ABO低聚糖或ABO融合蛋白质与一种固体支持物， 例如樣O兹J朱相连，例如共《介相连或非共i^介相连。例如，孩"兹珠可 以是橡胶的。通过不同的子类型的樣U兹J朱是指凝J兹珠的大小、颜 色不同，或者大小及颜色都不同。微磁珠的直径在大约2微米到 大约15微米的范围内。优选的，所述微磁珠直径大约为5微米。 最优选的，所述微磁珠直径大约为5微米。所述才羊品可以是，例如，全血、血清或血浆。在一些方面，该组合物被配制成吸收剂用于从全血或血浆中 除去血型抗体。本发明还提供了许多不同子类型的微磁珠，其中 每个子类型上都包覆有不同的血型抗原。例如，所述樣W兹^朱包含至少2、3、 4、 5、 6、 7、8、9 、 10、20、25、30、 40、50或更多种不同子类型的微磁珠。除非另有定义，这里使用的所有技术与科学术语与本发明所 属领域普通4支术人员通常所理解的含义相同。尽管与这里描述的适当的方法和材料在下面进行了描述。在这里提到的所有出版 物、专利申请、专利及其他参考文献通过引i正在此全部并入本文。 如果有矛盾的话，以本申请的说明书，包括定义的解释为准。另 外，这里的材料、方法和实施例只起到实例性作用，并不起到限 制的目的。通过下面的详细介绍和所付权利要求书，本发明其他的特点 和优势会变得显而易见。
图1是一种用于生产传送血型抗原的载体的示意图。图2是一种显示PSGL - 1 / mlgG 2b细胞定位的照片，所述 PSGL - 1 / mlgG 2b细胞定位通过间接免疫荧光法测定。使用 FITC -结合的山羊抗老鼠免疫免疫球蛋白G Fc抗体(Sigma^^司购 得)在封闭緩冲液中按1:200稀释后的溶液测定PSGL - 1 / mlgG2b 蛋白质。使用4, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色。图3是蛋白质印记试验的照片，显示了各种外核链传送的血 型A决定I美。页图4是在不同聚糖前体上产生ABO融合肽的ABH转染方案的 示意图。图5是图表，显示了5种不同大小、不同颜色强度的磁i朱所产 生的流式细胞计计数，该图表清楚的显示了可以使用许多大小-颜色结合的磁珠。使用上述大小和颜色的结合，可以制成最多25 中不同的磁珠，每个都代表一种独特的血型抗原。图6是一种血型抗原外核结构的示意图。图7是血型ABH抗原的示意图。图8是识别血清中抗血型抗体的流式细胞计结果的图解表示。图9是一系列散布图，显示了在来源于A型、B型和O型个 体血清中免疫免疫3求蛋白G和免疫免疫^求蛋白M血型A抗体。
具体实施方式
本发明部分地以 一种发现为基础，该发现是血型抗原决定蔟 可以在高密度条件下通过不同的核心4唐化物链(例如1型、2型、 3型或4型核心糖化物链)上专一的表达，所述核心糖化物链或者 是游离糖化物或者在粘蛋白型蛋白质骨架上的糖化物。已经发 现，在移植之前，使用不同的核心糖化物链携带的血型抗原相结 合，能够更有效的乂人血液中除去抗血型抗体。另外，本发明的组 合物在诊断和预兆疾病方面是有效的，可以测定主体体内血型反 应性抗体的存在。在一个方面，本发明^是供了一种包含至少两种不同的血型拍二 原(即，低聚糖)的组合物，其中，每种血型抗原在不同的核心糖化物链(即，聚糖前体)上表达。这些低聚糖在这里被称为"ABO 血型低聚糖"。所述血型抗原是游离糖化物。估文为选才奪，所述血 型抗原在粘蛋白多肽上表达。例如，所述血型抗原在粘蛋白免疫 球蛋白融合蛋白质(在这里被称作"ABO血型融合蛋白质")中 表达。所述ABO血型融合蛋白质携带对血型决定簇具有专一性 的抗原决定簇。例如，ABO血型融合蛋白质携带A型抗原决定 蔟、B型抗原决定簇或H型抗原决定簇。做为选择，ABO血型 融合蛋白质携带用于血型抗原的两种抗原决定蔟。例如，ABO 血型融合蛋白质携带A型和B型抗原决定簇。在一些方面，ABO 血型融合蛋白质携带所有的三种抗原决定簇(即，A型抗原决定 蔟、B型抗原决定簇和H型抗原决定簇)。本发明的ABO血型 融合蛋白质在不同的聚糖前体上表达A型抗原决定簇、B型抗原 决定簇或H型抗原决定簇，所述不同的聚糖前体例如1型前体《连、 2型前体链或者3型前体链。任选的，ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质与 一种固 体支持物相连，乂人而使血型抗原从血液中分离出来。因此，在例如，ABO血型不相容的器官移植、骨髓移植之前 或者为了产生万能供血者血浆时，ABO血型低聚糖和ABO血型融 合蛋白质在乂人受赠者血液或者血浆中除去抗血型ABO抗体方面 是有效的。ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质从受赠者血 液或者血浆中吸收50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 98%或 者100%的抗t血液基团ABO抗体。与在单一核心糖化物4连上表达的血型低聚糖相比，ABO血型 j氐聚糖在石友水化合物摩尔分子量基础上在除去或结合抗血型抗 体方面是更有效的。与"等量的在单一核心^唐化物链上表达的游 离并唐化物"相比，ABO血型i氐聚津唐结合2、 4、 10、 20、 50、 80、 100或更多倍的大量4元血型4元体。相似地，与野生型AB决定簇的游离^t化物相比，ABO血型 融合肽在石灰水化合物摩尔分子量基础上在除去或者结合抗血型 抗体方面更为有效。与相等数量的野生型AB决定簇的游离糖化 物相比，ABO血型融合肽结合2、 4、 10、 20、 50、 80、 IOO或更 多倍的大量抗血型抗体。ABO血型低聚糖和ABO血型融合蛋白质还可以有效的用于 血型测定的方法中。本发明的方法与现有的血型测定方法相比更 优越的地方在于本发明方法能够定量评〗介不同的种类和亚种类 的血型抗体。特别是，本发明方法还考虑到链式特异性抗体的枱r 测。这具有临床相关性，因为免疫系统可以特异性的应答在不同 核心链上的血型抗原。此夕卜，血型抗原不同的核心链上以一种细 胞和组织特异性方式一皮表达。因此，通过4企测链特异性抗体可以交叉配血，从而减少过急性排异作用。ABH组织血型抗原在ABH抗原在几乎所有的人体细月包中都有发现，〗旦是如果 他们起到 一些作用的话，他们的生理作用还存在一些未确定的问 题。他们具有碳水化合物的性质，且通过不同的糖基转移酶建成， 所述糖基转移酶即以连续的方式在生长的低聚糖链的非还原末 端加入单糖单元的酶。低聚糖可以通过蛋白质或者脂类携带，或 者可以在体液(例如人类乳汁)中游离存在9。才艮据线性核心糖基链，ABH抗原可以净皮分为不同的亚基团。 作为一种实施例，A、 B和H抗原在1型链(Gaipi, 3GIcNAc )、 2型链(Gal卩l,4GlcNAc)、 3型链(Gal卩l, 3GalN Aca )和4型《连(GaipL 3GalNAcP)上表达。4型《连ABH抗原只被发现结合脂类。通过 在加入海藻糖可以制备H型抗原，所述海藻糖通过a1,2连接体与不同的包含末端半乳糖的核心链相连。A型抗原和B型抗原都是 从H型子类型中通过加入N-乙酰半乳糖胺(A型)或半乳糖(B 型)产生的，所述N-乙酰半乳糖胺或半乳净唐与末端半乳并唐以al,3 连4妄体形式相连。负责A型和B型抗原生物合成的糖基转移酶 需要al,2-海藻糖的存在，从而分别加入末端N-乙酰半乳糖胺和 半乳糖。两种在结构上有差别的al，2 -海藻糖基转移酶能够使H型抗 原的生物合成按照Oriol.1Q所述的方法开始进4亍。其中 一个通过H 位点(FUT -I)编码，另 一个通过分泌器官(Se )位点(FUT -II) 编码。FUT -I基因产物导致红血细胞H型抗原表达并在2型链上 起到突出的作用，同时也显示了相对1型链的活性。相反，FUT -II基因产物通过唾液腙A袈泡细i包以及排列在胃肠道、繁殖系统和 肺部区域的分泌薄壁细胞表达，主要作用与1型链，可能也作用 于3禾口 4型链。负责A型抗原和B型抗原表达的基因产物已经表明具有公共 的来源。与B型编石马的基因产物相比，导致A型四个氨基酸残 基替换的突变作用造成捐赠者糖核苷酸的变化，优选的该变化是 从二磷酸尿嘧咬-N-乙酰半乳糖胺转变为二磷酸尿嘧啶-半乳糖。 由于原始A型等位基因中框架位移的突变作用，血清学命名的O 表现型缺少的东西这两个基因产物的表达，由此也不表达A型或 B型决定簇。11 A型血型已经根据血清学被分成不同的群，最 常见的子群是Al和A2。 12通过两种不同的a1，3 -N-乙酰氨基半 乳糖转移酶生产这些A型子类型， 一种优选H型3和4抗原 (Al ),另 一种4尤选H型1和2 ( A2 ) 4元原。多化合价的重要性蛋白质-碳水化合物的相互作用通常以低的结合亲合力为特征。尽管这看起来是不合理的，但是这为快速开/关速率提供了基 础，而快速开/关速度在生理情况下是必须的，从而能够允许快速、 高度可变的、在细月包受体、抗体及其他石灰水化合物结合蛋白和4也 们的糖基化的配体之间产生的相互作用。必要时，通过利用多化 合<介自然可以实现4交高的亲合力。在一个生物体上的几个受体与 在另 一个生物体上的几个石友水化合物配位体的结合可以一使亲和力增加io- 10 000倍。多^介相互作用的实施例包括孩i生物(病毒、细菌或者细菌毒素)与细胞表面的结合、细胞-细胞结合和多价 分子，例如抗体与细胞表面的结合。13多价抑制剂与单价抑制剂 相互作用的抑制通常是无效的，及时所述抑制剂的结合活性已经在结构上^皮最优化。因此；许多不同的分子(例如聚丙烯酰胺、 肽、牛血清白蛋白、树枝状聚合物和环糊精)已经被用作主要成 分，用于试图使相应受体产生多价结合作用的单糖和低聚糖的多 目标显示。13—种选择性的方法包括配位体与脂质体、薄膜或者 其他表面头部基团非共价的结合。13这种糖连接物的成果是变化 的， <旦亲合力与单<介相互作用相比，通常能够增加10到1000 4咅。 在一些情况下，通过最优化配位体外观(即配位体结构、化合价 程度、主链结构和内部/内配位体距离)，也就是说，通过尽可能 详细的模仿碳水化合物呈递的天然线路，已经实现了纳摩活性最 常见的特征生理蛋白质-石友水化合物相互作用。带有适当聚糖-取代作用的重组细胞粘蛋白作为抗碳水化合 净勿#元体有岁文的吸jj丈体。粘蛋白型蛋白质通常发现在粘膜表面，它的特点在于其具有 大量的O-聚糖耳又代作用(每两到三个氨基酸)。超过50%的分 子量是由于所述碳水化合物取代作用。通过将各式各样的糖基转 移酶互补DNA与所述粘蛋白-免疫球蛋白的共同表达，可以测定 其O聚糖的结构，从而携带几个生物学上重要的碳水化合物决定簇的拷贝。这样，可以制得粘蛋白传送的血型A型决定簇，这种 血型A型决定簇表现出高效率的抗血型A型吸收体结合活性。1 事实上，抗血型A型抗体以粘蛋白为基础的吸收体与血型A型 三并唐通过间隔物直才妄与琼脂4唐^兹J朱(Glucosorb )相连所4寻的吸 收体相比其结合抗A型抗体效力提高了大约100倍(通过计算血 型A型决定簇的tt目)。这可以通过一种现象来解释，即A型 决定簇的几个拷贝在粘蛋白型载体蛋白1上以Ab -结合最佳的间 隔被表达。同样；重组细胞粘蛋白传送的石灰水化合物抗原决定簇， Galal，3Gal ( a-Gal)已经被证明是一种非常有效的抗Gal抗体的 吸收体，也是组织猪-向人异种移植的主要障碍15"7。因此，粘蛋 白是非常有效的支架用于具有生理活性的石友水化合物的最佳显 示。血型抗原子类型的重要性如上所述，血型ABH决定簇可以^皮不同的核心糖化物链携 带。他们在人体中具有细胞-特异性和组织-特异性的分布状态， 且个体ABH抗原作为把向分子用于抗血型ABH抗体的重要性是 未知的。相似地，所述抗血型ABH抗体的全部4支能是否是异质ABH抗原子类型以及是否实际上比末端三糖需要更多的链用于 结合是未知的。 一些数据表明，只使用A或B三糖来吸附所有 对血型A或B抗原分别具有特异性的抗体是足够的，表明这对才企 测抗体也是正确的19—2Q。然而，本发明的数据显示使用ABH血 型抗原不同的子类型(即不同的核心糖化物链携带的子类型)来 获得更有效的抗体吸附和检测是可能的。具有合适的核心糖化物链的^氐聚糖可以作为有效的抗石友水 化合物抗体吸收体。从以上的讨论得出，粘蛋白型融合蛋白质或者低聚糖在不同的核心糖化物链上传送的ABH决定蔟(乂人而获得结构多相性) 的混合物能够吸附更宽范围的抗A型/ B型抗体。4吏用不同的糖 基转移酶基因的结合，可以设计粘蛋白-免疫球蛋白融合蛋白质 用-见定的内部和外部核心寿唐化物链来传送几个拷贝的O -连j妄的 聚糖。这可以;故ABH决定簇进一步地^立长。因此，重组细月包才支 术可一皮用来产生结构多变的血型A或B粘蛋白，这种粘蛋白可用 于p及附更大范围的4元A型或者B型4元体。血型抗原低聚糖在多种方面，本发明提供了血型抗原低聚糖。血型抗原包括 A型、B型以及O(H)型。所述血型抗原对所有的血型子类型都具 有特异性。血型抗原子类型是指所述血型抗原在不同的核心糖化 物《连型上表达。核心糖化物链类型包括l型、2型、3型以及4型聚 糖前体。示范性的血型抗原低聚糖包括如下所示 1-4型的血型A 4元原1型GalNAcal，3(F腦l，2)Gal!31，2GlcNAcpl國R 2型GalNAcal,3(Fucal,2)G孝，4GlcNAc(31-R 3型GalNAcal，3(F涯l，2)G,，3GalNAc込l國R 4型GalNAcal,3(Fucal，2)Gaipi,3GalNAc￡l-R 1-4型的血型B纟元原Bl型Galcd,3(Fucod,2)Gaipi，2GlcNAcpi画R B 2型Galal,3(Fucal,2)Gal|31,4GlcNAcpl-R B 3型 Galal,3(F謹l，2)Gaipi,3GalNAc込l-RB 4型 Galal,3(Fucal,2)Gal(31,3GalNAc￡l-R其中当血型抗原被携带在融合蛋白质上时，R代表粘蛋白； 当低聚糖与固体支持物相连时，R代表连结点，或者当低聚糖是 游离糖化物时，R什么也不代表。融合多肽在各种方面，本发明提供了包括第一多肽的融合蛋白质，所 述第一多肽包含至少一部分糖蛋白，例如，可4乘作的与第二多肽 连接的粘蛋白多肽。如在这里使用的，"融合蛋白质"或者"嵌合蛋 白质"包括至少 一部分粘蛋白多肽，该可#:作的与非粘蛋白多肽 连4妾。"粘蛋白多肽"涉及一种具有粘蛋白区域结构的多肽。所述 粘蛋白多肽具有一个、两个、三个、五个、十个、二十或更多的 粘蛋白区域结构。所述粘蛋白多肽可以是任意一种糖蛋白，其特 征在于其氨基酸序列被O-聚糖所取代。例如，粘蛋白多肽每两个 或三个氨基酸是丝氨酸或者苏氨酸。粘蛋白多肽是一种分泌蛋白 质。做为选择，粘蛋白多肽是细胞表面蛋白。粘蛋白区域结构富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸，其中，低聚 糖通过N-乙酰半乳糖胺与羟基氨基酸相连(O-聚糖)。粘蛋白 区域结构包括O -连接的糖基化作用位点，或者作为选择，粘蛋 白区域结构由O -连接的糖基化作用位点组成。粘蛋白区域结构 具有1、 2、 3、 5、 10、 20、 50、 100或更多的O -连4妄的#唐基^匕作用位点。做为选择，粘蛋白区域结构包括N连接的糖基化作用 位点，或者做为选择粘蛋白区域结构由N -连接的糖基化作用位 点纟且成。粘蛋白多肽重量的50%、 60%、 80%、 90%、 95%或者 100%是由聚糖产生的。粘蛋白多肽可以是任何一种MUC基因 (例如，MUC1、 MUC2、 MUC3等等)编码的多肽。估支为选择， 粘蛋白多肽是P -选凝素糖蛋白配位体l( PSGL - I )、CD34、CD43、 CD45、 CD96、 GlyCAM画1 、 MAdCAM或者红血3求血型净唐蛋白。 优选的，所述粘蛋白是P -选凝素糖蛋白配位体1。然而"非粘蛋 白多肽"涉及一种多肽，该多肽中少于40%的质量是由于聚糖引 起的。在本发明ABO血型融合蛋白质内部，粘蛋白多肽可以相当于 所有的粘蛋白蛋白质或者粘蛋白蛋白质的一部分。在一个实施方 案中，ABO血型融合蛋白质包括至少一部分粘蛋白蛋白质。"至 少 一 部分"是指粘蛋白多肽包含至少 一 个粘蛋白区域结构(例如，O-连接的糖基化作用位点)。在一个实施方案中，粘蛋白蛋白质 包括所述多肽的细胞外部分。例如，所述粘蛋白多肽包括PSGL-I的细l包外部分。第一多肽通过一个或一个以上血型转移酶糖基化。第一多肽 通过2个、3个、5个或更多的血型转移酶^f唐基化。糖基化作用 是连续的或者联贯的。做为选择，糖基化作用是同时发生的或者 随才几发生的，例如，以不特定的方式进4于。例如第一多肽通过otl，2 海藻糖基转移酶糖基化，所述a1，2海藻^f唐基转移酶例如H-或者 Se-基因编码的a1,2海藻糖基转移酶。实例性的a1,2海藻糖基转 移酶是FUT1(基因库编号Q10984; 010983; 010981; AT455028 和NM00148 )和FUT2 (基因库编号P19526; BAA11638; D82933和A56098 )。估文为选才奪，第 一多肽通过1，3N-乙酰半乳 糖胺基转移酶或者al，3氨基半乳糖基转移酶被糖基化。在一些方面，第一多肽通过otl,2海藻糖基转移酶和1,3N-乙酰半乳冲唐胺基 转移酶或者al，3氨基半乳糖基转移酶被糖基化。在所述融合蛋白中，术语"可操作的连接"是用来说明，第一 和第二多肽是化学连接的(最具代表性的，通过一种共价4建，例 如肽键连接)，其连接方式允许第一多肽的O -连接的糖基化作用。 当应用涉及核酸编码的融合多肽时，术语"可操作的连接"是指编 码核酸编码的粘蛋白多肽和非粘蛋白多肽在冲匡架结构中4皮此融 合。所述非粘蛋白多肽可以在粘蛋白多肽的N -末端或者C -末端 融合。在进一步的实施方案中，所述ABO血型融合蛋白质可以与 一个或一个以上其他的基团相连，例如，ABO血型融合蛋白质 可能另外与GST融合蛋白质相连，其中，ABO血型融合蛋白质 与GST(例如，谷胱甘肽S-转移酶)序列的C-末端融合。这种 融合蛋白质可以促进ABO血型融合蛋白质的纯化。啦文为选择， ABO血型融合蛋白质可以另外与一种固体支持物相连。本领域 普通技术人员已知多种不同的固体支持物。这种组合物可以促进 抗血型抗体的除去。例如，ABO血型融合蛋白质与一种颗粒相 连，所述颗粒由例如金属化合物、硅、橡胶、聚合材料、微量滴 定板、硝化纤维或者聚酰胺纤维或者其结合组成。与固体支持物 相连的ABO血型融合蛋白质可以4皮用作一种吸收体，,人生物才羊 品中除去抗血型抗体，所述生物样品例如血液或者血浆。在另一个实施方案中，所述融合蛋白质在它的N -末端包括 一种异源信号顺序(即， 一种在粘蛋白核酸编码的多肽中不应该 存在的多肽序列)。例如，天然粘蛋白信号序列可以;陂删除或寻皮 来自另外一种蛋白质的信号序列所取代。在某些寄主细胞(例如， 哺乳动物寄主细^J中，可以通过4吏用异源信号序列增加多肽的 表达和/或分泌。本发明的嵌合蛋白质或者融合蛋白质可以通过标准重组DNA技术生产。例如，使用传统方法，例如，使用粗糙末端或者 交4晉末端捆绑、限制酶消化提供适当的末端、适合的粘性末端;真 充、；咸性-粦酸酶处理避免不需要的连4妻、和酶催化捆绑等方法， 被编码用于不同多肽序列的DNA片段在框架中捆绑在一起。在另 一个实施方案中，所述融合基因可以通过传统方法合成，所述传 统方法包括自动化的DNA合成。做为选择，可以使用固定引物进 行基因片段的P CR扩增，所述引物能够在两个连续的基因片段之 间产生互补的凸起，随后，这两个连续的基因片賴j皮退火并再扩 增产生一种嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel等人的文献(编 辑)，分子生物学方面的if见有方案，John Wiley & Sons, 1992)。 此外，许多编码融合基团(例如，免疫球蛋白重链Fc区域)的表 达载体是可以商业购得的。糖蛋白Iba编码的核酸可以;故克隆进 入这种表达载体中，从而使该融合基团在框架内与免疫球蛋白蛋 白质连接。ABO血型融合多肽可以作为4氐聚物存在，例如，作为二聚物、 三聚物或者五聚物存在。优选的，所述ABO血型融合多肽^皮一 种二聚物。可以^吏用本4页:威内已知的粘蛋白编码序列构建第一多肽和/ 或核酸编码的第一多肽。粘蛋白多肽和核酸编码的粘蛋白多肽的 适当的来源包括基因银行登记号分另'J为NP663625和 NM145650， CAD10625和AJ417815, XP140694和XM140694, XP006867和XM006867和NP00331777和NM009151,他们在这里 通过引"i正全部并入本文。在一些实施方案中，粘蛋白多肽基团作为一种粘蛋白多肽变 体被提供，所述粘蛋白多肽变体在天然存在的粘蛋白序列(野生 型)中具有一种突变，导致碳水化合物含量的增加(相对于未突变的序列)。例如，与野生型粘蛋白相比，所述粘蛋白多肽变体包括另外的o-连接的糖基化作用位点。做为选才奪，粘蛋白多肽变体与野生型粘蛋白多肽相比，包括能够导致丝氨酸、苏氨酸或 者脯氨酸残基数量增加的氨基酸顺序突变。这些增加的碳水化合 物含量可以-使用本4页域普通^支术人员已知的方法通过测定蛋白 质比粘蛋白的碳水化合物比率来估价。在一些实施方案中，粘蛋白多肽基团作为一种粘蛋白多肽变 体被提供，所述粘蛋白多肽变体在天然存在的粘蛋白序列(野生 型)中具有一种突变，这种突变会使粘蛋白序列对蛋白水解作用 具有更强的抵抗力(相对于未突变序列)。在一些实施方案中，第一多肽包括全长的PSGL - I。啦夂为选 择，第一多肽包括小于全长的PSGL-I多肽，例如PSGL-I的纟田胞 外部分。例如第一多肽的长度小于400个氨基酸，例如，长度小 于或等于300个氨基酸、250个氨基酸、150个氨基酸、IOO个氨基 酸、50个氨基酸或者25个氨基酸。示范性的PSGL - I多肽和核酸 序歹'J包4舌基因4艮4亍登i己号XP006867; XM006867; XP140694和 XM140694的序列。第二多肽优选是可溶的。在一些实施方案中，第二多肽包括 能够促进ABO血型融合多肽与第二粘蛋白多肽结合的序列。在 优选的实施方案中，第二多肽包4舌至少一种免疫王求蛋白多肽区 域。"至少一种区域"是指包括免疫球蛋白分子的任何部分，例如 轻链区域、重链区域、FC区域、Fab区域、Fv区域或者其任一 片段。免疫球蛋白融合多肽在本领域内是已知的，在例如美国专 矛J第5,516,964号；第5,225,538号；第5,428,130号；第5,514,582 号和第5,455,165号中有所描述。在一些实施方案中，第二多肽包括全长免疫球蛋白多肽。做为选择，第二多肽包括小于全长的免疫球蛋白多肽，例如重链、轻链、Fab、 Fab2、 Fv、或者Fc区i或。优选的，第二多肽包4舌一 种免疫球蛋白多肽的重链。更优选的第二多肽包括一种免疫球蛋 白多肽的Fc区域。在本发明的另一个方面，第二多肽与野生型免疫球蛋白重4连 Fc区域的效应子作用相比具有l交少的效应子作用。Fc效应子作 用包括例如，Fc受体结合作用、补体固定作用和T细胞消耗活 性，(参见美国专利第6,136,310号的实施例)。测定T细J包消 耗活性、Fc效应子作用、和抗体稳定性的方法在本领域内是已知 的。在一个实施方案中，第二多肽对Fc受体具有较低的亲合力 或完全没有亲合力。在一种选择性的实施方案中，第二多肽对互 补蛋白质CIq具有4交低的亲合力或完全没有亲合力。本发明的另一个方面与载体有关，优选的与表达载体有关， 所述载体包含核酸编码的粘蛋白多肽、或者其衍生物、片段、类 似物或者同源物质。在许多方面，所述载体包含核酸编码的粘蛋 白多肽，该粘蛋白多肽可才喿作的与一种核酸编码的免疫^求蛋白多 肽或者其4汙生物、片,殳类似物或者同源物质连4妄。另外，该载体 包括一种核酸编码的血型转移酶，例如a1,2海藻糖基转移酶、a1，3 N-乙酰半乳糖氨基转移酶、a1，3半乳糖基转移酶或者其任意结 合。所述血型转移酶能够促进血型决定簇在ABO血型融合蛋白 质粘蛋白部分肽骨架上的加入。如这里使用的术语"载体"是指能 够运输它所连接的其他核酸的核酸分子。载体的 一个类型是"质 斗立"，质并立是指一种环;|大又又链脱氧4亥净唐4亥酉吏环，其中可以捆绑另 外的DNA片段。载体的另一种类型是病毒载体，其中，额外的 DNA部分可以被捆绑进入病毒基因组中。载体能够在他们被引 入的寄主细胞中自动复制(例如，来源于细菌的细菌载体的复制 和附加型哺乳动物载体)。其他的载体(例如，非附加型哺乳动物载体)通过引入寄主细胞被整合入宿主细胞基因组中，并因此 随着宿主基因组的复制而复制。此外，某些载体能够指导与他们 可操作的连接着的基因表达。这种载体在这里被称为"表达载体"。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体经常以质粒形式存 在。在本说明书中，"质粒"和"载体"能可交换地被使用，因为质 粒通常以载体的形式一皮-使用。然而，也可用来包4舌其他形式的表 达载体，例如起到相同作用的病毒载体(例如，有复制缺陷的反 向病毒、！^病毒和l^病毒4目关病毒)。本发明的重组细胞表达载体包括本发明的核酸，本发明的核 酸以一种适合于核酸在宿主细胞中表达的形式存在，这意味着所 述重组细J包表达载体包括一个或一个以上调节序列，这些调节序 列根据用来表达的宿主细胞选择，可操作的与一皮表达的核酸序列 连接。在重组细胞表达载体内部，"可操作的连接"是指所关心的 核苷酸序列与所述调节序列以允许核普酸序列表达的方式连接 (例如，当载体被引入所述宿主细胞时，在一种体外转录/翻译系 统中或在宿主细月包中)。术语"调节序列"是指包括促进剂、增强剂及其他表达控制元 素(例如，聚A泉甘酸化信号)。这种调节序列纟皮描述在例如Goeddel 等人的文献GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表达4支术酶学方法)185, Academic Press (学术出版社)，SanDiego (圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚) (1990)中。调节序列包括能够指导核苷酸序列在许多类型的寄主 细胞中表达的序列和能够指导核苦酸序列只在确定的宿主细胞 中表达的序列(例如，组织-特异性调节序列)。本领域技术人 员可以理解表达载体的设计可以依赖与 一些因素，例如被转化的 寄主细胞的选择，期望的蛋白质的表达水平，等等。本发明的表 达载体被引入宿主细胞,人而生产蛋白质或者肽，所述蛋白质或者肽包括这里所述的通过核酸编码的融合蛋白质或者肽(例如，ABO血型融合多肽、由ABO血型融合多肽形成的突变体，等等)。本发明的重组细胞表达载体可以4皮设计用于ABO血型融合 多肽在原核生物细月包或者真核生物细月包中表达。例如，ABO血 型融合多肽可以在细菌细胞，例如大肠杆菌中表达，可以在昆虫 细胞H吏用杆状病毒表达载体)酵母细月包或者哺乳动物细月包中表 达。适当的宿主细胞进一步的描述在Goeddel等人的文献GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY (基因表达^支术酶学方法)185, Academic Press(学术出版j土 )， San Diego (圣地亚哥)，Calif.(加利福尼亚)(1990)中。做为 选择，重组细胞表达载体可以被体外转录和翻;奪，例如4吏用T7 促进剂调节序列和T7聚合酶进行体外转录和翻译。进行，所述载体包含固有促进剂或诱导促进剂，指导融合蛋白质 或非融合蛋白质的表达。融合载体向其编码的蛋白质中，通常向 重组细胞蛋白质的氨基末端加入很多氨基酸。这种融合载体一4殳 起到三个目的(i)增加重组蛋白质的表达；(ii)增加重组蛋 白质的溶解度；和(iii)通过在亲合纯化中起到配位体的作用帮 助重组蛋白质纯化。通常在融合表达载体中，在融合基团和重组 蛋白质接合点引入一种蛋白水解分裂位点，从而使重组蛋白质在 融合蛋白质纯化之后从融合基团上分裂。这种酶和他们的同源的 识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体 包4舌pGEX ( Pharmacia生物4支术7〉司；Smith和Johnson, 1988. 基因67 : 31 - 40)、 pMAL(新英才各兰生物实-验室，Beverly, Mass) 和pRIT5 ( Pharmacia, Piscataway， NJ )这些载体分别4夸谷月光甘 肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或者蛋白质A融合 到耙向重组蛋白质中。适当的i秀导的未融合大肠杆菌表达载体的实施例包4舌pTrc (Amrann等人，(1988 )基因69:301 - 315 )和pET Hd ( Studier 等人，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表达才支术酶学方法)185, Academic Press (学术出X反牙土 ) ， San Diego (圣J也亚哥)，Calif.(力口矛H畐尼亚) (1990) 60 - 89 )。在大肠杆菌中最大化重组蛋白质表达的一个策略是将蛋白 质在具有减少容量的细菌宿主中表达，乂人而蛋白水解所述重组蛋 白质。参见，例如Gottesman等人的文献GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY(基因表达才支术 酶学方法)185, Academic Press (学术出版3土 ) ， San Diego (圣 i也亚哥)，Calif.(力口禾'H畐尼亚)(1990) 119 - 128。另一个策略 是改变4皮插入表达载体中的核酸序列以至于不同氨基酸各自的 密码子分别优选的在大肠4干菌中祐 使用(参见，例如，Wada, et al.， 1992. Nucl. Acids Res. 20 : 2111 - 2118)。可以通过标准DNA合成 4支术进4亍本发明核酸序列的改变。在另一个实施方案中，ABO血型融合多肽表达载体是一种酵 母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的实施例包括 pYepSecl ( Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6 : 229 - 234 ) 、 pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30 : 933 - 943)、 pJRY88 (Schultz et al" 1987. Gene 54 : 113画123)、 pYES2 (Invitrogen公 司，圣i也亚哥，力口利福尼亚)和picZ (InVitrogen7^司，圣;也亚哥， 力口矛H畐7^亚)。做为选择，ABO血型融合多肽可以使用杆状病毒表达载体在 昆虫细胞中表达。能够在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中 有效的表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol 3 : 2156國2165)和pVL系列(Lucklow禾口Summers, 1989. Virology 170 : 31 - 39)。在依旧另一个实施方案中，本发明的核酸j吏用哺乳动物表达 载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实施例包括 pCDM8 (参见，1987. Nature 329 : 840)和pMT2PC ( Kaufman, etal, 1987. EMBOJ. 6: 187 - 195)。当被用于哺乳动物细胞时，经 常通过病毒调节因素提供表达载体的控制功能。例如，通常使用 的促进剂纟汙生自多形瘤、l泉病毒2、巨细月包病毒和猿f吳病毒40。见，例如，Sambrook等人编辑的《分子克隆 一种实-验手册》 第二版的第16、 17章，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory出片反牙土出片反，Cold Spring Harbor, N.Y., 19。本发明的另一个方面与宿主细月包有关，在此宿主细月包中已经 引入本发明的一种重组表达载体。术语"宿主细胞"和"重组宿主细 胞"在这里是可交换j吏用的。应当理解，这种术语不只涉及特定 的主体细胞而且涉及这种细胞的后代或者潜在的后代。由于突变 作用或环境影响，在随后的繁殖过程中可能发生某些修饰，因此， 事实上，这些后代可能与母代细胞不相同，但是尽管如此，这些 后代也^皮包括在这里所^吏用的术语所包括的范围内。宿主细胞可以是任何一种原核细胞或者真核细胞。例如糖蛋 白Iba融合多肽可以在例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵 母细胞或者哺乳动物细胞(例如人、中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 或者COS细胞)中表达。其他适当的宿主细胞是本领域内已知的。载体DNA可以通过常规转化或者转染技术被引入原核细胞 或真核细胞中。如这里使用的，术语"转化"和"转染"是指用于将 夕卜源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞的各种本领域已知的技术， 包括磷酸4丐或者氯化4丐共同沉淀、二乙基氨基乙醇-右族:糖酐-调节的转染、脂质转染法、或者电穿孔。用于转化或者转染宿主细月包的适当的方法可以发J见在 Sambrook等人的文献 (MOLECULAR CLONING (分子克隆)ALABORATORY MANUAL.(实验手册)第二版，Cold Spring Cold Spring Harbor 实验室Cold Spring Harbor实验室出版社，Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)及其他实验手册中。众所周知，为了稳定的转染哺乳动物细胞，根据使用的不同 的表达载体和转染技术，只有一'■!、部分的细胞可以整合外源DNA 进入他们的基因组。为了识别和选择这些成分，通常在引入所关 心的基因的同时，向宿主细胞中引入 一 种能够编辑可选择的标记 物(例如，对抗生素的4氐抗性)的基因。各种可选4奪的标i己物包 括能够j陚予药物抗药性的标记物，例如G418、匀潮霉素和氨曱 蝶呤。编码可选择的标记物的核酸可以被引入宿主细胞，在此过 程中使用的载体可以与编码糖蛋白Iba融合多肽的核酸时l吏用的 载体是相同的载体，或者可以被引入单独的载体中。通过药物筛 选可以识别出能够稳定的转染带有引入核酸的细胞(例如，已经 整合入可选择的标志基因的细胞将会继续存在，而其他的细胞会 死亡)。一种本发明的宿主细胞，例如在培养基中的原核宿主细胞或 者真核宿主细胞可以被用于产生(即，表达表达)ABO血型融 合多肽。因此，本发明进一步才是供了^吏用本发明宿主细胞生产 ABO血型融合多肽的方法。在一个实施方案中，该方法包4舌在 适当的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经引入能够编码 ABO血型融合多肽的重组表达载体)，/人而生产ABO血型融合 多肽。在另一个实施方案中，该方法进一步包括乂人所述培养基或 者宿主细月包中分离ABO血型多肽。所述ABO血型融合多肽可以4艮据常头见技术进行分离和纯化，例如，提耳又、沉淀、色i普法、亲和色i普法、电泳等等。例如，通过将溶液穿过包含固定化蛋白质A或者蛋白质G的色谱柱，固 定化蛋白质A或者蛋白质G有选择地结合融合蛋白质的Fc部分， 从而将所述免疫球蛋白融合蛋白质纯化。参见，例如Reis, K. J. et al., J. Immunol. 132:3098國3102 ( 1984 ) ; PCT申^青/>开号W087 / 00329。通过用带有离液序列高的盐处理洗-提融合多肽或者通过 含水乙酸(1M)洗^是所述融合多肽。估文为选4奪，本发明的ABO血型融合多肽可以通过本领域已 知的方法化学合成。例如，多肽的化学合成已经4皮描述，例如， 各种蛋白质合成方法是本领域常用的方法，包括使用肽合成器进 行合成。参见，例如，肽化学作用， 一种实用教科书，Bodasnsky 版本，Springer - Verlag, 1988; Merrifield, Science 232 : 241 - 247(1986) ; Barany, et al, Intl. J. Peptide Protein Res. 30 : 705 - 739(1987) ; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957画989 ( 1988),和Kaiser, et al, Science 243 : 187國198 ( 1989)。使用标准肽纯化技术将所述 多肽进4亍纯化^f吏他们基本上不含有化学前体或者其他的化学试 剂。术语"基本上不含化学前体或者其他的化学试剂"包括肽的制 备，其中肽/人其合成过程4吏用的到的化学前体或者其他的化学试 剂中分离。在一个实施方案中，术i吾"基本上不含有化学前体或 者其他的化学试剂"包括制备具有小于大约30% (干重)的化学 前体或者非肽化学试剂的肽，更优选的制备具有小于大约20%化 学前体或者非肽化学试剂的肽，更优选制备具有小于大约10%化 学前体或者非肽化学试剂的肽，和制备具有最优选小于大约5% 化学前体或者非肽化学试剂的肽。多肽的化学合成促进修饰或者非自然氨基酸的整合，所述修 饰的或非自然氨基酸包括D -氨基酸及其他小有机分子。用相应 的D-氨基酸同种型置换一种或一种以上肽中的L-氨基酸，这种 置4奂可以;陂用来增加肽只于酶^H匕水解的^^元力，且可以用于增加生物学活性肽一个或一个以上性质，即，受体结合、官能效力或者作用持续时间。参见，例如，Doherty， et al, 1993. J. Med. Chem. 36 : 2585 - 2594; Ki勿，et al, 1993. J. Med. Chem. 36:3802 - 3808; Morita, et al, 1994. FEBS Lett. 353 : 84 - 88; Wang， et al, 1993. Int. J. Pept. Protein Res. 42 : 392 - 399; Fauchere and Thiunieau, 1992. Adv. Drug Res. 23 : 127 - 159。向一种肽序列中引入共价交联4建可以从构象上和地形上束 缚多肽骨架。这一方法可以被用来发展带有增加的效力、增加的 选择性和稳定性的融合多肽的肽类似物。由于环状肽的构象熵比它直线型乂于应物的构象熵要j氐，因此〗吏用 一种特定构象可能4吏环 状类似物的熵比非环形类似物的熵下降的程度小，乂人而得到用于 更好结合的自由能。往往通过在肽N-和C-末端之间形成一种酰 胺键、在侧链和N画或者C-末端(例如，在plK直为8.5时带有 K3Fe(CN)0) (Samson et al" Endocrinology, 137 : 5182 - 5185 (1996))之间形成一种酰胺4建、或者在两个氨基酸侧链之间形成一 种酰胺4建来完成大环化作用。参见，例如，DeGrado, Adv Protein Chem, 39 : 51 - 124 ( 1988)。同时，将二碌"建引入线性序列来减少 4也们的灵活'f生。参见，例长口， Rose, et al., Adv Protein Chem, 37 : 1 -109 ( 1985); Mosberg et al， Biochem Biophys Res Commun, 106 : 505 - 512 ( 1982)。此外，带有青霉胺(Pen, 3-巯基-(D)缬氨酸) 的半胱氨酸剩余物的取代已经被用于增加某些鸦片样物质-受体 相互作用的选择性。Lipkowski和Carr的《肽合成、结构和应 用》，Gutte片反本，学术出X反-土出X反，第287 - 320 ( 1995)。组合物和试剂盒本发明还包4舌一种组合物，这种组合物包含至少两种血型抗 原(例如，ABO血型低聚糖)，且其中每种血型抗原在不同的核 心4唐化物《连类型上表达。所述血型抗原是一种A型抗原、 一种B型抗原或者一种H型抗原。所述核心糖化物链类型可以是l型、2 型、3型或者4型。所述组合物包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或更多 不同的血型抗原。示范性的血型抗原包括上面所描述的。任选的，ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质与一种固 体支持物相连。所述连接4建是共价的。估文为选l奪，所述连接4建是 非共价的。所述固体支持物可以是，例如，》兹珠、树脂、薄膜或者平圆 形物、或者任何一种适合于本发明方法的固体支持物材料。优选 的，该固体支持物是^兹珠，例如，獨W兹5朱。所述石兹主朱的尺寸不重 要。通常，所述》兹J朱的直径至少为1到50樣吏米，颗粒大小为1 到IO微米是优选的。最优选的所述磁珠具有大约4-IO微米的直 径。例如，具有2, 3， 4， 5, 10， 15, 20, 25, 30， 40或50微米的直径。所述磁珠可以由金属化合物、硅、橡胶、聚合材料或者涂有 金属金属化合物的硅、橡胶或者聚合物核。所述固体支持物可以传送官能团，例如羟基基团、羧基基团 醛基团或者氨基基团。所述支持物可以带有正电荷、带有负电荷 或者是疏水性的。本发明使用的功能化的被涂布的支持物可以通 过支持物的修饰作用来制备。例如用带有一个或者更多这种官能 团的聚合物处理未涂布的支持物，例如聚氨基曱酸酯和聚二醇一 起提供羟基或者通过纤维素衍生物提供羟基，丙烯酸或者曱基丙 烯酸的聚合物或者共聚物能够提供羧基，或者氨烷基化的聚合物 能够提供氨基基团。美国专利第4,654,267号描述了许多表面涂层 的引入。优选的每种不同的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白 质位于不同子类型的微磁珠上。子类型是指每种孩W兹珠是有显著 区别的，例如，具有不同的大小或者具有可区别的标记。不同大 小的微磁珠或者带有例如荧光团标记的微磁珠使这些不同的磁 珠能够被识别和/或分离，例如通过流式细胞计进行识别和/或分 离。本发明进一步提供了一种试剂盒，使用本发明所述的方法， 该试剂盒用于从样品中分离或鉴定血液基团反应性抗体。所述试 剂盒包含许多各种子类型的微磁珠，每种子类型都涂布有不同的 ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白质。任选的，所述试剂 盒至少包含一种打开的带有标记的配位体，所述配位体能够特异 性的结合抗血型抗原抗体。例如，所述配位体是一种抗体或其片 段，例如，Fab、 Fab-和F(ab-)2片段。"特异性结合"或者"与… 发生免疫反应"是指所述抗体与一个或一个以上期望抗原的抗原 决定簇反应，且不与其他多肽反应(即，结合)或者与其他的多 肽以很低的亲合力(Kd>10 6)结合。所述抗体是单1^介抗体。所述标记物可以是任一f可一种用于促进輩巴分子识别和/或定量 的物质。标i己物既可以;波直4妻，见察或测量，又可以^皮间^妄i也只见察 或测量。标记物包括但不仅限于，可以使用放射计数装置测量的 ;改射性同位素；颜冲+、染冲牛或者其他可以4见觉7见察到或用分光光 度计测定的生色团；可以通过自旋标记物分析器测定的自旋标记 物；和荧光基团，其中适当的分子加合物的激发作用能够产生输 出信号，且可以通过^皮染料吸收的灯的激发作用显象，或者可以 4吏用例如标准荧光测定计或成^f象系统测定。所述标i己物可以是一 种发光物质，例如，是磷光体或荧光团； 一种生物发光物质；一 种化学发光物质，其中，通过信号化合物的化学修饰产生输出信号； 一种包含金属的物质；或者一种酶，其中，这里存在一种酶 依赖型的第二代信号，例如从无色的底物中形成的带有颜色的产一种惰性颗粒，包括但不仅限于胶体金、微球体、量子点、或无 才几晶体，所述无才几晶体例如纳米晶体或-粦光体(参见，例如，Beverloo, et ah, Anal. Biochem. 203, 326 - 34 ( 1992))。术语"标记 物"还可以^皮称作"标记"或可以有选择地结合标记分子的半抗原， 从而随后加入的标记分子可以被用于产生可4全测信号。举例来 i兌， 一方面可以4吏用生物素、亚氨生物素或脱好u生物素4乍为标i己， 随后使用一种抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素与辣根过氧化酶(HRP)的结合物与标记相连，随后，使用一种显色底物(例如， 四甲基对二氨基联苯)或 一 种荧光底物来检测辣根过氧化酶(HRP)的存在，其中，焚光底物例3口 Amplex纟工或Amplex金 黄(Molecular Probes />司)。相似地，所述标i己可以是一种半 抗原或抗原(例如，异羟洋地黄毒香配基)，且一种酶催化的、 荧光的或》文射性标记的抗体可用于与标记物结合。i午多标"i己物对 本领域普通技术人员是已知的，这些标记物包括，但不仅限于， 颗粒、荧光染料、半抗原、酶及其产色底物、荧光底物和化学发 光底物，其他的标记物描述在Richard P.Haugland编辑的《荧光 探针的分子探针手册和化学试剂研究》第6版(1996)中，和随 后的分别在1999年十一月和2001年五月出片反CDX反的第7和第 8版本，其内容和其他的出版物通过引证在此全部并入本文。荧光团可以是4壬<可一种能够在280纳米之上显示出最大吸收 的化学基团，且当共价附着于标记试剂上时，能够保持其光谱性 质。荧光团包括，但不仅限于一种嵌二萘(包括美国专利第 5,132,432号7>开的<壬<可一种相应的书亍生化合物)、 一种蒽、 一种萘、 一种吖啶、1-2-二苯乙烯、吲哚或者苯并吲哚、恶唑或者苯 并恶唑、p塞唑或者苯并p塞唑、4國氨基-7-硝基苯并画2画氧杂-1,3國二唑(NBD)、 一种花青素戒(包括美国系列号09 / 968,401和 09 /969,853所7^开的^f壬-f可一种相应^f匕合物)、 一种,炭花青(包括 美国系歹'J号09 / 557,275; 09 / 969,853禾口 09 / 968,401;美国专矛J 第4，981，977号；第5,268,486号；第5,569,587号；第5,569,766 号；第5,486,616号；第5,627,027号；第5,808,044号；第 5,877,310号；第6,002,003号；第6,004,536号；第6,008,373号； 第6,043,025号；第6,127,134号；第6， 130,094号；第6,133,445 号；和公开号WO 02 /26891、 WO 97/40104、 WO 99 /51702、 WO 01 / 21624; EP 1 065 250 Al中声斤4笛述的4壬4可一种才目应4匕合 物)、 一种carboslyryl、 一种卟啉、 一种邻羟基苯曱酸盐、 一种 氨基苯曱酸盐、 一种甘菊环烃、 一种二萘嵌苯、 一种吡啶、 一种喹啉、 一种硼化聚氮杂吲丹烯(包括美国专利第4，774，339号； 第5,187,288号；第5,248,782号；第5,274,1 13号；和第5,433,896 号中公开的任何一种相应化合物)、 一种夹氧杂蒽(包括在美国 专矛J第6, 162,931号；第6,130,101号5第6，229，055号^第 6,339,392号；第5,451,343号和美国系歹'J号09 / 922,333中公开 的任何一种相应化合物)、一种噁、秦(包括在美国专利第4,714,763 号中/>开的任何一种相应化合物)或者一种苯并恶。秦、 一种卡巴 。秦包括在美国专利第4,810,636号中公开的任何一种相应化合 物)、 一种次联苯曱酮、 一种香豆素(包括在美国专利第5,696,157 号；第5,459,276号；第5,501,980号和第5,830,912号中公开的 相应化合物)、 一种苯并吹喃包括在美国专利第4,603,209号和 第4,849,362号中公开的相应化合物)和苯并次联苯甲酮(包括 在美国专利第4，812，409号中公开的任何一种相应化合物)及其 衍生物。如这里使用的，噁。秦包括9-羟基-3-异吩恶唑酮(包括 在专利5,242,805号中公开的任何相应化合物)、氨基。秦酮、二 氨基嗪及其与苯有关的取代的类似物。任选的，所述试剂盒包含阳性参照或阴性参照或者两种都包括、用于4吏用该试剂盒的说明书(例如，书面记载的、,兹带录制的、VCR形式、CD-ROM形式等等)、样品收集途径。才羊品收 集途径对本领域:技术人员来将是已知的。例如，才羊品收集途径是 一种CPT真空采才羊管。所述试剂^皮包装在单独的容器中，例如，ABO血型低聚4唐或 者ABO血型融合蛋白质(或者与固体基质结合或者分别与用于 将他们结合在基质上的试剂包装在一起)、 一种对照试剂(阳性 和/或阴性的对照试剂)、和/或一种标记的配位体。治疗或预防抗体调节的移植排异的方法治疗或者预防抗体调节的移4直排异(AMR),例如，器官移 才直的方法同样包括在本发明的范围内。这种移才直包括〃f旦不^又限于 肾移植、肝移植、皮肤移植、胰腺移植、角膜移植或者心脏移植。 抗体调节的移植排异AMR包括受赠者产生的任何一种抗体调节 的移植排斥。所述方法包括将来自主体的生物样品与本发明的 ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽相接触。所述生物样品是， 例如血液，即，全血或者血浆。该样品已知包括一种抗体，或者 怀4是包^"一种抗体，例如， 一种抗血型抗体。在某些方面，所述 生物样品在与ABO血型低聚糖或者ABO血型融合多肽接触之前 从主体体内取出。在允许ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽 -抗血型抗体复合物形成的条件下将ABO血型低聚糖或者ABO 血型融合肽与生物样品相接触。如果存在的话，所述ABO血型 低聚糖或者ABO血型融合肽-复合物从生物样品中分离出来，从 而除去抗血型抗体并将生物样品重新融入主体体内。抗体调节的移植排异(AMR)还可以通过向主体给药本发明 的ABO血型融合多肽进行治疗或预防。所述主体可以是例如，任何一种哺乳动物，例如，人、灵长 类动物、老鼠、鼠、狗、猫、母牛、马、猪。所述治疗在患者4妻受ABO血型不相容的移植之前给药。做为选择，述治疗在患者接 受ABO血型不相容的移才直之后给药。将所述生物样品和ABO血型低聚糖或者ABO血型融合蛋白 质通过本领域内已知的方法相4妻触。例如，血浆除去法或者体外 免疫吸收法。基本上，4壬<可一种病因上与抗体调节的反应有关的病症都可 以-故预防或者治疗。器官移才直的存活率大于未通过本发明方法治 疗的器官移植的存活率时，抗体调节的移植排异(AMR)被有效 的治疗或预防了 。移植的存活率是指移植被受赠者排斥之前的时 间。例如，当移植存活至少1星期、2星期、4星期或者8星期 之后进行抗体调节的移植排异(AMR )的治疗或者预防。优选的， 移植存活时间为3个月、6个月、13个月。更优选的，移植存活 2年、3年、5年或更多年。从样品中除去抗血型抗体的方法本发明还包括乂人才羊品中除去或者减少抗血型抗体的方法。所 述样品是一种生物液体，例如，血液或者血浆。样品是一种生物 组织，例如心脏组织、肝组织、皮肤、或者肾组织。本方法包括 将样品与本发明的ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽相接触。 在允许ABO血型低聚糖或者ABO血型融合肽-抗血型抗体复合物品相接触。所述ABO血型融合肽抗体复合物如果存在的话，则从 生物才羊品中分离，/人而除去或者减少抗血型抗体。本方法可以有效地用于生产万能供血者血浆,血型鉴定方法本发明还包括主体血型测定的方法。通过将取自主体的才羊 品，例如，血浆或者全血与不同子类型的微磁珠相接触。每种子 类型包含不同的血型抗原。所述血型抗原在不同的核心#唐4匕物链 类型上表达。所述微磁珠和样品相互接触，例如， 一起培养足够 长的时间，从而允许存在于样品中的抗血型抗体结合，例如，形 成一种血型抗原抗体复合物，/人而将血型抗原捆绑在孩"兹^朱上。在复合物形成之后，任选地将4羊品洗涤一次或 一次以上乂人而 除去非结合的血浆成分。做为选择，非结合的血浆成分通过进行 分离步骤从微磁珠上除去，在分离步骤中，微磁珠从样品中除去。 4吏用本领域普通4支术人员已知的方法进行分离，所属本领域普通 技术人员已知的方法例如，离心作用。所述孩"兹珠进一步地与一 种标记试剂相接触，该标记试剂能够特异性结合与微》兹珠相连的 抗血型抗体。任选地将孩L磁珠洗涤一次或 一次以上从而除去非结 合的标记试剂。随后通过测定标记试剂确定样品中是否存在抗血 型抗体。4吏用本领域普通技术人员已知的方法进行4企测，例如，通过;危式细月包"i十或者luminex液态芯片方、;去。本发明还提供了用于才企测才羊品中多^f咅抗血型抗体的方法。多 倍抗血型抗体不只意p未着对每种血型(即，ABH)具有特异性的 抗体，还指对不同的低聚糖核心链型的血型抗原具有特异性的抗 体。通过将生物样品与额外的4企测试剂相接触来识别不同的靶分 子，随后〗吏用如上所述的方法，将生物样品与额外的标记试剂相 4妻触，所述额外的标记试剂对额外的^r测试剂具有特异性。例如， 用不同的血型抗原制备孩^U兹珠的子集，例如， -使用具有不同核心 低聚糖链类型的血型抗原。然后将所述微磁珠子集加入到包含控 制比例的生物;洋品中。在作为替换的方法中，用不同的标记物，例如具有不同发射 光谱的荧光团制备标记试剂子集，例如， 一种发出绿色光谱，另 一种发出红色光谱。然后将所述标记试剂子集加入到包含控制比 例的4全测试剂-輩巴分子复合物的生物样品中，例如，每〗分輩巴分子 结合抗体中包括两份一种标记试剂(例如，发出绿色光谱的)和 一份另一种标记试剂(例如，发出红色光谱的)。这样，所述免 疫标记的复合物可以用于才企测輩巴分子。如果向冲羊品中加入另一种 免疫标记的复合物，则原始靶分子与随后4企测出的靶分子是不同 的。任选的，在样品中4全测出2, 3, 4, 5, 6, 7， 8, 9, IO或更多种血型抗原。所述样品包括任何一种能够包含血型抗原的材料。 一般地， 所述々羊品是全血、血清或者血浆。本发明方法在现有血型测定技术的基础上纟是供了 一种重要 的优点。具体而言，该方法允许血型抗原子类型的4企测。此外， 本方法允许样品中不同的血型抗原子类型的检测。所述检测试剂是一种化合物，该化合物能够特异性的结合与 微磁珠相连的血型抗体。根据希望的靶分子选择所述检测试剂。 该才全测试剂是，例如， 一种多肽，例如一种耙向特异性抗体或者 其片段。如这里使用的，术语"抗体"是指免疫球蛋白分子和具有 免疫活性部分的免疫球蛋白(Ig)分子，那就是说，包含抗原结 合部位的分子，所述抗原结合部位特异性的结合抗原(与抗原发 生免疫反应)。这种抗体包括多克隆的、单克隆的、嵌合的、单 链、Fab、 Fab'和F (ab')2片革殳，和一种Fab表达文库。"4争异性 结合"或者"与。。。发生免疫反应"是指抗体与一个或一个以上期 望抗原的抗原决定簇发生反应而且不与其他多肽发生反应(即，结合)或者与其他的多肽以低得多的亲合力(Kd〉 10"结合。常，单克隆抗体比多克隆抗体更壽l感的且更具有特异性，多克隆 抗体依赖于产生所述抗体的动物的寿命，与此不同，单克隆抗体 的供应是不确定的。然而，当必须4吏用具有多倍同种型的抗体时， 多克隆抗体是有效的，最常见的单克隆抗体是IgG亚类。如这里使用的，术语"免疫结合"和"免疫结合性质"是指免疫 球蛋白分子和与此免疫球蛋白具有特异性的抗原之间存在的非 共1^介相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或者亲合力可以用 相互作用术语"电离常数(Kd )"表示，其中较小的电离常数(Kd ) 代表较大的亲合力。使用本领域内已知的方法确定所选4奪多肽的 免疫结合性质。 一种方法需要测量抗原结合簇/抗原复合物形成 和分解的速率，其中所述速率取决于复合物成分的浓度，相互作用的亲合力和几何参凄t同样影响形成和分离速率。因此，"连4妄 速率常数"(Kon)和"解离速率常数"(KOff)可以通过计算浓度 和结合以及分离的实际速率计算确定。(参见1993年发表在 Nature (《自然》)上361:186 - 87页的文献)。Koff/Kon的比 率能够消除所有与亲合力无关的参数，因此等于电离常数IQ (通 常参见Davies等人1990年发表在Annual Rev Biochem 59:439 -473页的文献)。通过下面非限制性的实施例对本发明进行进一步"i兌明实施例1.表达载体的构建修饰传送P -选凝素糖蛋白配位体-1 /老鼠IgG2b ( PSGL - 1 / mIgG2b)互补DNA的表达载体4吏之包含一种肠激酶(EK)分裂位点。该位点在下游分离老鼠IgG2b部分时会Y吏用到。所述人血型A基因用聚合酶连锁反应(PCR)扩增，以总RNA中制得的 互补DNA为基础，所述总RNA乂人MKN - 45细胞株中分离出来， 且血型B基因进行聚合酶连锁反应(PCR)扩增，以总RNA中 制得的互补DNA为基础，所述总RNA 乂人HuTu80细月包才朱中分离 出来。用于产生稳定转染子的表达载体是双向作用的，参见示意 图。所述PSGL - 1 / mlgG2b表达载体具有聚合物连4妄剂的EFla 促进剂上游、 一种拼接捐献位点和受体位点、和SV40的双向作 用聚(A)附加信号。相反，在转录方向，使用相反方向的聚(A) 信号，该第二转录单元由HSVTK促进剂组成，随后是编码嘌P令 霉素转乙酰酶(PAC)的序列。相似地，所述(31，6GIcNAcT (核 心2酶)表达载体包含EFkx促进剂和编码新链丝菌素抗性基因(Neo)的序列。所述FUT2 ( Se-基因)表达载体包含相同载体 骨架，但是具有CMV促进剂和新链丝菌素抗性基因。GaINAcT(A-基因)和GaIT ( B-基因)表达载体包含CMV促进剂和 blasictidin抗性基因(Bsd) ， FUT1 ( H-基因)和卩l,3GlcNAcT6(核心3酶)包含CMV促进剂和zeocin抗性基因，GaITS表达 载体包含CMV促进剂和鸟嘌呤核苷转^粦酸核糖基酶基因(GPT)。通过自动测序方法测定表达载体的DNA序列。实施例2.使用蛋白印迹和间接免疫荧光法测定PSGL- 1 /MIGG2B的表达4吏用十二烷基石黄酸钠聚丙烯酰胺凝月交电泳和蛋白印迹方法 测定PSGL画1 / mlgG2b在细月包:t咅养上清液中的表达。所述才羊品在 MES緩沖液(购于Invitrogen公司)中穿过4 - 12%浓度梯度的 凝胶柱(购于Invitrogen公司)，且将分离的蛋白质电泳渗透在 硝化纤维薄膜(购于Invitrogen公司)上。在含有3%牛血清白蛋 白(BSA) 、 0.2%吐温20的磷酸盐緩冲盐水(PBS)中结合1小时，随后，该薄膜在室温下用在封闭緩沖液按1:4.000的比例 稀释后的过氧化物酶-结合的山羊抗老鼠IgG Fc抗体(购于Sigma 公司)进行探针试验。之后用包含0.2%吐温20的磷酸緩冲液洗 涤薄膜三次，按照厂家的"i兌明书，通过使用ECL试剂盒(购于 Amerham生物科学/^司)进行化学发光对结合的抗体显象。通过间接免疫荧光确定PSGL - 1 / mlgG2b的细胞定位。按照 厂家i兌明书用PSGL - 1 / mlgGib表达载体脂质体Lipofectamine 2000 (购于Invitrogen7^司)瞬时4争染4妄种在六孑l^反盖3皮片上的 CHO-Kl细胞。转染四十八小时工作的后，用石粦酸緩沖液洗涤细 胞并固定在30%丙酮/甲醇中。在含有1% BSA的磷酸緩冲液中 封闭30分钟之后，使用在封闭緩冲液中按1:200的比例稀释的 FITC -结合的山羊抗老鼠IgG Fc抗体(购自Sigma^^司)测定PSGL -1/mlgG2b蛋白质。用4，6 -二脒基2画苯基吲哚(DAPI)对细胞核 进行染色。用Vectashield固定介质(载体实验室)将盖玻片固定 在滑片上。用DMRXA显微镜(Leica公司)检验该滑片，并用 Hamamatsu C4880 - 40 CCD摄像机(Hamamatsu Photonics Norden AB ) Openlab程序包(Improvision )和Adobe Photoshop软件(参 见附图)进行数字成像。实施例3 : CHO -细胞对不含血清的培养基的适应性根据厂家i兌明书CHO画Kl细胞株(ATCC CCL画61 )适合于 不含血清的培养基，Ex-细胞302 (购自JHR生物科学公司)。实施例4: DNA4争染和克隆筛选适合于不含血清的培养基的CHO - Kl纟田胞接种到75平方厘 米的烧并瓦中并用脂质体Lipofectamine 200 CD (购自Invitrogen />司)和一种不含有动物源物质的制剂，^換照厂家的i兌明书^f吏用PSGL - 1 / mlgG2b表达载体转染。转染之后四十八小时，细胞净皮 培养在包含嘌呤霉素的选择培养基中(6微克/毫升)。选择的培 养基每三天改变一次。大约2星期之后，按照厂家说明书，使用 死亡细月包除去孩t,兹珠(Miltenyi生物技术)除去死亡细J包。在96 孔寿反中对活细月包进4亍单细月包克隆，并延伸进选择i咅养基中大约2 周。收集细胞^咅养上清液，Y吏用一种山羊抗老鼠IgG Fc抗体 (Sigma公司)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)估价hPSGL - 1 / mlgG2b的浓度，方案如下所示。选择具有最高hPSGL - 1 / mIgG2b 表达的细胞克隆体进4于进一步扩展。实施例5:使用酶联免疫吸附试验(ELISA )定量评价PSGL -1 /MIGG2B在上清液中的浓度将细胞接种到25平方厘米的烧瓶中(1 lxl0"田胞/毫升)。 4天后收集细胞培养上清液。用酶联免疫吸附试-睑(ELISA)评 定通过细胞克隆生产的PSGL - 1 / mlgG2b浓度。用浓度为10凝: 克/毫升的亲合-净化的山羊抗mlgG Fc抗体(Sigma公司)涂布 九十六孔酶联免疫吸附试-验(ELISA )平板(Costar 3590, Corning 公司)2小时。用含有1。/。BSA的磷酸緩沖液封闭该平板2小时。 在封闭液中，包含PSGL - 1 / mIgG2b的上清液^皮逐次^希释并祐:i咅 养2小时。随后洗涤，将该平4反与在封闭緩冲液中按1:4.000的 比例稀释后的过氧化物酶-结合的山羊抗老鼠IgG Fc抗体 (Sigma) —起培养2小时。用3，3'，5, 5'-四曱基对二氨基联苯 二氢氯化物(Sigma公司)对连接上的过氧化物酶-结合的抗体显 象。用2M的硫酸终止反应，在自动微板阅读器(Bio-Tek仪器) 中在450纳米下阅读该平4反。4吏用经过标准稀释系列的纯净的 mlgG Fc片革爻(Sigma 乂>司)i十算PSGL國1 / mIgG2b ;农度。选择 具有最高产量的细胞克隆林(大约25微克/毫升)进行进一步转 染，如下所述。实施例6:用血型A/B型3型抗原取代的PSGL- 1 / MIGG^的产生使用FUT2 (Se -基因)表达载体转染具有最高PSGL - 1 / mlgG2b表达量的稳定CHO - Kl细胞抹，如上所述，并在包含G418 的培养基(400微克/毫升)中进行选择。用GaINAcT (A-基因) 或者GaIT ( B -基因)表达载体转染在PSGL - 1 / mlgG2b上具有 最高血型H型3型抗原相对lt目的细力包克隆4朱，并在包含 blasticidine的培养基中进行选择，乂人而产生一种细胞系，这种细 胞系能够在PSGL -1 / mlgG2b上分别生产血型A和B型3型抗原 (参见转染方案)。实施例7 :用血型A/B型2型抗原取代的PSGLr 1 / MIGG^的产生使用P1，6G1cNAcT1 (核心2酶)和FUT1 (H-基因)表达载体 转染具有最高PSGL -1 / mlgG2b表达量的稳定CHO - Kl细胞抹，并 在包含G418 ( 400微克/毫升)的培养基中进行选择。用al，3 GaINAcT ( A-基因)或者al,3GalT ( B-基因)表达载体转染在 PSGL - 1 / mlgG2b上具有最高血型H型2型抗原相对数目的细胞克 隆林，并在包含blasticidine的培养基中进行选择，从而产生一种 细胞系，这种细胞系能够在PSGL - 1 / mlgG2b上分别生产血型A和 B型2型抗原(参见转染方案)。实施例8:用血型A/B型1型抗原耳又代的PSGL - 1/MIGG^的产生用pi,3GIcNAcT(核心3酶)和GalT5表达载体转染在PSGL -1 / mlgG2b上具有最高血型H型3型抗原相对数目的细胞克隆 林，并在包含zeocin的培养基中进行选择。用al，3GalNAcT ( A画基因)或者ccl,3GalT ( B -基因)表达载体转染在PSGL - 1 / mlgG2b上具有最高血型H型1型抗原相对数目的克隆抹，并在 包含blasticidine的培养基中进行选择，从而产生一种细胞系，这 种细l包系能够在PSGL-l/mlgG2b上分别生产血型A和B型1型 抗原(参见转染方案)。实施例9:重组HPSGL - 1 / EK / M GG^的纯化通过离心作用除去细胞培养上清液，并通过包含山羊抗老鼠 IgG (整体分子)琼脂糖柱(Sigma公司)。用磷酸緩冲液洗涤 之后，用3M NaSCN洗4是结合的hPSGL - 1 / EK / mIgG2b，并用 蒸馏水透析。为了除去低分子量污染物，进一步通过凝胶过滤法 在HiPrep 16/60 Sephacryl S - 200 HR 4主(Amersham生物^牛学) 上纯化hPSGL - 1 / EK / mIgG2b。与琼脂糖凝胶和柱填充物的共价偶联4吏用标准生物结合化学作用蒋纯化的血型A和B粘蛋白共 <介 的与琼脂糖快速流动的磁珠连在一起。连接之后，琼脂糖凝胶被包装在塑料容器中形成实际的色谱柱。 测试原型柱的吸附效力和生物适合't"生通过标准血库技术，包括血球凝集作用和间接的抗球蛋白试 验评定集中控制的血型O血浆吸附之前和之后的抗血型ABO抗体 滴定度。通过标准基数测定血浆蛋白，所述血浆蛋白包括免疫球 蛋白(IgG、 IgM和IgA)、互补因子/片段(C3、 C3a、 C3d、 C4 和sC5b-9)、免疫复合物、和;疑血因子(FVIII、法是血酶原、纤 维蛋白原、纤维蛋白降解产物)。使用重组粘蛋白携带的在确定 的核心糖化物链上的血型A/B型抗原通过酶联免疫吸附测定(ELISA),或者通过薄色层分离法为基础的覆盖试验测定^皮吸 附和洗提的ABO抗体、以及未吸附的ABO抗体的专一'1"生，其中薄 色层分离法为基础的覆盖试-睑中使用纯化的且结构确定的血型A 和B糖月旨。实施例10:用于确定抗体滴度的不同的大小和颜色的》兹^朱的德、国罗斯4乇克的micromod Partikeltechnologie有卩艮^>司生产 了不同大小和颜色的,兹珠，并能结合不同类型的血型抗原。通过 流式细月包计分片斤,兹珠，该》兹^朱在大'J 、且颜色方面都显示出良好的 分辨率(参见图5)。使用这个方法，使使用多种磁珠的混合物 称为可能，结合的》兹珠具有不同的大小-颜色强度组合，代表其 特异性核心组织上表达一种特异性血型抗原。实施例ll:血型^t体的^r测在含有0.5%人白蛋白的磷酸緩冲液中按1:10的比例稀释血 清样品，并与携带血型抗原低聚糖的橡胶孩"兹珠(4.6孩t米；18 微克干重)混合。血清和孩W兹珠在室温下培养30分钟，并用0.5% HAS / PBS洗涤。向洗涤后的孩U兹珠中加入FITC标记的抗人IgM 和PE标记的IgG，并用流式细胞计分析。参考文献1) L Rydberg Transfus Med 2001;11:325-3422) Kl Welsh, M van Dam, CG Koffman Transplant Proc 1987; 19:4565-4567 3) K Tanabe, K Takahashi, T Agislii, H Toma， K Ota Transfus Sci 1996; 17: 455-4624) K Takahashi Acomodatioii in ABO-incompatible kidney transplantation: Elsevier, Amsterdam; 2004.5) MD Stegall, PG Dean, JM Gloor Transplantation 2004; 78: 635-6406) CJ Sonnenday, DS Warren, M Cooper, et al Am J Transplant 2004; 4: 1315-1322 7) G Tyden, G Kumlien, H Genberg, J Sandberg: T Lundgren, I Fehrman Am JTransplant 2005; 5: 145-1488) DS Warren, AA Zachary, CJ Sonnenday, et al Am J Transplant 2004; 4: 561-5689) H Clausen, S Hakomori Vox Sang 1989; 56: 1-2010) R Oriol, J Danilovs, HR Hawkins A J Hum Genet 1981; 33 H) F Yamamoto Immunohematol 2004; 20: 3-2212) K F翻kawa, MJ Mattes, KO Lloyd J Immunol 1995; 135: 4090-409413) M Mammen, S Choi, G Whitesides Angew Chem Int Ed 1998; 37: 2754-279414) JC L5tling, E Hauzenberger， J Holgersson 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权利要求
1.一种组合物，包括至少两种血型抗原，其中，每种血型抗原表达在不同的核心糖化物链类型上。
2. 根据权利要求1所述的组合物，型4元原、B型^L原或H型纟元原。
3. 根据权利要求1所述的组合物， 体支持物相连。
4. 根据权利要求1所述的组合物， 是1型、2型、3型或者4型。其中所述血型抗原是一种A其中所述血型抗原与 一种固 其中所述核心糖化物《连类型
5. —种吸收剂，包括权利要求3所述的组合物。
6. —种测定主体血清中血型反应性抗体存在的方法，所述方法 包括a)提供不同子类型的微磁珠，其中每种子类型用不 同的血型抗原涂布，b)向凝J兹珠中加入所述来自主体的血 清；C)培养所述血清和微磁珠足够长的时间，使血清中的 抗血型抗体与所属血型抗原相结合；d)与至少一种能够特 异性结合所述抗血型抗体的标记配位体培养，所述抗血型抗 体结合有所述血型抗原；和e) 4企测结合所属抗血型抗体的 标记配位体的存在，乂人而确定所述反应性抗体是存在还是不 存在。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述血型抗原由不同的核 心糖化物链类型所携带。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述才全测时通过流式细胞 i十或luminex液态芯片蛋白分才斤系纟克。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述微磁珠中包括8种不 同的血型A/B #元原。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中微磁珠是乳胶制成的。
11. 根据权利要求7所述的方法，其中由于选择了不同的直径或 不同的颜色，至少 一种血型抗原子类型的孩^U兹5朱与至少 一种 另外的血型子类型的樣U兹多朱不同。
12. 根据权利要求7所述的方法，其中由于用不同的标记物进行 了标记，至少 一种血型抗原子类型的樣U兹;朱与至少 一种另外 的血型子类型的凝J兹5朱不同。
13. 才艮寺居4又利要求11所述的方法，其中标记物是荧光标记物。
14. 根据权利要求7所述的方法，其中微磁珠的直径大约是5微米。
15. 根据权利要求7所述的方法，其中凝bf兹珠的直径范围在大约 2樣i米到大约15樣i米之间。
16. 根据权利要求7所述的方法，进一步包括在进行步骤(d) 之前除去所述血清成分的步骤，所述血清成分不特异性的结 合存在于所述微磁珠上的所述血型抗体。
17. 根据权利要求7所述的方法，进一步包括在进行步骤(e) 之前除去标记的配位体的步骤，所述标记的配位体不结合所 述抗血型抗体。
18. 根据权利要求7所述的方法，其中所述配位体是一种抗体或 其片段。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体是一种一价抗 体片段。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述一价抗体片段是Fab 或者Fab，片l殳。
21. 才艮据4又利要求19所述的方法，其中所述Fab或者Fab，片賴二 选自由一种抗Fc抗体片^爻、 一种抗K轻链抗体片^殳、 一种 抗入轻链抗体片,殳和一种单一链抗体片,殳所组成的组中。
22. 根据权利要求7所述的组合物，其中，所述链类型是l型前 体物、2型前体物或者3型前体物。
23. 不同子类型的微磁珠集合，其中每种子类型用不同的血型抗 原涂布。
24. 根据权利要求23所述的孩W兹珠集合，其中所述血型抗原由 不同的核心糖基化链类型携带。
25. 根据权利要求23所述的微磁珠集合，其中所述血型抗原在 重组粘液素上表达。
26. 根据权利要求25所述的微磁珠集合，其中所述血型抗原表 达是多化合价的。
27. 根据权利要求24所述的组合物，其中所述核心糖化物链类 型是l型前体物、2型前体物或者3型前体物。
28. —种除去血清中血型反应性抗体的方法，所述方法包4舌a) 提供具有不同子类型的微磁珠集合，其中每种子类型用不同 的血型抗原涂布，b)将所述微不兹珠与所述血清相接触；c) 将所述微磁珠与血清一起培养足够长的时间使血清中的抗 血型抗体与所述血型抗原相结合；d)将所述微磁珠与所述 血清相分离，因此从血清中除去所述反应性抗体。
29. 才艮据4又利要求28所述的方法，其中所述血型抗原在不同的 核心糖化物链类型上表达。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述核心糖化物链类型 是1型、2型、3型或者4型。
31. 根据权利要求28所述的方法，其中所述血型抗原表达在一 种重纟且粘液素上。
32. 才艮据权利要求28所述的方法，其中所述血型抗原表达是多 化合价的。
全文摘要
本发明提供了用于治疗或预防抗体介导的移植排异和血液类型的组合物和方法。
文档编号G01N33/58GK101405603SQ200780010334
公开日2009年4月8日 申请日期2007年3月23日 优先权日2006年3月23日
发明者J·刘, J·霍格尔森, L·布乔恩斯特罗姆, P·格鲁夫曼 申请人:阿布桑伯Ab公司