专利名称：一种携分子佐剂的融合蛋白避孕疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属生物制药领域，涉及一种与分子佐剂交联的避孕疫苗，具体涉及一种与分子佐剂C3d3交联的hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗。
背景技术：
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是由胎盘合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素，其主要的生理功能是延长黄体寿命，使之增大成为妊娠黄体，增加甾体激素的分泌以维持妊娠。hCG是妊娠期暂时出现的一种特异性激素，已有研究证实，中和hCG的生物学活性可以在不干扰其它生殖生物学功能的情况下中止妊娠，因此hCG成为避孕疫苗设计中理想的靶抗原。基于hCG结构中β亚基的特异性，以hCGβ为基础的合成肽疫苗已经进入了II期临床实验。实验结果显示，hCGβ避孕疫苗具有可喜的应用前景，但免疫效果个体之间的差异性和目前仅有的80％的避孕效果距临床应用相距甚远。因此，如何显著增强其具有抗生育作用的体液免疫效应，减弱有可能导致生殖系自身免疫损伤的细胞免疫效应已成为hCGβ避孕疫苗的研究目标。以往研究中，为打破机体对hCGβ小分子自身抗原的免疫耐受，大多采用白喉类毒素(DT)或破伤风类毒素(TT)作为载体增强其免疫原性，但DT和TT却存在着载体介导的表位抑制效应。
在哺乳动物免疫系统中，C3d是补体C3的最后裂解产物之一，它与B细胞和滤泡树突状细胞(FDC)上的受体(CR2，CD21)的相互作用于正常体液免疫应答的诱导和维持至关重要。1996年Dempsy首次报道C3d是一个能显著增强体液免疫效力的分子佐剂，将C3d与抗原融合形成的C3d-抗原复合物能使抗原的免疫原性增强1000～10000倍。Thomas D.Green等报道把膜结合形式的三个拷贝C3d(mC3d3)与流感病毒血凝素(HA)相联形成的mHA-C3d3 DNA疫苗和MitchellJA等把分泌形式的三个拷贝C3d(sC3d3)与麻疹病毒血凝素(H)相联形成的sH-C3d3 DNA疫苗在保护性免疫的出现、抗体亲和力的成熟和中和滴度方面都明显强于HA和H。最近他们采用了相似的方法将I型人类免疫缺陷病毒包膜表面蛋白(HIV-lgp120)融合到C3d3的羧基端，验证了C3d3增强体液免疫效应的能力。对于hCGβ避孕疫苗而言，决定其避孕效果的是体液免疫效力，而非细胞免疫。细胞免疫不仅没有中和hCGβ生物学活性的能力，在一定程度上还存在着导致生殖系靶细胞自身免疫损伤的危险。因此，用基因工程技术研制hCGβ避孕疫苗，并显著增强其具有抗生育作用的Th2型及体液免疫效应，减弱Th1型及CTL效应是hCGβ避孕疫苗的研究目标。
以往的研究，利用基因工程技术构建了hCGβ与3个拷贝C3d分子的真核表达质粒pcDNA3-hCGβ-C3d3，所得到的融合蛋白经鉴定证实既具有CD21分子结合活性，也具有hCGβ抗原性。在以上研究基础上，将hCGβ-C3d3cDNA构建入表达效率更高的真核载体pCMV4，通过对BALB/c小鼠的基因免疫，显示分子佐剂C3d3使hCGβ的免疫原性增强了200多倍，并实现了免疫效应从Th1型细胞免疫向Th2型体液免疫偏倚。由于基因疫苗在宿主细胞中的表达限制和基因疫苗在与宿主细胞基因组整合过程中，有可能激活原癌基因或破坏抑癌基因，理论上存在着致癌的危险性。因此，体外表达、纯化hCGβ-C3d3融合蛋白，制备基因工程疫苗，并针对此融合蛋白研究hCGβ-C3d3疫苗的免疫效应、抗生育效果及其作用机理将更为合理、安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种携分子佐剂的融合蛋白避孕疫苗，具体是一种高效、稳定、廉价的与分子佐剂C3d3交联的hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗。本发明的另一目的是提供制备hCGβ-C3d3融合蛋白避孕疫苗的方法。
本发明通过下述技术方案实现。
本发明选用真核表达载体phCMV1(Gene Therapy System，Inc.)，分别构建带有6个组氨酸(6His)纯化标签的hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。选用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为表达宿主，在体外表达、鉴定、纯化出hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白。分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐剂免疫不同品系小鼠。检测抗体水平、抗血清中和hCG生物学活性的能力和受试小鼠脾细胞分泌细胞因子的水平，证实分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗体液免疫效力和抗生育潜能的作用。
本发明方法包括下述步骤，1.构建分泌型真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。
(1)phCMV1-6His-hCGβ构建策略(图1)
采用PCR技术分别合成、扩增Hind III-Signal-6His-EcoR I片段和EcoR I-hCGβ(无信号肽及终止密码子)-BamH I片段。连接两片段后用Hind III和BamH I双酶切片段Hind III-signal-6His-EcoR I-hCGβ(无信号肽及终止密码子)-BamH I和pBS-hCGβ，连接得pBS-signal-6His-hCGβ。Hind III和Not I双酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ，连接得phCMV1-signal-6His-hCGβ。
(2)phCMV1-6His-hCGβ-C3d3构建策略(图2)Bgl II和Xba I双酶切pSG5-C3d3，BamH I和Xba I双酶切pBS-signal-6His-hCGβ，连接得PBS-signal-6His-hCGβ-C3d3。Hind III和Not I双酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ-C3d3，连接得phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3。
2.hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的表达、鉴定与纯化。
(1)重组质粒转染CHO细胞、抗性克隆筛选及无血清培养六孔板内CHO细胞95％汇合成片，用Lipofectamine2000分别介导phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、phCMV1、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ转染CHO细胞。用含G418(800-1000ug/ml)的完全培养基筛选抗药性克隆，含G418(300-400μg/ml)的培养液扩增阳性克隆。待阳性克隆95％汇合成片时换用CHO无血清培养基培养。
(2)阳性细胞克隆培养上清中hCGβ含量测定收集培养24、48和72小时的无血清培养上清，放免法测定hCGβ含量，选取高效表达hCGβ-C3d3融合蛋白的阳性克隆。反复3次冻存和复苏hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表达克隆，间隔时间为1个月，检测95％汇片后无血清培养48h培养上清中hCGβ的含量。
(3)Western blotting鉴定表达产物收集高效表达重组蛋白的阳性克隆培养72h的无血清培养上清，冻干法浓缩20倍后行Western blot鉴定。一抗是小鼠抗人hCGβ单抗，二抗为偶联HRP的兔抗小鼠IgG，用DAB底物显色。
(4)Raji细胞免疫化学染色鉴定hCGβ-C3d融合蛋白Raji细胞膜上具有丰富的CD21分子(C3d受体)，把Raji细胞分别与不同的表达产物共孵育，涂片固定后以小鼠抗人hCGβ为一抗，ABC法检测hCGβ，当hCGβ与C3d为融合蛋白时，才能使Raji细胞呈现阳性着色。收集phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1阳性克隆24小时的无血清培养上清，分别与Raji细胞37℃孵育1小时，然后涂布在包被有多聚赖氨酸的载玻片上。一抗为以小鼠抗人hCGβ单抗，用anti-mouse IgG ABC试剂盒检测。
(5)分离、纯化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白hCGβ蛋白采用ProBond 6his resin在非变性条件下一步法纯化获得。根据Western blotting的结果，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3的表达产物在用镍柱纯化的基础上，加用Sephadex G150 column进行了凝胶过滤层析以分离出高分子量的hCGβ-C3d3融合蛋白。
3.动物免疫和免疫效应免疫对象分别选用6～8周龄以体液免疫效应为主的BALB/c小鼠和以细胞免疫效应为主的C57BL/6小鼠，分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐剂进行免疫。共免疫两次，间隔4周。通过检测血清中的抗体水平以验证分子佐剂C3d3在个体差异较大的不同品系小鼠是否都能增强hCGβ蛋白抗原的免疫原性，并将C3d3的佐剂能力与弗氏佐剂进行比较。
4.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗介导免疫动物Th2型优势效应hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周脱颈处死，制备脾淋巴细胞悬液。体外用hCG刺激培养，培养48h后用ELISA法检测培养上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平。
5.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潜能实验hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周摘除眼球取血，分离出血清-20℃贮存备用。检测各免疫组小鼠血清抑制hCG刺激MLTC-1细胞分泌孕酮的作用和拮抗hCG诱导未成年小鼠子宫发育的作用。
本发明实验结果表明，1.经酶切及测序证实构建分泌型真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ正确。
2.脂质体法介导各组质粒转染CHO细胞成功。phCMV1-signal-6His-hCGβ和phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3阳性克隆无血清培养24、48、72小时重组蛋白的表达量分别为1225、1129、1325mIU/ml/1×106cells和496、527、633mIU/ml/106cells(以hCGβ含量计算)。pcDNA3-hCGβ和pcDNA3-hCGβ-C3d3阳性克隆无血清培液中24、48、72h hCGβ含量分别为703、762、828mIU/ml/106cells和327、395、443mIU/ml/1×106cells。phCMV1表达hCGβ的效率比pcDNA3高1.6倍，表达hCGβ-C3d3融合蛋白的效率比pcDNA3高1.4倍。反复3次冻存和复苏高效表达hCGβ-C3d3融合蛋白的阳性克隆，复苏细胞95％汇片后无血清培养48h，培液中hCGβ的表达量分别为679、665和672mIU/ml/1×106cells。；Western blotting结果显示phCMV1-6His-hCGβ-C3d3在CHO细胞中的表达产物有三条带，分子量分别为128KD、96KD和62KD左右。phCMV1-6His-hCGβ在CHO细胞中的表达产物为24KD左右。
.Raji细胞免疫细胞化学分析显示，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3阳性克隆的培养上清都能使细胞膜呈阳性着色，phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1阳性克隆的上清皆为阴性着色。
hCGβ蛋白用镍柱在非变性条件下一步法纯化获得，纯化产物具有较高的纯度(8a)。phCMV1-6His-hCGβ-C3d3阳性克隆培清的镍柱纯化产物有3种，大小分别为128KD、96KD和62KD(8b)。根据分子量的差异，加用Sephadex G150 column进行凝胶过滤层析分离出128KD的hCGβ-C3d3融合蛋白，该融合蛋白具有较高的纯度(8c)。
3.hCGβ-C3d3融合蛋白于初次免疫后2周开始产生抗体，4周时达峰值(1∶251)。加强免疫后一周抗体水平迅速升高，峰值可达1∶12589，高滴度的抗体水平(1∶6309)可持续至加强免疫后10周。hCGβ单独免疫组在加强免疫后才见抗体生成，抗体滴度分别比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组低1995倍，在加强免疫后第8周已检测不出抗体水平。hCGβ+CFA/IFA于初次免疫后第3周检测到抗体生成，其初次和再次免疫后的抗体效价分别比hCGβ-C3d3融合蛋白组低10倍和32倍。
C57BL/6小鼠初次和再次免疫后抗-hCGβ抗体生成的总体水平分别比BALB/c小鼠低2.5倍和4倍。初次免疫后只有hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组可检测到抗体生成。加强免疫后hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组的抗体滴度高达1∶3162，比hCGβ单独免疫组高1259倍。hCGβ+CFA/IFA初次和再次免疫后的抗体效价分别比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组低10倍和20倍。
4.hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ+CFA/IFA免疫组小鼠IL-4和IL-10分泌水平均显著高于hCGβ免疫组(P＜0.05)，以hCGβ-C3d3融合蛋白最为明显。以IL-4/IFNγ比值分析，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组为8.0，hCGβ+CFA/IFA免疫组为2.28，hCGβ免疫组为1.77。hCGβ-C3d3融合蛋白免疫动物显示出明显的Th2型优势效应。
5.10IU的hCG刺激7h，1×105MLTC-1细胞可分泌孕酮560.33ng/ml。hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ+CFA/IFA免疫组小鼠产生的抗血清均能明显抑制hCG刺激MLTC-1细胞分泌孕酮的作用(P＜0.05)，分别使孕酮分泌量下降到44.06ng/ml和102ng/ml，但两组间的中和能力无显著性差异(P＞0.05)。而单用hCGβ免疫产生的抗血清对hCG的生物学活性则几乎没有影响(P＞0.05)。
从原液至1∶400稀释的hCGβ-C3d3抗血清和1∶200稀释的hCGβ+CFA/IFA抗血清均可显著抑制hCG诱导的小鼠子宫增重(P＜0.05)，hCGβ抗血清只能在1∶50稀释时具有抑制作用(P＜0.05)。正常鼠血清对hCG诱导的小鼠子宫增重没有拮抗作用。
图1.phCMV1-6his-hCGβ构建示意2.phCMV1-6his-hCGβ-C3d3构建示意图.
图3酶切鉴定phCMV1-6His-hCGβ-C3d和phCMV1-6His-hCGβ图4.阳性CHO克隆无血清培液中24、48和72h重组蛋白的表达量。(以hCGβ含量计算，mIU/ml/106cells)图5.Western blotting分析phCMV1-6His-hCGβ-C3d3在CHO细胞中的表达产物图6.Western blotting分析phCMV1-6His-hCGβ在CHO细胞中的表达产物图7.Raji细胞免疫化学染色结果图8.SDS-PAGE分析纯化后的表达产物图9.BALB/c小鼠初次和再次免疫后的hCGβ抗血清效价，↑所指为第二次免疫的时间。
图10.C57BL/6小鼠初次和再次免疫后的hCGβ抗血清效价，↑所指为第二次免疫的时间图11.各组小鼠脾细胞培养上清中Th1型(IFNγ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)细胞因子表达水平(X±SD)，*表示与其它各组相比，P＜0.05。
图12.各组小鼠脾细胞培养上清中Th2型/Th1型(IL-4/IFNγ)细胞因子表达水平。
图13.正常鼠血清和hCGβ免疫鼠血清比较图14.不同稀释度免疫鼠血清对未成年小鼠子宫增重的拮抗作用具体实施方式
实施例1.构建分泌型真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ。
phCMV1-signal-6His-hCGβ构建策略(图2)以带有信号肽的hCGβ为模板，设计下列2对引物5’-CCAAGCTT ATG GAGATG TTC CAG GGG-3’，5’-CGGAATTC CCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGC CCATGT CCC GCC CAT-3’和5’-CGGAATTC TCC AAG GAG CCGCTT CGG-3’，5‘-CGGGATCC TTG TGG GAG GAT CGG-3’。以pBS-hCGβ为模板，用第一对引物扩增Hind III-Signal-6His-EcoR I片段。用第二对引物扩增EcoR I-hCGβ(无信号肽及终止密码子)-BamH I片段。用Hind III和EcoR I双酶切Hind III-Signal-6His-EcoR I片段，用EcoR I和BamH I双酶切EcoR I-hCGβ(无信号肽及终止密码子)-BamH I片段。连接得到Hind III-Signal-6His-EcoR I-hCGβ(无信号肽及终止密码子)-BamH I。用第一对引物的上游引物和第二对引物的下游引物扩增片段Hind III-Signal-6His-EcoR I-hCGβ(无信号肽及终止密码子)-BamH I。
Hind III和BamH I双酶切片段Hind III-signal-6His-EcoR I-hCGβ(无信号肽及终止密码子)-BamH I和pBS-hCGβ，连接得pBS-signal-6His-hCGβ。HindIII和Not I双酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ，连接得phCMV1-signal-6His-hCGβ。
phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3构建策略(图2)Bgl II和Xba I双酶切pSG5-C3d3，BamH I和Xba I双酶切pBS-signal-6His-hCGβ，连接得PBS-signal-6His-hCGβ-C3d3。Hind III和Not I双酶切phCMV1和pBS-signal-6His-hCGβ-C3d3，连接得phCMV1-signal-6His-hCGβ-C3d3。
实施例2 hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的表达、鉴定与纯化。
重组质粒转染CHO细胞、抗性克隆筛选及无血清培养待六孔板内CHO细胞95％汇合成片时，用Lipofectamine2000分别介导phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、phCMV1、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ转染CHO细胞，质粒和脂质体用量为1μg∶7μg。转染后24小时用含G418(800ug/ml)的完全培养基筛选阳性克隆。每3天换一次液，维持筛选8天，直至抗药性细胞克隆形成。分别挑选10个phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ的阳性克隆，用含G418(300μg/ml)的培养液维持培养、扩增，待阳性克隆95％汇合成片时换用CHO无血清培养基培养。
阳性细胞克隆培养上清中hCGβ含量测定收集培养24、48和72小时的无血清培养上清，5000g，4℃离心5min，取上清-20℃保存，放免法测定hCGβ含量，选取高效表达hCGβ-C3d3融合蛋白的阳性克隆。反复3次冻存和复苏hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表达克隆，间隔时间为1个月，检测95％汇片后无血清培养48h培养上清中hCGβ的含量。
Western blotting鉴定表达产物收集高效表达重组蛋白的阳性克隆培养72h的无血清培养上清，5000g，4℃离心5min，取上清-20℃保存。冻干法浓缩20倍，PBS 4℃透析24小时，其间换PBS三次，弃沉淀，取透析后的上清液做Western blotting。一抗是小鼠抗人hCGβ单抗，二抗为偶联HRP的兔抗小鼠IgG，用DAB底物显色。
Raji细胞免疫化学染色鉴定hCGβ-C3d融合蛋白Raji细胞膜上具有丰富的CD21分子(C3d受体)，把Raji细胞分别与不同的表达产物共孵育，涂片固定后以小鼠抗人hCGβ为一抗，ABC法检测hCGβ，当hCGβ与C3d为融合蛋白时，才能使Raji细胞呈现阳性着色。收集phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1阳性克隆24小时的无血清培养上清，5000g，4℃离心5min。各取150ul分别与Raji细胞37℃孵育1小时，然后涂布在包被有多聚赖氨酸的载玻片上，4％多聚甲醛固定20分钟。一抗为以小鼠抗人hCGβ单抗，用anti-mouse IgG ABC试剂盒检测。
分离、纯化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白hCGβ蛋白采用ProBond 6hisresin在非变性条件下一步法纯化获得。步骤如下收集含hCGβ的无血清培液，5000g，4℃离心5min。冻干法浓缩10倍后PBS 4℃透析24小时，取透析后的上清上柱。按照ProBond 6his resin说明书采用非变性条件进行纯化，最后用含250mM咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，洗脱液用含2mMTris，20mM NaCl，0.1％glycine，and 10nM EDTA的溶液透析去除咪唑和镍离子。根据Western blotting的结果，phCMV1-6His-hCGβ-C3d3的表达产物在用镍柱纯化的基础上，加用Sephadex G150 column进行了凝胶过滤层析以分离出高分子量的hCGβ-C3d3融合蛋白。凝胶过滤层析按照Pharmacia公司提供的操作在4℃进行。用TM缓冲液+0.1mol/L KCl洗涤、膨胀G150胶后均匀、无气泡装柱、压柱，用相同的缓冲液平衡凝胶层析柱后上样，用含0.05M磷酸钠和0.15M氯化钠的溶液(PH7.0)洗脱，流速为19cm/h(0.25ml/min)。分部收集洗脱液，每管500ul，分光光度计A280跟踪洗脱蛋白峰。合并含有128KD的主峰蛋白溶液并用PBS 4℃透析过夜，取透析上清-20℃贮存。
实施例3.动物免疫和免疫效应免疫方法6～8周龄BALB/c小鼠(19～24g)和C57BL/6小鼠(20～25g)，各分为3组，每组5只。分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ和hCGβ加用弗氏佐剂免疫。于右侧背部皮下注射免疫，共免疫两次，间隔4周。免疫剂量分别为50pmol hCGβ-C3d3融合蛋白/100μl PBS，50pmol hCGβ/100μl PBS和50pmolhCGβ/50μl PBS+50μl CFA形成的完全乳剂。其中hCGβ+CFA免疫组再次免疫时换用hCGβ+IFA免疫。
第一次注射后7天开始采血，每周一次，共4次。第二次注射后7天开始采血，每周一次，共3次。于小鼠眼眶后静脉丛采血，每次采血100～150μl，分离出血清20～25μl，-20℃贮存备用。
用间接ELISA法测定。以纯化hCG抗原包被96孔酶标板，每孔0.5μg。封闭后加入系列稀释(指数级稀释)的抗血清37℃孵育1h。PBS洗3次后加入偶联辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗小鼠IgG(H+L)，37℃孵育30min，用H2O2-TMB系统显色。于450nm测定样品OD值。抗血清最高稀释度呈阳性者(样品OD值/PBS阴性对照OD值＞2.0)，其稀释度的倒数即为抗血清效价。
于加强免疫后第3周，分别随机选取3只hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ和hCGβ加用弗氏佐剂免疫的BALB/c小鼠。摘除眼球取血，分离出血清-20℃贮存备用(用于下一步抗血清特性的研究)。其余小鼠继续监测抗体水平至加强免疫后第10周。
实施例4.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗介导免疫动物Th2型优势效应制备脾淋巴细胞悬液hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周脱颈处死，无菌摘取脾脏，用10ml注射器针芯研磨，过400目尼龙网富集单个细胞。1500rpm离心3分钟，去上清，每个脾脏加入5ml红细胞裂解液(ACK)裂解红细胞，PBS清洗细胞两次。用RPMI1640完全培养液重悬细胞，调细胞浓度为1×107/ml。在24孔板中按2×106/50ul/孔加入脾细胞，然后在每孔中加入hCG抗原至终浓度100IU/ml，培养48h后用ELISA法检测培养上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平。
培养上清中IFNγ、IL-2、IL-4和IL-10的测定将50μl培养上清加入到96孔酶标板，室温孵育2h，洗板5次。加入100μlHRP标记的抗小鼠细胞因子抗体，室温孵育2h，洗板5次。每孔加入100μl底物溶液，室温避光孵育30min后加入100μl终止液终止反应，于450nm波长测OD值。
实施例5.hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潜能分析抗血清制备hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫的BALB/c小鼠于末次免疫后3周摘除眼球取血，分离出血清-20℃贮存备用。抗血清使用前先经0.22μm滤膜过滤除菌。
hCGβ-C3d3免疫鼠血清拮抗hCG刺激MLTC-1细胞分泌孕酮的作用MLTC-1是一个小鼠睾丸间质Leydig肿瘤细胞系，其表面有hCG的受体，此受体结构与正常小鼠的Leydig细胞一致。在hCG作用下，MLTC-1细胞能分泌孕酮。为了检测hCGβ-C3d3融合蛋白免疫BALB/c小鼠产生的抗血清是否具有中和hCG生物学活性的能力，在12孔板内每孔传入1×105MLTC-1细胞，用1ml含10％小牛血清的RPMI1640培养。同时加入10IU hCG和100μl的正常鼠血清、hCGβ-C3d3抗血清、hCGβ抗血清和hCGβ+CFA/IFA抗血清共培养，7小时后取培养上清检测孕酮含量。
hCGβ-C3d3免疫鼠血清对hCG诱导小鼠子宫增重的抑制效应3周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为3个大组，每大组内小鼠再随机分为7个小组，每小组5只。均给予皮下注射hCG 4IU，同时腹腔内分别注射系列稀释的正常鼠血清、hCGβ-C3d3免疫鼠血清、hCGβ免疫鼠血清和hCGβ+CFA/IFA免疫鼠血清，注射剂量为100μl。每天注射两次，间隔8h，连续注射3d，第4d上午脱颈法处死小鼠，取子宫称湿重，计算每克体重的子宫湿重(mg/g)。
本发明结果显示无论是BALB/c小鼠还是C57BL/6小鼠，hCGβ-C3d3融合蛋白诱导产生抗hCGβ抗体的出现时间都明显早于hCGβ+CFA/IFA免疫和hCGβ单独免疫组。在BALB/c小鼠，初次和再次免疫结果显示，C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1995倍。与hCGβ-C3d3基因疫苗相比，hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的免疫原性有了明显的提高。C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1259倍。表明在个体差异很大的不同品系小鼠，C3d3均能增强机体对hCGβ的体液免疫应答能力。为解决hCGβ避孕疫苗免疫效果在个体之间的差异提供了理论依据。
检测受试鼠脾细胞在体外hCG抗原再次刺激下分泌Th1型(IFNγ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)细胞因子结果表明，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫鼠脾细胞IL-4和IL-10分泌水平明显高于hCGβ免疫鼠，以IL-4最明显。从IL-4与IFNγ的比值分析，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫动物显示出明显的Th2型优势效应。表明分子佐剂C3d3是通过诱导Th2型细胞因子优势表达来实现其增强hCGβ蛋白抗原体液免疫效力。
本发明结果还显示，hCGβ-C3d3融合蛋白免疫鼠血清具有很强的中和hCG生物学活性的作用，能明显抑制hCG刺激MLTC-1细胞分泌孕酮的作用，也能有效拮抗hCG诱导的小鼠子宫增重作用。表明hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗具有较强的抗生育潜能。
本发明结果显示，对于hCGβ抗原而言，C3d3的佐剂能力强于弗氏佐剂。加之C3d是体内补体C3自身的一个裂解产物，克服了弗氏佐剂中的石蜡油对机体有毒性，和引起注射部位局部组织的溃烂和坏死的危险，是完全适合人类应用的新型分子佐剂。
权利要求
1.一种携分子佐剂的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于将分子佐剂C3d3与hCGβ通过基因克隆构建入真核表达质粒pCMV1制成，包括下述步骤1)构建分泌型真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ，2)表达、鉴定与纯化hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白，3)检测hCGβ-C3d3融合蛋白免疫小鼠的体液免疫效应及抗血清特性。
2.根据权利要求1所述的携分子佐剂的融合蛋白避孕疫苗，其特征在于所述的融合蛋白在氨基端加上6个组氨酸纯化标签。
全文摘要
本发明属生物制药领域，涉及一种与分子佐剂交联的避孕疫苗，具体涉及一种与分子佐剂C3d3交联的hCGβ－C3d3融合蛋白避孕疫苗。本发明选用真核表达载体phCMV1，分别构建带有6个组氨酸纯化标签的hCGβ－C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表达质粒phCMV1－6His－hCGβ－C3d3和phCMV1－6His－hCGβ。在体外表达、鉴定、纯化出hCGβ－C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白。分别加用弗氏佐剂免疫不同品系小鼠。经检测抗体水平、抗血清中和hCG生物学活性的能力和脾细胞分泌细胞因子的水平，证实hCGβ－C3d3融合蛋白疫苗具有较强的抗生育潜能作用。
文档编号A61K39/39GK1569227SQ20041001803
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月29日 优先权日2004年4月29日
发明者李大金, 王秀丽 申请人:复旦大学附属妇产科医院