一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗，其特征在于：含鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-OmpA，质粒浓度为2mg~5mg/mL，该真核表达质粒含有鸭疫里默氏杆菌OmpA的全基因编码序列，该基因的长度为1164个核苷酸，类型为核苷酸，全长为编码区。本发明鸭疫里默氏杆菌疫苗安全有效，可诱导鸭机体产生特异性的体液免疫应答，能有效预防鸭疫里默氏杆菌的发生与流行。
【专利说明】—种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]鸭疫里默氏杆菌iRiemerella anatipestifer, RA)引起的鸭病称为鸭传染性衆膜炎{infectious serositis),是感染鸭、鹅等多种禽类的一种急性或慢性接触性性传染病，鹅感染后曾被称为鹅流感或鹅渗出性败血症，具有较高的发病率和死亡率。鸭疫里默氏杆菌病在我国普遍流行，几乎遍布了所有养鸭地区，给养鸭业的发展造成了极大的损失，特别是对西部地区蓬勃兴起的养鸭业带来了严峻的威胁。[0003]目前，我国对鸭疫里默氏杆菌病的控制主要采取药物为主，因其具有多种血清型，而各种不同血清之间无交叉保护性，故全国没有的统一的灭活疫苗，针对地区研发出的各种疫苗也只能对相应的地区有局部有效果，都存在一定的不足，灭活疫苗免疫效果不佳，需用剂量较大，只能提供短暂保护。而DNA疫苗又称裸疫苗，是继灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗之后的第三代疫苗，目前已用于HIV、流感病毒、恶性疟原虫等多种病原体感染性疾病的防控，并取得了积极的进展。
[0004]据研究资料显示，鸭疫里默氏杆菌病毒OmpA基因所编码的OmpA蛋白是目前各地区各血清特异性强的结构蛋白，具有较强的抗原性，能诱导鸭细胞免疫和体液免疫应答反应，产生特异性中和抗体和各种细胞因子，在鸭疫里默氏杆菌病的预防与控制上发挥重要作用。关于基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗少见报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于，提供一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗及制备方法，该疫苗能诱导鸭产生良好的体液免疫应答，且不引起鸭产生不良反应，具有良好的生物安全性。
[0006]本发明的技术内容:
一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗，含鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的真核表达质粒pcDNA3.1 (+)-OmpA,质粒浓度为2mg~5mg/mL,该真核表达质粒含有鸭疫里默氏杆菌OmpA的全基因编码序列，该基因的长度为1164个核苷酸，类型为核苷酸，全长为编码区。
[0007]一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤:
第一，培养鸭疫里默氏杆菌贵州三穗分离株，采用DNA提取试剂盒或煮沸法提取细菌DNA，进行PCR目的基因扩增；
第二，将获得的目的基因片段连接于PMD-18T载体，构建pMD-18T-0mpA，再转入大肠杆菌DH5 α中；
第三，采用PCR方法从pMD-18T-0mpA扩增出OmpA基因，用Η--/ΙΙΙ+ Ba?H I进行酶切，同法处理真核表达载体PCDNA3.1(+)，然后电泳分离和分别回收目的基因；
第四，采用T4 DNA连接酶将鸭疫里默氏杆OmpA基因插入真核表达质粒pcDNA3.1 (+)中，转化大肠杆菌DH5a ,蓝白斑筛选,挑取可疑菌落于LB液体培养基于36°C~38°C培养12~18h，收集菌液采用DNA提取试剂盒提取质粒，用PCR和双酶切进行鉴定；
第五，取鉴定为阳性重组质粒的大肠杆菌DH5 a，于LB液体培养基36°C~38°C培养12~18h后，采用大剂量质粒提取试剂盒提取得到pcDNA3.1 (+)-OmpA,即为基于鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗。
[0008]本发明有益效果:本发明方法适用于鸭的免疫接种，防制鸭疫里默氏杆菌病的发生与流行，同时具有良好的经济效益和生态效益。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果:
(I)免疫效果良好:本发明所采用真核表达载体PCDNA3.1(+)构建的鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗，肌肉注射动物后能诱导鸭产生良好的体液免疫应答，且真核表达质粒不易降解，性能稳定，免疫效果持续时间长。
[0009](2)制备成本较低:本发明的DNA疫苗在需要时，只需将含重组质粒pcDNA3.1(+)-011^^的大肠杆菌0册0进行大量培养后，提取重组质粒pcDNA3.l(+)_0mpA即可。
[0010](3)免疫接种方便:本发明的DNA疫苗采用肌肉注射进行接种，操作方便，不像其他灭活疫苗要求皮内或皮下注射。
[0011](4)安全无副作用:本发明的DNA疫苗不会引起毒力增强或导致基因整合，也不会引起鸭发生其他症状。 【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明的鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗的制备流程图。
【具体实施方式】
[0013]本发明的实施例:本发明的鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗的主要原料是由含鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆质粒pMD-18T-0mpA、真核表达载体pcDNA3.1 (+)和大肠杆菌DH5a构成。
[0014]如图1所示意，本发明的鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤: 第一，培养鸭疫里默氏杆菌贵州分离株，采用DNA提取试剂盒或煮沸法提取细菌DNA，
进行PCR目的基因扩增；
第二，将获得的目的基因片段连接于PMD-18T载体，构建pMD-18T-0mpA，再转入大肠杆菌DH5 α中；
第三，采用PCR方法从克隆质粒pMD-18T-0mpA中扩增出鸭疫里默氏杆菌OmpA基因，以核酸内切酶Η//--/III和Ba?H I进行双酶切，同时以相同的酶处理真核表达载体pcDNA3.1 (+)，然后分别进行电泳分离和回收。
[0015]第四，采用T4 DNA连接酶将OmpA基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组真核表达载体pcDNA3.1 (+) -OmpA,转化大肠杆菌DH5a，经蓝白斑筛选后，挑取可疑菌落于LB液体培养基于36°C~38°C培养12~18h，收集菌液采用DNA提取试剂盒提取质粒进行PCR和双酶切鉴定。
[0016]第五，取含鉴定为重组真核表达载体pcDNA3.1 (+) -OmpA的大肠杆菌DH5a,于LB液体培养基36 °C~38°C培养12~18h后，采用大剂量质粒提取试剂盒提取得到pcDNA3.1 (+) -OmpA,调整其浓度为2mg/mL，即为基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗。
[0017]第六，疫苗效果试验:取第五步获得的真核表达质粒，按每只鸭0.2mg的剂量腿部肌肉注射，分别在第6日龄首免和第20日龄二次免疫，于第16d、30 d、40d、50d和60d时抽血检测，同时在30日龄进行攻毒免疫保护试验，试验组的鸭疫里默氏杆菌抗体滴度达1:800，远远高于空白对照组的1:50 ;试验组的攻毒免疫保护率较高。
[0018]第七，疫苗的安全性检测:取第五步获得的真核表达质粒，按照0.1mg的剂量注射小鼠共12只，观察两周内小白鼠的临床表现，并每隔2天时间剖杀，观察内脏组织病变情况，小白鼠未表现明显的临床症状和病理变化，且未发生死亡，说明所制备的疫苗具有良好的安全性。
[0019]通过以上第一至第七步证实，发明的基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗获得成功。
【权利要求】
1.一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗，其特征在于:含鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的真核表达质粒pcDNA3.1 (+) -OmpA,质粒浓度为2mg~5mg/mL，该真核表达质粒含有鸭疫里默氏杆菌OmpA的全基因编码序列，该基因的长度为1164个核苷酸，类型为核苷酸，全长为编码区。
2.一种如权利要求1所述的一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 第一，培养鸭疫里默氏杆菌贵州三穗分离株，采用DNA提取试剂盒或煮沸法提取细菌DNA，进行PCR目的基因扩增； 第二，将获得的目的基因片段连接于PMD-18T载体，构建pMD-18T-0mpA，再转入大肠杆菌DH5 α中； 第三，采用PCR方法从pMD-18T-0mpA扩增出OmpA基因，用Η--/ΙΙΙ+ Ba?H I进行酶切，同法处理真核表达载体PCDNA3.1(+)，然后电泳分离和分别回收目的基因； 第四，采用T4 DNA连接酶将鸭疫里默氏杆OmpA基因插入真核表达质粒pcDNA3.1 (+)中，转化大肠杆菌DH5a ,蓝白斑筛选,挑取可疑菌落于LB液体培养基于36°C~38°C培养12^18h,收集菌液采用DNA提取试剂盒提取质粒，用PCR和双酶切进行鉴定； 第五，取鉴定为阳性重组质粒的大肠杆菌DH5 a，于LB液体培养基36°C~38°C培养12~18h后，采用大剂量质粒提取试剂盒提取得到pcDNA3.1 (+)-OmpA,即为基于鸭疫里默氏杆菌DN A疫苗。
【文档编号】C12N15/79GK103830746SQ201410098187
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】嵇辛勤, 傅心亮, 文明, 阮涌 申请人:贵州大学