鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白、其抗体及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组 蛋白、其抗体及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA)所致鸭疫里默氏菌病 (Riemerella anatipestifer infection)是家鸭、火鸡和多种其它鸟类的一种接触传染性 疾病，也称为新鸭病（(New duck syndrome)、鸭败血症（Duck septicaemia)、鸭疫综合症 (Anatipestfer syndrome)、鸭疫败血症（Anatipestifer septicaemia)、鸭疫巴氏杆菌病 (Pasteurella anatipestifer infection)和鸭传染性衆膜炎（Infectious serositis) 〇 它是鸭的一种常见的细菌性传染病，主要侵害2- 8周龄雏鸭，以纤维素性心包炎、肝周炎、 气囊炎为主要的病理特征。
[0003] 引起鸭疫里默氏菌病的病原为鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA)。 此菌为革兰氏阴性小杆菌，无芽胞，菌体无菌毛或鞭毛，不能运动，有荚膜，瑞氏染色呈两极 浓染。纯培养菌涂片，美蓝染色，可见菌体多为杆状，常单个存在，少数成双排列，偶见个别 菌体呈长丝状排列。RA的血清型多而复杂，血清型超过21个，且各血清型之间缺乏有效的 交叉免疫保护，这给RA的疫苗防治带来一定困难。比较有效的方法是针对当地主要流行血 清型，选取相应菌株研制疫苗，以达到更有效的预防效果。
[0004] 细菌外膜蛋白（OMP)是革兰氏阴性菌特有的，是存在于外膜之中及与外膜有关的 所有蛋白的总称。外膜在细菌胞浆膜（内膜）和肽聚糖层的外侧，包围整个细菌，是革兰氏 阴性菌细胞壁成分中所特有的结构。外膜蛋白由6个家族组成：包括OmpA蛋白、OmpX蛋白、 水解磷脂酶A、普通膜孔蛋白（OmpF，PhoE)、底物特异性膜孔蛋白（LamB，ScrY)以及金属依 赖性铁运输蛋白FhuA和F印A蛋白，共有20余种，但多数功能尚不清楚。外膜蛋白A (Outer Membrane Protein A，0mpA)是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白，OmpA与细菌的生物膜形成有 关，可维持外I旲的完整，缺少OmpA的细菌，细胞I旲不稳定。OmpA是一种跨I旲蛋白，有研宄表 明，该蛋白除了具有维持外膜结构的作用外，其重要作用是在细菌感染早期与细胞基质相 互作用，定植于宿主细胞，从而达到吸附作用。据报道，OmpA是RA的一种毒力因子，具有致 病作用，因此，在鸭疫里默氏菌病的诊断和疫苗研制上可能具有重要价值。此外，OmpA基因 核酸序列高度保守，有着良好的免疫原性，能够激发机体的体液免疫和细胞免疫，并可通过 遗传工程技术得到大量表达。对于异种血清型，OmpA可起到免疫交叉保护的作用，是一种 潜在的共同保护性抗原，它是被公认的RA高保护性抗原。再者，OmpA有助于RA逃逸机体 的免疫防御。
[0005] Thrombospondin是指凝血酶敏感蛋白，又称血小板反应蛋白。其基因家族分为 两个亚科，亚科A和亚科B。亚群A的蛋白质包括TSP-I和TSP-2,被组装成三聚体，包含 有1、2、3型重复；亚群B的蛋白质，是指TSP-3、TSP-4与C0MP(TSP-5)，它们的特征是包 括独特的N端区域，缺乏原骨胶原同源区域和1型重复，含有四个版本的2型重复，被组 装成五聚化物。3型重复（Thrombospondin type 3repeats)的作用在于细胞黏附（cell attachment)、传播（spreading)和抑制蛋白酶（protease inhibition)。Thrombospondin type 3repeat: OmpA/MotB可能涉及病原体同宿主细胞之间的相互作用，与病原体吸附宿主 细胞有关，是OmpA家族的其他成员。MotB是细菌的一种鞭毛马达蛋白，与细菌的运动有关。 但是鸭疫里默氏菌没有鞭毛，可以推测MotB与OmpA可能具有同源性，存在相似功能。有文 献指出，OmpA相关蛋白与MotB蛋白C端的保守序列在革兰氏阴性菌与阳性菌中有一个共同 的功能：可能与肽聚糖相互作用有关（The C-terminal sequence conservation between OmpA-related outer membrane proteins and MotB suggests a common function in both gram-positive and gram-negative bacteria, possibly in the interaction of these domains with peptidoglycan, Molecular microbiology, 1994, 12(2):333)〇
[0006] 由于国内外关于鸭疫里默氏菌凝血酶敏感III型重复蛋白（Thrombospondin type 3repeats) :0mpA/MotB基因及其蛋白的研宄未见报道，因此，对Thrombospondin type 3 repeats :0mpA/MotB基因及其蛋白的研宄有助于为RA的防控开辟新的思路。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白， 其具有与天然OmpA/MotB蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合；本发明同 时还提供了上述重组蛋白的抗体及制备方法和应用。
[0008] 本发明通过下述技术方案达到所述目的：
[0009] 1、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 2、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白的编码基因。
[0011] 优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 3、含有上述编码基因的重组表达载体。
[0013] 优选的，是将核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的OmpA/MotB截短重组蛋白编码基 因克隆入原核表达质粒pET-32 (a)+中而得到。
[0014] 4、上述重组表达载体的工程菌。
[0015] 优选的，是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21 (DE3)中而得到；所述重组表达载 体为将核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的OmpA/MotB截短重组蛋白编码基因克隆入原核表 达质粒pET-32 (a) +中而得到。
[0016] 5、上述工程菌制备鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白的方法，包括如下步 骤：
[0017] 取工程菌接种于含Amp的LB培养基中，以150-200r/min、37°C培养12h或至OD 6tltlmi为0. 6,然后按体积比为1:100的比例加入到含Amp的LB培养液中37°C继续培养至OD6tltol达0. 6后，于I. 2mmol/L IPTG、37°C条件下诱导12h ;收集菌液，离心，菌体沉淀用1/10菌液 体积的20mmol/L、pH 8. 0的Tris-HCl悬浮，冰水浴超声裂解菌体，而后12000r/min离心 l〇min，沉淀用1/50原菌液体积的8mol/L尿素溶液溶解，8000r/min离心10min，取溶解液， 采用Ni-NTA亲和层析进行纯化，将收集的纯化蛋白液进行梯度透析、超滤及浓缩即得。
[0018] 6、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白为抗原免疫动物得到的多克隆抗体。
[0019] 7、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白在制备鸭疫里默氏菌基因工程亚单位 疫苗或抗体检测试剂中的应用。
[0020] 本发明的有益效果在于：本发明选取RA OmpA/MotB基因的主要抗原表位蛋白区 域，利用原核表达系统成功制得了截短OmpA/MotB重组蛋白。该重组蛋白具有与天然OmpA/ MotB蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合，而与鸭沙门氏菌阳性血清、鸭 大肠杆菌阳性血清、鸭肿头败血症病毒阳性血清、禽流感病毒（H5)阳性血清、鸭瘟病毒阳 性血清、鸭肝炎病毒阳性血清等不产生交叉反应，可作为检测RA全菌抗体的检测抗原应 用，且由于该重组蛋白非全细菌，应用其进行检测时无散毒危险；此外，该重组蛋白的制备 方法简单，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比 较。
【附图说明】
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0022] 图I OmpA/MotB基因主要抗原表位区PCR产物电泳。M泳道：DL5000 Marker，1泳 道：OmpA/MotB基因主要抗原表位区PCR扩增产物。
[0023] 图2 OmpA/MotB主要抗原表位区重组质粒构建及其PCR与酶切鉴定。图中A图 为pMD19-T/0mpA/MotB主要抗原表位区质粒PCR鉴定，M泳道：DL5000 Marker，1泳道： PCR产物；图中B图为pMD19-T/0mpA/MotB主要抗原表位区质粒酶切鉴定，M泳道：DL15000 Marker，1泳道：BamH I/Xho I双酶切条带；图中C图为pET-32 (a)+/OmpA/MotB主要抗原表 位区质粒的PCR鉴定，M泳道：DL2000 Marker，1泳道：PCR产物；图中D图为pET-32 (a)+/ OmpA/MotB主要抗原表位区质粒的酶切鉴定，M泳道：DL15000 Marker ; 1泳道：BamH I/Xho I双酶切条带。
[0024] 图3 OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白的表达分析及表达条件的优化。M泳道为低 分子量蛋白质标准品。图中A图为重组蛋白表达形式的分析，泳道1为pET-32