检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏杆菌可引起家鸭、鶴、火鸡及多种家 禽和野禽发病，导致的鸭的疾病称为鸭传染性衆膜炎（duckinfectiousserositis)。本 菌易感染1~8周龄的鸭，尤其是2~3周龄的小鸭，一周龄以下或8周龄以上的鸭极少发 病。本病的感染率有时可达90%以上，死亡率从5%至75%不等。目前鸭传染性浆膜炎在我 国各养鸭省区均有发生，且发病率和死亡率很高，是危害养鸭业的重要细菌病之一，给养鸭 业造成重大经济损失。
[0003] 鸭疫里默氏杆菌血清型众多，目前报道确认的有21个血清型，我国目前至少存在 13个血清型（1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14和15型)，其中1、2和10型是流行的优势血 清型。各血清型菌株间缺乏有效的交叉免疫保护，给疫苗预防带来了很大难度。
[0004] 鸭疫里默氏杆菌感染在临床症状和剖检病变方面与大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏 菌感染有相似的地方，容易引起误诊，应用分子生物学方法确诊该病至关重要。目前报道 的检测鸭疫里默氏杆菌的方法有细菌分离培养、玻板凝集试验、试管凝集试验、琼脂扩散试 验、荧光抗体技术、间接免疫酶组织化学法、聚合酶链反应（PCR)等。PCR方法简便、快速、特 异性和敏感性好，在临床诊断中得到广泛的推广应用。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物及相应的PCR检测试剂盒。 本发明的试剂盒能够大批量检测临床样本，并且耗时短，成本低，操作简单方便。
[0006] 本发明提供一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序 列为： 上游引物ompA-F:5' -actcaaggaagagcggatca_3' 下游引物 〇mpA_R:5' -gcttcagcagaaccaactcc_3'〇
[0007] 上游引物ompA-F和下游引物ompA-R均位于鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(ompA) 基因上。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒 包括特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为： 上游引物ompA-F:5' -actcaaggaagagcggatca_3' 下游引物 〇mpA_R:5' -gcttcagcagaaccaactcc_3'〇
[0009] 优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0010] 进一步地，所述阳性对照为含有鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(ompA)基因的部分核 苷酸序列的重组质粒，该部分核苷酸序列的长度为809bp，具体序列参见序列表中SEQID No. 3〇
[0011] 本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，是以待测DNA为模板，利用 权利要求2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp的DNA片 段，判为阳性；反之，判为阴性。
[0012] 优选地，所述PCR反应条件为：94°C5min，35 个循环（94°C30s，60°C30s，72°C 40s)，最后 72°C5min。
[0013] 本发明的第四个目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌的检测方法，是以待测DNA为模 板，利用权利要求2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp 的DNA片段，则检测到鸭疫里默氏杆菌。
[0014]优选地，所述PCR反应条件为：94°C5min，35 个循环（94°C30s，60°C30s，72°C 40s)，最后 72°C5min。
[0015] 本发明的第五个目的是提供上述特异性引物、试剂盒、序列表中SEQIDNo. 3所述 的核苷酸序列在制备检测鸭疫里默氏杆菌的试剂中的应用。
[0016] 本发明的试剂盒的优越性包括以下方面： a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用，本发 明中的试剂盒在检测样品时只需要移液器、移液器枪头、PCR仪以及台式离心机，普通实验 室均可使用本试剂盒检测样本。
[0017]b.结果判定直观，电泳后眼观即可。
[0018]c.操作人员不必接受专业培训，只参照说明书就可进行检测。
[0019]d.成本低廉，经济实惠，大多使用者均可接受。
[0020] 本发明提供了一种从临床样本或纯培养菌中检测鸭疫里默氏杆菌核酸的PCR方 法，该方法不受鸭疫里默氏杆菌血清型的限制，能够检测各种血清型的鸭疫里默氏杆菌，具 有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0021] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本发明试剂盒的特异性检测实验结果；其中，泳道M为DL2000分子量标准；泳道 1-5为鸭疫里默氏杆菌；泳道6-7为大肠杆菌；泳道8-9为沙门氏菌；泳道10-11为巴氏杆 菌。
[0022] 图2为本发明试剂盒的敏感性检测实验结果；其中，泳道M为DL2000分子量标准； 泳道 1-7 的DNA模板量分别为 10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0024] 实施例1 本发明的一种鸭疫里默氏杆菌PCR检测试剂盒包括： 1. 2XPCRTaqMix5 支（250yl/支）； 2?上游引物ompA-F1支（50yl/支）； 3?下游引物ompA-R1支（50yl/支）； 4?阳性对照DNA1支（250yl/支） 5. 阴性对照DNA1支（250y1/支）； 6. 灭菌去离子水1支（1000yl/支)。
[0025] 上述试剂盒可检测50份样本，-20°C冻存，保存期为1年。
[0026] 其中，2XPCRTaqMix由市场购买； 上游引物〇mpA-F的序列为： 5? -actcaaggaagagcggatca~3,, 下游引物〇mpA-R的序列为： 5' -gcttcagcagaaccaactcc-3'。该引物序列可由人工合成。
[0027] 阳性对照DNA:以鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA为模板，以本发明中涉及的ompA-F 和ompA-R为引物，扩增目的片段。扩增程序为：94°C5min，35个循环（94°C30s，60°C30s， 72°C40s)，最后72°C5min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用商品化试剂盒回收、纯化 目的DNA片段，与pMD19-T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，涂布含80yg/ml氨苄青 霉素的营养肉汤琼脂平板，过夜培养后挑取单克隆菌株，接种到含80yg/ml氨苄青霉素的 5ml营养肉汤内，37°C，200rpm，培养至对数生长期，经测序鉴定正确的菌株为阳性菌株。用 细菌DNA提取试剂盒提取阳性菌株中的重组质粒pMD-ompA，作为阳性对照； 阴性对照DNA:多杀性巴氏杆菌CVCC386购买于中国兽医药品监察所。取甘油冻存的CVCC386菌株5y1，接种到5ml营养肉汤内，37°C，200rpm，培养至对数生长期，用细菌DNA 提取试剂盒提取其基因组DNA，作为阴性对照； 灭菌去离子水：去离子水121°C高压灭菌30min。
[0028] 实施例2 本发明的鸭疫里默氏杆菌PCR检测试剂盒的使用方法为： 1.从纯细菌培养物、病死鸭的脑组织、心血、肝脏、脾脏、肺脏等病料中提取总DNA。DNA的提取可使用商品化试剂盒。
[0029] 2.将试剂盒中的2XPCRTaqMix、上游引物ompA-F、下游引物ompA-R、灭菌去离 子水和提取的DNA模板配制成PCR反应液，总体系50y1。同时用试剂盒中的阳性对照DNA 作为模板，扩增阳性对照；用试剂盒中的阴性对照DNA作为模板，扩增阴性对照。PCR反应 液的具体配制方法如表1 :