表1
3.将上述配制好的PCR反应液置于PCR仪中，扩增目的片段，扩增程序如下： 94°C5min，35 个循环（94°C30s，60°C30s，72°C40s)，最后 72°C5min。
[0030] 4.电泳观察：取扩增产物各5y1，5y1/泳道DL2000分子量标准，以1%琼脂糖凝 胶120V电压下电泳30min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。扩增目的片段大小为809bp。
[0031] 5.结果判定：阳性对照扩增到目的片段，阴性对照无目的片段时试验成立。若样 品中扩增到约809bp的DNA片段，判为阳性；若无约809bp的DNA片段，判为阴性。
[0032] 将扩增产物进行测序，其核苷酸序列为鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(ompA)基因的 部分核苷酸序列，长度为809bp。测序得到的核苷酸序列如下：ACTCAAGGAAGAGCGGATCATTTT GCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTGGTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTC TACTCCAGTAGATAAGTCTAGATTGGCTAACTTTTGGCAAGCGTCAGCTTCATTGAACTTTAGATTTGGTAACAGAG ATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGATTTATGTTCAGAAACACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGT CCAGATACAGATGGTGACGGTGTTCCAGATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTAGCAGGACCAGTAGAAAACAATGG TTGCCCTTGGCCAGATACAGACAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCAGGACCAGCTG AAAATAACGGTTGCCCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCCA GGTCTTCCAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTAT ATTCTTTAACTTTAATAAAGCATCTATCAGATCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTGATTAAGT CTTCTAACGGAGGTACTTTCTTAGTAGTTGGTCATACAGATGTTAAAGGTAATGCTAACTATAACTTGAAACTTTCT AGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGTGTTAACCCATCTCAGTTAAAATCTAAAGGAGT TGGTTCTGCTGAAGC 实施例3 本发明试剂盒的特异性检测 用细菌DNA提取试剂盒提取分离自鸭的20株大肠杆菌、20株沙门氏菌、15株巴氏杆 菌、35株鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA，以这些DNA样本作为模板，用本发明中的试剂盒进 行PCR检测。结果表明，大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌均为阴性，鸭疫里默氏杆菌均为阳 性，表明试剂盒特异性良好。
[0033] 实施例4 本发明试剂盒的敏感性检测 提取鸭疫里默氏杆菌RA-⑶菌株的基因组DNA，分光光度计方法测定其DNA初始浓度为282ng/ y 1，调整其浓度至10ng/ y 1，然后依次稀释10倍，共得到7个浓度的DNA模板，其 浓度梯度分别为l〇ng/ y l、lng/ y l、100pg/ y l、10pg/ y l、lpg/ y l、100fg/ y l、10fg/ y 1。 每个浓度的DNA各取1y1作模板，分别用本发明涉及的试剂盒进行PCR扩增。检测结果表 明，本发明中的试剂盒检测限量为l〇〇pg，说明敏感性良好。
[0034] 实施例5 从规模化鸭场采集到疑是鸭疫里默氏杆菌感染的鸭头129个，无菌取适量脑组织，用 通用型基因组DNA提取试剂盒从脑组织中提取总DNA，每份DNA样本取5y1作为模板，用本 发明涉及的试剂盒分别进行检测。同时，将脑组织涂布在含8%绵羊血的巧克力平板上，置 于37°C，含5%二氧化碳的培养箱内培养24h，进行细菌分离。两种方法的检测结果为：细菌 分离方法中阳性的样本有93份，阴性的有36份。用本发明的试剂盒进行检测，上述93份 阳性的样本全部为阳性；36个阴性样本中有19份为阳性，17份为阴性。两种方法的符合率 为 93+17/129 = 85. 27%。
[0035] 有19份样本用两种方法检测得到了不同的结果，我们对这19份样本再次进行细 菌分离，挑取了大量的单克隆菌株进行鉴定，最终分离到了鸭疫里默氏杆菌，并同时分离到 较多的大肠杆菌和沙门氏菌，这说明鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌或沙门氏菌在鸭群中的混 合感染是普遍存在的。试验结果证实，本发明的PCR方法比细菌分离方法敏感。
[0036]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序 列为： 上游引物 ompA-F :5' - actcaaggaagagcggatca _3' 下游引物 〇mpA_R:5' - gcttcagcagaaccaactcc _3'〇2. -种鸭疫里默氏杆菌的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性引物， 所述特异性引物的核苷酸序列为： 上游引物 ompA-F :5' - actcaaggaagagcggatca _3' 下游引物 〇mpA_R:5' - gcttcagcagaaccaactcc _3'〇3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对 照。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有鸭疫里默氏杆菌 外膜蛋白A基因的部分核苷酸序列的重组质粒，该部分核苷酸序列的长度为809bp，具体序 列参见序列表中SEQ ID No. 3。5. 权利要求2-4任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：是以待测DNA为模板，利 用权利要求2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp的DNA 片段，判为阳性；反之，判为阴性。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：94°C 5min，35个循 环（94°C 30s，60°C 30s，72°C 40s)，最后 72°C 5min。7. -种鸭疫里默氏杆菌的检测方法，其特征在于：是以待测DNA为模板，利用权利要求 2所述的特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳，若扩增到约809bp的DNA片段，则检测 到鸭疫里默氏杆菌。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：94°C 5min，35个循 环（94°C 30s，60°C 30s，72°C 40s)，最后 72°C 5min。9. 权利要求1所述的特异性引物、权利要求2-4任一所述的试剂盒、序列表中SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列在制备检测鸭疫里默氏杆菌的试剂中的应用。
【专利摘要】本发明提供一对检测鸭疫里默氏杆菌的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：上游引物ompA-F：5’-actcaaggaagagcggatca-3’；下游引物ompA-R：5’-gcttcagcagaaccaactcc-3’。本发明还提供包含有上述引物的PCR检测试剂盒。本发明的试剂盒操作简单方便，特异性和敏感性高；结果判定直观，电泳后眼观即可。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/04
【公开号】CN104962558
【申请号】CN201510388709
【发明人】郑福英, 刘永生, 陈启伟, 宫晓炜
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月6日